能穩(wěn)定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種能穩(wěn)定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，用獲得的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，可在制備豬肺炎支原體感染檢測(cè)試劑方面得到廣泛的應(yīng)用。采用本發(fā)明的方法所制備的單克隆抗體特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，所制備的試劑盒具有靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，很快可以報(bào)結(jié)果，無(wú)需任何附加設(shè)備可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，采樣無(wú)需抽血，不會(huì)給動(dòng)物造成損害，有助于對(duì)豬肺炎支原體感染進(jìn)行精準(zhǔn)的早期診斷以及及時(shí)有效的防治。
【專利說(shuō)明】能穩(wěn)定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的涉及一種能夠能穩(wěn)定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及制備單克隆抗體的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]越來(lái)越多的研究表明，豬肺炎支原體是引起豬呼吸道疾病的重要病原體之一，世界范圍內(nèi)大部分養(yǎng)殖豬都易感染豬肺炎支原體，而且任何年齡段的豬都會(huì)被侵害；據(jù)報(bào)道，美國(guó)養(yǎng)殖豬感染率為99%，英國(guó)養(yǎng)殖豬感染率為70%，法國(guó)養(yǎng)殖豬感染率為60%，比利時(shí)、加拿大養(yǎng)殖豬感染率為80%，德國(guó)、荷蘭養(yǎng)殖豬感染率為50%，全世界范圍平均養(yǎng)殖豬感染率為50%~80%。豬肺炎支原體病的典型癥狀是病豬咳嗽、呼吸困難、喘氣，故有人稱之為喘氣??；該病發(fā)病率高，死亡率低，患病豬食欲不振、發(fā)育不良、生長(zhǎng)緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率低。更為嚴(yán)重的是豬患了該病之后，很容易繼發(fā)感染其他細(xì)菌和病毒病，使病程延長(zhǎng)、病情加重，甚至死亡,經(jīng)濟(jì)損失加劇。
[0003]對(duì)該病的診斷迄今仍主要根據(jù)流行病學(xué)分析、臨床癥狀觀察、病理解剖觀察分析來(lái)進(jìn)行初步診斷。迄今未見(jiàn)先進(jìn)的檢測(cè)方法，如免疫檢測(cè)方法，基因檢測(cè)方法商品化的試劑盒應(yīng)用于該病檢測(cè)診斷也未見(jiàn)相關(guān)的專利報(bào)道。
[0004]對(duì)該病的預(yù)防迄今主要采取疫苗接種，除了接種豬肺炎支原體疫苗外，還要做好其他疾病的免疫接種工作，有計(jì)劃地做好豬瘟、偽狂犬病、細(xì)小病病毒、乙型腦炎、傳染性胸膜肺炎、豬丹毒、仔豬副傷寒等免疫接種工作，確保豬群良好的免疫狀態(tài)。在治療方面，目前主要采用化學(xué)藥物抗生素治療，如用泰樂(lè)菌素、四環(huán)素、土霉素、卡那霉素、金霉素及喹諾酮類等。至今未見(jiàn)采用無(wú)毒、無(wú)副作用的生物藥物，如卵黃抗體及特異性轉(zhuǎn)移因子應(yīng)用于對(duì)豬肺炎支原體進(jìn)行防治的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]為了克服我國(guó)對(duì)豬肺炎支原體病相對(duì)落后的診斷及防治方法，本發(fā)明的目的是制備豬肺炎支原體病單克隆抗體，并用其建立豬肺炎支原體病ELISA免疫檢測(cè)試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案:
[0006]本發(fā)明一方面涉及能穩(wěn)定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其在制備單克隆抗體中的應(yīng)用，所述的雜交瘤細(xì)胞株是保藏編號(hào)為CGMCC N0.8011的雜交瘤細(xì)胞株或其直接傳代物。
[0007]采用本發(fā)明的方法所制備的單克隆抗體特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，所制備的試劑盒具有靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便，很快可以報(bào)結(jié)果，無(wú)需任何附加設(shè)備可在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，采樣無(wú)需抽血，不會(huì)給動(dòng)物 造成損害，有助于對(duì)豬肺炎支原體感染進(jìn)行精準(zhǔn)的早期診斷以及及時(shí)有效的防治。
[0008][0009]微生物信息
