使用有機(jī)溶劑中的枯草桿菌蛋白酶的側(cè)鏈被保護(hù)的寡肽片段縮合的制作方法
【專(zhuān)利摘要】酶促合成寡肽的方法，包括將(任選地N被保護(hù)的)被保護(hù)的寡肽酯與(任選地C被保護(hù)的)被保護(hù)的寡肽親核劑在含有0.1體積％以下的水含量的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物中通過(guò)以任何可能的形式的枯草桿菌蛋白酶偶聯(lián)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用有機(jī)溶劑中的枯草桿菌蛋白酶的側(cè)鏈被保護(hù)的寡化片 段縮合
[0001] 本發(fā)明涉及酶促合成寡膚的方法。
[0002] 膚類(lèi)（尤其是寡膚）具有許多應(yīng)用，例如作為藥物、食品或飼料成分、農(nóng)用化學(xué)品 或化妝品成分。
[0003] 已知寡膚可W在溶液中或者通過(guò)高度優(yōu)化的流程而在固相中化學(xué)合成。然而，在 化學(xué)膚合成、尤其是大規(guī)模的化學(xué)膚合成中仍然存在一些局限性。例如，大于10-15個(gè)氨基 酸的膚難W在固相上合成，因?yàn)樗鼈冇行纬蒆級(jí)結(jié)構(gòu)（通過(guò)所謂的"疏水塌縮"）的傾向，所 述H級(jí)結(jié)構(gòu)使得膚延伸非常困難，W使得需要大量過(guò)量的試劑和氨基酸構(gòu)建模塊。此外，由 于存在大量的相似長(zhǎng)度的膚，終產(chǎn)品的純化通常是成本低效的。因此，多于10個(gè)氨基酸的 膚通常通過(guò)被保護(hù)的寡膚片段的固相合成的聯(lián)合來(lái)合成，在所述被保護(hù)的寡膚片段的固相 合成之后，在溶液中進(jìn)行化學(xué)縮合，例如10+10縮合來(lái)制備20個(gè)氨基酸的膚。被化學(xué)保護(hù) 的寡膚片段縮合的主要弊端是，除了使用C末端Gly或Pro殘基的情況之外，在C末端氨基 酸殘基的活化中發(fā)生外消旋作用。因此，化學(xué)保護(hù)的寡膚片段縮合策略被限制于使用C末 端活化的Gly和Pro殘基，或者由于所不期望的非對(duì)映異構(gòu)體的形成而不得不處理非常困 難的純化。相比之下，酶催化的寡膚偶聯(lián)完全避免了外消旋作用，并相比于化學(xué)膚合成具有 一些其他的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)于工業(yè)應(yīng)用，基于動(dòng)力學(xué)方法的酶促膚類(lèi)合成概念（即使用活化的駿 基組分）是最吸引人的（例如參見(jiàn)Sewald和H. D. ^kiAke在"膚類(lèi)：化學(xué)和生物學(xué)"，rt翻 版，Wil巧-VCH Verlag GmbH 出版，魏因海姆 2002)。
[0004] 化學(xué)-酶促膚合成可能需要側(cè)鏈未被保護(hù)的寡膚片段的酶促偶聯(lián)，所述寡膚片 段已各自被使用化學(xué)合成法、發(fā)酵法或通過(guò)化學(xué)和酶促偶聯(lián)步驟的結(jié)合來(lái)合成。已經(jīng)公 開(kāi)了一些關(guān)于側(cè)鏈完全未被保護(hù)的寡膚在水環(huán)境下的酶促縮合（Kumaran et al. Protein Science, 2000, 9, 7；34 ;巧扣嘩 et al. Bioorg. Med. Qiem. 1998, 6, 891 ;Homan化erg et al. Biochemistiy, 1981, 21, 3387 ;Komoriya et al. Int. J. P巧.Prot. Res. 1980, 16, 433)。 然而，在水體系下的該種酶促寡膚片段縮合的主要弊端在于，同時(shí)發(fā)生寡膚醜胺鍵和C末 端醋的水解，導(dǎo)致低產(chǎn)量和許多副產(chǎn)物。為了降低昂貴的寡膚起始原料和膚類(lèi)產(chǎn)物的水解 的量，通常使用大量過(guò)量的寡膚親核劑巧-10當(dāng)量）來(lái)增加縮合速率，并因此減少水解副 反應(yīng)，從經(jīng)濟(jì)角度上看該是一種非常不具吸引力的策略。