[0010]豬肺炎支原體單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2G2已經(jīng)保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC N0.8011，保藏地址為:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2013年07月24日。
【具體實(shí)施方式】
[0011]實(shí)施例1
[0012](一)豬肺炎支原體病單克隆抗體制備
[0013]1.免疫原及Sp20小鼠骨髓瘤細(xì)胞株選用豬肺炎支原體(168株)疫苗(生產(chǎn)批號(hào):119052)作免疫原。Sp20小鼠骨髓瘤細(xì)胞株從第四軍醫(yī)大學(xué)細(xì)胞工程中心購(gòu)入。
[0014]2.免疫動(dòng)物及免疫取雌性8周齡的Balb/C小鼠10只，以每只0.2ml豬肺炎支原體疫苗的量，腹腔注射免疫小鼠，于第1次免疫后第7、14、28天分別以豬肺炎支原體疫苗追加免疫一次，免疫注射疫苗量和第一次相同。第31天取脾細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合。
[0015]3.細(xì)胞融合及培養(yǎng)
[0016](I)免疫脾細(xì)胞的制備
[0017]①取免疫小鼠脾臟，放入盛有5ml不完全培養(yǎng)液(不加小牛血清的1640培養(yǎng)液)的平皿中，置200目的不銹鋼網(wǎng)上，使脾細(xì)胞全部通過(guò)網(wǎng)孔擠壓到溶液中。
[0018]②將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，加不完全培養(yǎng)液至30ml，混勻后，經(jīng)1000rpm離心5分鐘，棄上清。`
[0019]③用不完全培養(yǎng)液30ml倒入有沉淀脾細(xì)胞的離心管內(nèi)，輕輕震動(dòng)，使脾細(xì)胞重新變成懸液，再經(jīng)1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用不完全培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，總細(xì)胞數(shù)調(diào)為lxlO8。
[0020](2) SP20小鼠骨髓瘤細(xì)胞懸液的制備
[0021]①將SP20小鼠骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含20%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液，在CO2孵箱中培養(yǎng)，溫度為37°C，CO2濃度為5%。
[0022]②將4瓶擴(kuò)增培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞收集到50ml離心管內(nèi)。
[0023]③1000rpm離心5分鐘,棄去上清。
[0024]④加入30ml不完全培養(yǎng)液，輕輕震動(dòng)，使細(xì)胞重新垂懸于液體中，再經(jīng)1000rpm離心5分鐘，棄去上清。用不完全培養(yǎng)液將沉淀細(xì)胞垂懸至10ml，混勻，用細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)，總細(xì)胞數(shù)調(diào)至2-3xl07。
[0025](3)細(xì)胞融合
[0026]①分別吸取含IxlO8個(gè)脾細(xì)胞懸液和2-3xl07個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞懸液各10ml，加到50ml離心管中，補(bǔ)加不完全培養(yǎng)液至30ml，充分搖勻。
[0027]②1000rpm離心7分鐘,棄去上清。
[0028]③加體積濃度50%的融合劑聚乙二醇(PEG)溶液0.7ml。
[0029]④加入25ml不完全培養(yǎng)液，使PEG稀釋而失去促融作用。
[0030]⑤800rpm離心7分鐘，棄去上清。
[0031]⑥加20ml的HAT培養(yǎng)液(含20%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液中加入2%的由次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶核苷(T)組成的選擇性培養(yǎng)液)，輕輕吸取沉淀細(xì)胞，使其垂懸并混勻。
[0032]⑦將細(xì)胞懸液加到輔有飼養(yǎng)細(xì)胞(小鼠腹腔巨噬細(xì)胞)的96孔培養(yǎng)板中，每孔
0.1ml，將培養(yǎng)板放到37°C含CO2的體積濃度為5%的孵箱中培養(yǎng)。
[0033]4.抗體陽(yáng)性孔檢測(cè)(采用間接ELISA法)
[0034]①用豬肺炎支原體H9亞型疫苗包被。
[0035]②加入3中有克隆生長(zhǎng)的孔中的培養(yǎng)上清IOOul。
[0036]③加入酶標(biāo)抗鼠IgG抗體(從北京中杉金橋生物科技有限公司購(gòu)入)IOOul0
[0037]④加底物液(含0.05%鄰苯二胺溶液)IOOul，室溫避光顯色10_20分鐘。
[0038]⑤結(jié)果判定:在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀492波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，空白對(duì)照調(diào)零，若待測(cè)孔OD值大于或等于陰性對(duì)照孔OD值2.1倍，則可判定為陽(yáng)性孔，孔內(nèi)生長(zhǎng)有陽(yáng)性克隆。