為了進(jìn)一步降低水解的量，已經(jīng) 在低水反應(yīng)混合物中使用有機(jī)助溶劑來(lái)實(shí)施酶促完全未被保護(hù)的寡膚片段的縮合，顯示了 較高的產(chǎn)品收率和較少的水解副反應(yīng)（Slomczynska et al.Biopolymers, 1992, 32, 1461; Xaus et al. Biotechnol. Tech. 1992, 6, 69 ；Nishino et al. Tet. Lett. 1992, 33, 3137 ； Cldpes et al. Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 245, Kolobanova et al. Russian J. of Bioorg. 化emistry2000, 26, 6, 369)。因?yàn)樵谠撔﹫?bào)道中，需要大量的水用于酶的活性（1-5體積％ 的水），所W水解副反應(yīng)仍然沒(méi)有被完全消除。為了幾乎消除酶促水解副反應(yīng)，可W使用 近乎無(wú)水的反應(yīng)混合物（少于1體積％的水）。然而，在該些條件下，只有非常少的酶是 有活性和穩(wěn)定的（G. Carrea, S. Riva, Fundamentals of Biocatalysis in Neat Organic Solvents, Whiley，2008)，并且在該些有機(jī)溶劑中，含有未被保護(hù)的側(cè)鏈官能團(tuán)的寡膚通常 展示出非常小的溶解性或者不溶解。一些報(bào)道公開(kāi)了二膚和H膚在無(wú)水有機(jī)溶劑中的酶促 合成（例如化en et al. J.化g.化em. 1992, 57, 6960)，但是沒(méi)有實(shí)施寡膚片段的縮合。盡管 近乎無(wú)水的溶劑幾乎消除水解副反應(yīng)，但是通常來(lái)說(shuō)許多酶活性喪失，并且因此寡膚偶聯(lián) 反應(yīng)趨向于非常慢，并且不完全。
[0005] 如從液相化學(xué)膚合成中所獲知的，被保護(hù)的寡膚由于其疏水性而易溶于幾種未慘 水的有機(jī)溶劑中。因此，使用被保護(hù)的寡膚可W實(shí)施在無(wú)水有機(jī)溶劑中的酶促寡膚片段縮 合。然而，可W預(yù)期的是多個(gè)空間上需要疏水保護(hù)的側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)阻礙酶識(shí)別。例如，Yan et al. Tetr址e化on, 2005, 61，5933報(bào)道了使用蛋白酶枯草桿菌蛋白酶A，用側(cè)鏈被保護(hù)的 氨基酸完全得不到縮合產(chǎn)物。根據(jù)他們的觀察，枯草桿菌蛋白酶A排除在其側(cè)鏈官能團(tuán)上 承載大體積的保護(hù)基的氨基酸殘基；然而，當(dāng)該些大體積的保護(hù)基被除去時(shí)，氨基酸殘基容 易被接受。
[0006] Gill 等人（J. Am. Chem. Soc 1995, 117, 6175-6181)也描述了一種用于寡膚的酶促 合成的方法。然而，如Gill等人所述的合成需要特定的酶用于每次個(gè)別添加氨基酸來(lái)合成 片段，并且還需要另外的酶用于兩個(gè)片段的偶聯(lián)。不同的酶必須用于兩個(gè)片段的組合，并且 另一種酶用于兩個(gè)片段的縮合的事實(shí)使得該方法不適用于工業(yè)規(guī)模的應(yīng)用。此外，如Gill 等人所描述的片段縮合步驟需要移除其中一個(gè)片段的兩個(gè)側(cè)鏈帰丙基保護(hù)基，W使得V8 蛋白酶的使用能夠?qū)崿F(xiàn)偶聯(lián)。因此，如Gill等人所描述的方法不是一種用于制備包含8個(gè) 或更多個(gè)氨基酸殘基的寡膚的通用方法。
[0007] 因此，仍然存在對(duì)用于合成包含至少8個(gè)氨基酸殘基的膚而不存在或者很少存在 水解副反應(yīng)的簡(jiǎn)單通用的酶促方法的需求。該樣的酶促法目前已經(jīng)出乎意料地被發(fā)現(xiàn)了。
[0008] 在本發(fā)明的框架中，將一種寡聚膚醋i)限定為包含4個(gè)或更多氨基酸殘基的寡聚 膚醋，
[0009] -包含至少兩個(gè)氨基酸殘基，每個(gè)氨基酸殘基帶有被保護(hù)基保護(hù)的側(cè)鏈官能團(tuán)，并 且包含活化的C-末端醋，其由C ( = 0) -0-CX2-C ( = 0) N-R化的化學(xué)式表示，其中，每個(gè)X獨(dú) 立地代表氨原子或焼基或芳基，Ri代表氨原子或焼基或芳基，Rs代表氨原子或焼基或芳基 或帶有C末端駿基醜胺或駿酸官能團(tuán)的氨基酸殘基或膚殘基，所述氨基酸殘基或膚殘基任 選地在氨基酸殘基的側(cè)鏈官能團(tuán)或在膚殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)上被保護(hù)，
[0010] -并且，其中寡膚醋任選地包含N末端保護(hù)。
[0011] 將如用于本發(fā)明的方法的寡膚親核劑ii)限定為包含4個(gè)或更多氨基酸殘基的寡 膚親核劑，
[0012] -包含N末端胺基，和至少兩個(gè)氨基酸殘基，每個(gè)氨基酸殘基帶有被保護(hù)基保護(hù)的 側(cè)鏈官能團(tuán)，并且
[0013] -其中，所述寡膚親核劑任選地包含C末端保護(hù)。
[0014] 本發(fā)明的方法是一種用于酶促合成寡膚的方法，所述方法包括將如上所限定的4 個(gè)或更多氨基酸殘基的寡膚醋i)與包含如上所限定的包含4個(gè)或更多氨基酸殘基的寡膚 親核劑ii)偶聯(lián)，所述偶聯(lián)在包含相對(duì)于偶聯(lián)反應(yīng)顯著地發(fā)生于其中的液體總量的0. 1體 積％ W下的水的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物中，在枯草桿菌蛋白酶的存在下進(jìn)行，其中，除 去在偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中由所述酶釋放的水。
[0015] 出于本發(fā)明的目的，在溶劑混合物中的水的百分比是通過(guò)正如在實(shí)驗(yàn)部分中所描 述的來(lái)進(jìn)行的由Karl Fischer滴定法來(lái)測(cè)定的水的百分比。
[0016] 如W上i)所述的寡膚醋在本文中也可被稱(chēng)為"醜基供體"，而寡膚親核劑ii)通常 也被稱(chēng)為"親核劑"。
[0017] 采用本發(fā)明的方法，已發(fā)現(xiàn)可能酶促地縮合被保護(hù)的寡膚片段。尤其是，已出乎意 料地發(fā)現(xiàn)了，帶有多個(gè)側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)的寡膚醜基供體（即如上所述的寡膚醋）被酶接受為 底物。進(jìn)一步地，發(fā)生被保護(hù)的寡膚縮合，而沒(méi)有明顯的副反應(yīng)。采用根據(jù)本發(fā)明所述的方 法，可獲得大于80%的產(chǎn)率，該百分比通過(guò)將已經(jīng)轉(zhuǎn)化成所需的產(chǎn)物的醜基供體的摩爾數(shù) 除W剩余的醜基供體、所需產(chǎn)物和水解產(chǎn)物的總摩爾數(shù)，再乘W 100%來(lái)計(jì)算。優(yōu)選地，獲得 大于90 %的產(chǎn)率，最優(yōu)選大于95 %的產(chǎn)率。
[0018] 出乎意料地，可獲得大于80%的產(chǎn)率，即便是在使用過(guò)量非常少或者不過(guò)量的偶 聯(lián)搭檔i)或ii)中的一種。該與在水中或含水量少的溶液中的酶促膚合成形成對(duì)比，其需 要非常大量過(guò)量的親核劑來(lái)獲得大于80%的產(chǎn)率，通常是5-10當(dāng)量。
[0019] 本發(fā)明的方法的優(yōu)勢(shì)在于，其提供了區(qū)別在于參與偶聯(lián)反應(yīng)的末端氨基酸殘基、 包括非蛋白氨基酸（Non-proteinogenic amino acid)的多種被保護(hù)的寡膚的偶聯(lián)。不管 哪個(gè)蛋白或非蛋白氨基酸被用在C末端醋的C末端殘基，都不會(huì)發(fā)生該殘基的外消旋作用， 然而，在被化學(xué)保護(hù)的片段縮合的情況下，通常發(fā)生外消旋作用，除非Gly或Pro被用于該 位點(diǎn)，因此，根據(jù)本發(fā)明的方法在片段縮合策略上提供了明顯更多的自由。