[0039]5.克隆化(采用有限稀釋法)
[0040]將96孔培養(yǎng)板中被檢測(cè)為抗體陽(yáng)性的孔標(biāo)記出來(lái)。用加樣器將孔內(nèi)雜交瘤細(xì)胞反復(fù)吹打均勻后計(jì)數(shù)，然后用有限稀釋法進(jìn)行逐級(jí)稀釋，再加到96孔板進(jìn)行培養(yǎng)觀察克隆生長(zhǎng)，記錄單克隆孔。并及時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性檢測(cè)。將陽(yáng)性單克隆孔的細(xì)胞轉(zhuǎn)到24孔板培養(yǎng)，待其增殖到一定數(shù)量后再轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)(克隆化過(guò)程中每一步驟的培養(yǎng)條件相同:培養(yǎng)液為含20%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)液，在CO2孵箱中培養(yǎng)，溫度為37°C，CO2濃度為5%)。
[0041]6.雜交瘤細(xì)胞的凍存
[0042]將呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞收集于離心管，1000rpm離心10分鐘，棄去上清，加入Iml凍存液(含有30%小牛血清，60%RPM1-1640培養(yǎng)液，10% 二甲基亞砜)混勻，然后加到凍存管，在-70°C低溫冰箱過(guò)夜后轉(zhuǎn)入液氮罐長(zhǎng)期保存。
[0043]7.腹水型單克隆抗體的制備
[0044]將凍存的雜交瘤細(xì)胞復(fù)蘇擴(kuò)增培養(yǎng)，將擴(kuò)增培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞吹打下來(lái)，1000rpm離心10分鐘，收集上清作亞型試驗(yàn)。加無(wú)血清培養(yǎng)液到沉淀的雜交瘤細(xì)胞中，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X 106/ml，每只Balb/c小鼠腹腔注射0.5ml，接種雜交瘤細(xì)胞后，7—14天，拉頸脫臼處死小鼠，吸取腹水離心，收集上清，即為腹水型單克隆抗體，分裝后置于-20°C冰箱，凍存?zhèn)溆谩?br>
[0045]8.單克隆抗體的鑒定(采用ELISA法)
[0046]共獲得了 3株能穩(wěn)定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2G2, 1A5和1G6，經(jīng)效價(jià)檢測(cè)，以上3種腹水型單克隆抗體的效價(jià)為I X 10 — 4_1 X IO50特異性檢測(cè)顯示，2G2雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的腹水型單克隆抗體除了豬肺炎支原體病原體外，不和藍(lán)耳病、圓環(huán)病、豬瘟、偽狂犬病的病原體發(fā)生交叉反應(yīng)。說(shuō)明其具有較強(qiáng)的特異性，可用其建立豬肺炎支原體病的ELISA檢測(cè)試劑盒。結(jié)果見(jiàn)表1、表2。
[0047]表1雜交瘤細(xì)胞株分泌單克隆抗體效價(jià)的檢測(cè)結(jié)果表
[0048]
【權(quán)利要求】
1.能穩(wěn)定分泌豬肺炎支原體單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其特征在于所述的雜交瘤細(xì)胞株是保藏編號(hào)為CGMCC N0.8011的雜交瘤細(xì)胞株或其直接傳代物。
2.權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株分泌的豬肺炎支原體單克隆抗體。
3.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備以豬肺炎支原體單克隆抗體為基礎(chǔ)的豬肺炎支原體檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述的豬肺炎支原體單克隆抗體在制備豬肺炎支原體檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用，優(yōu)選的，所述的試劑盒是ELISA試劑盒。
5.一種豬肺炎支原體感染檢測(cè)試劑盒，其特征在于包含權(quán)利要求2所述的豬肺炎支原體單克隆抗體。
6.權(quán)利要求 5所述的試劑盒在豬肺炎支原體感染檢測(cè)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K16/12GK103805570SQ201410055028
【公開(kāi)日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2014年2月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月18日
【發(fā)明者】黃威權(quán), 趙鋒, 朱秋融, 呂葆真, 李丹青 申請(qǐng)人:西安天星生物藥業(yè)股份有限公司