[0020] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的方法的優(yōu)勢(shì)在于，被保護(hù)的寡膚C末端醋的醋部分的水解程 度低，即在為完成偶聯(lián)的典型的時(shí)間框架內(nèi)是低的，至少在一些實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有觀察到可檢測(cè) 到的醋的水解。出于本發(fā)明的目的，"低"被限定為少于5%的醜基供體，在根據(jù)本發(fā)明的方 法中，通常是遠(yuǎn)小于5%的醜基供體被水解。被保護(hù)的寡膚片段的醜胺鍵的水解程度，或者 酶促制備的膚產(chǎn)品的水解程度也是低的，至少在一些實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有觀測(cè)到可檢測(cè)的水解。
[0021] 出于本發(fā)明的目的，"寡膚"是指基于2-200個(gè)氨基酸的膚，尤其是基于2-100個(gè) 氨基酸的膚，還尤其是基于2-50個(gè)氨基酸的膚，優(yōu)選任何2-200個(gè)氨基酸的直鏈的膚、更優(yōu) 選的2-100或2-50個(gè)氨基酸的直鏈的膚，其將被用于根據(jù)本發(fā)明的方法。出于本發(fā)明的目 的，"膚"是指基于8個(gè)或更多氨基酸的任何氨基酸鏈，該膚是根據(jù)本發(fā)明所述的方法的產(chǎn) 物。
[0022] 出于本發(fā)明的目的，"被保護(hù)的寡膚"是指包含至少4個(gè)氨基酸殘基的鏈的任何寡 膚，其中至少兩個(gè)氨基酸殘基具有側(cè)鏈官能團(tuán)，并且其中至少兩個(gè)氨基酸側(cè)鏈官能團(tuán)分別 被保護(hù)基保護(hù)。側(cè)鏈官能團(tuán)例如為輕基、駿酸、伯胺或仲胺（包括剛巧和脈基）、硫醇或駿基 醜胺基官能團(tuán)。優(yōu)選大于60 %、更優(yōu)選大于70 %并更加優(yōu)選大于80 %的存在的所有側(cè)鏈官 能團(tuán)被保護(hù)。
[0023] 出于本發(fā)明的目的，"未被保護(hù)的寡膚"是指具有少于兩個(gè)其側(cè)鏈官能團(tuán)被保護(hù)的 氨基酸殘基的任何寡膚。
[0024] 在本發(fā)明的內(nèi)容中，"氨基酸側(cè)鏈"是指任何蛋白氨基酸側(cè)鏈或非蛋白氨基酸側(cè) 鏈。
[0025] 蛋白氨基酸是通過(guò)遺傳密碼來(lái)編碼的氨基酸。蛋白氨基酸包括；丙氨酸（Ala)、 額氨酸（Val)、亮氨酸（Leu)、異亮氨酸（lie)、絲氨酸（Ser)、蘇氨酸訂虹)、蛋氨酸（Met)、 半脫氨酸（切S)、天冬醜胺（Asn)、谷氨醜胺（Gln)、酪氨酸（Tyr)、色氨酸（Trp)、甘氨酸 佑ly)、天冬氨酸（ASP),谷氨酸佑lu)、組氨酸化is)、賴(lài)氨酸（Lys)、精氨酸（Arg)、脯氨酸 (Pro)和苯丙氨酸（Phe)。
[0026] 非蛋白氨基酸可W特別選自于D-氨基酸、苯基甘氨酸、DOPA化4-二輕基A-苯 丙氨酸）、目-氨基酸、4-氣-苯丙氨酸或(T-焼基化的氨基酸。
[0027] 出于本發(fā)明的目的，縮合是指兩個(gè)寡膚之間的新的膚鍵的形成。
[0028] 在本發(fā)明的框架中，氨基酸殘基或膚殘基是指減去了該氨基酸或膚的N末端氨基 的氨基酸或膚。
[0029] 在此所用的術(shù)語(yǔ)"C末端保護(hù)"是表示提供帶有保護(hù)基團(tuán)的C末端駿基官能團(tuán)，通 常實(shí)質(zhì)上保護(hù)駿基W免被偶聯(lián)至另一個(gè)分子的胺基。C末端保護(hù)基團(tuán)可W是C末端醋，W此 使得C末端駿基至少基本上被保護(hù)而免于在所使用的膚合成條件下被偶聯(lián)至胺上。t-焼 基是常用的保護(hù)基團(tuán)。C末端保護(hù)基團(tuán)也可W是C末端駿基醜胺。伯駿基醜胺是常用的保 護(hù)基。C末端保護(hù)基也可W是醜脫、氨基甲醜醜脫或硫醋。C末端保護(hù)可W是暫時(shí)的或永久 的，后者是指該保護(hù)部分是所需的終產(chǎn)品的部分。
[0030] 本文中所用的術(shù)語(yǔ)"N末端保護(hù)"表示提供帶有保護(hù)基團(tuán)的N末端胺基，通常至少 實(shí)質(zhì)上保護(hù)N末端胺基，W免參與C末端駿基與N末端胺基的偶聯(lián)。
[0031] 在用于被保護(hù)的寡膚的酶促縮合的被保護(hù)的寡膚C末端醋i)中的醋-c( = 0) 0-CX2-C( = 0) N-R化部分是活化的醋?；罨拇资翘峁┠軌騾⑴c偶聯(lián)反應(yīng)的駿基醋的醋。
[0032] 在此，每個(gè)X獨(dú)立地表示氨原子或焼基或芳基。在本發(fā)明的方法中，當(dāng)其中每個(gè)X 為氨（-0-(?-" = 0)N-，稱(chēng)為Cam醋）時(shí)，獲得了特別好的效果。
[0033] 在所述的醋部分中，Ri表示氨原子或焼基或芳基，Rs表示氨原子或焼基或芳基，或 帶有C末端駿醜胺或駿酸官能團(tuán)的氨基酸殘基或膚殘基，所述氨基酸殘基或膚殘基任選地 在氨基酸殘基的側(cè)鏈官能團(tuán)或在膚殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)上被保護(hù)。
[0034] 在本文中，使用詞匯"焼基"或"芳基"之處，使用W下定義；每個(gè)焼基可獨(dú)立地表 示（取代或未取代的）C1-C7焼基，優(yōu)選（取代或未取代的）直鏈C1-C6焼基，更優(yōu)選（取 代或未取代的）直鏈C1-C3焼基，并最優(yōu)選甲基。
[00巧]每個(gè)芳基可獨(dú)立地表示（取代或未取代的）C4-C13芳基，優(yōu)選（取代或未取代的） C4-C6芳基，更優(yōu)選（取代或未取代的）C6芳基，并最優(yōu)選苯基。芳基可任選地在其環(huán)上包 含一個(gè)或多個(gè)雜原子。雜原子可W尤其選自S、0和N的組。焼基或芳基上的取代基可W是 不會(huì)阻止寡膚醋i)和寡膚親核劑ii)之間發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的任何原子或原子的基團(tuán)。本領(lǐng) 域技術(shù)人員可W容易地檢驗(yàn)?zāi)膫€(gè)取代基是適用于或不能用于根據(jù)本發(fā)明所述的方法的。
[0036] 在本發(fā)明的方法中，其中Ri和Rs兩者都表示氨原子或Ri表示氨原子而R2表示帶 有C末端駿基醜胺或駿酸官能團(tuán)的氨基酸殘基或膚殘基，所述氨基酸殘基或膚殘基任選地 在氨基酸殘基的側(cè)鏈官能團(tuán)上或在膚殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)上被保護(hù)時(shí)，獲得特別 好的效果。
[0037] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，被保護(hù)的寡膚醋的活化的C末端醋基可W W高產(chǎn)率和高純 度并且不發(fā)生外消旋作用地引入固相中。使用醋的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是，它們的活化的C末端醋 基可W引入廉價(jià)并工業(yè)上可獲得的2-氯H苯甲基樹(shù)脂上，其中在所述醋中，Ri表示氨原子 而Rs表示帶有C末端駿酸官能團(tuán)的氨基酸殘基或膚殘基，所述氨基酸殘基或膚殘基任選地 在氨基酸殘基的側(cè)鏈官能團(tuán)上或在膚殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)上被保護(hù)。
[0038] 被保護(hù)的寡膚醋i)的C末端氨基酸理論上可W是任何氨基酸（蛋白氨基酸或非 蛋白氨基酸），并且寡膚醋可W由蛋白氨基酸和/或非蛋白氨基酸構(gòu)成。
[0039] 特別是（任選地N末端被保護(hù)）活化的醋i)可W通過(guò)結(jié)構(gòu)式I的化合物來(lái)表示。
[0040]
【權(quán)利要求】
1. 酶促合成寡肽的方法，所述方法包括將 i) 包含4個(gè)或更多氨基酸殘基的寡肽酯， -其包含至少兩個(gè)氨基酸殘基，每個(gè)氨基酸殘基帶有被保護(hù)基保護(hù)的側(cè)鏈官能團(tuán)，并且 包含活化的C末端酯，所述C末端酯由通式C( = o)-o-cx2-c( = 表示，其中，每個(gè) X各自獨(dú)立地表示氫原子或燒基或芳基，并且Ri表示氫原子或燒基或芳基,R2表示氫原子或 烷基或芳基或帶有C末端羧酰胺或羧酸官能團(tuán)的氨基酸殘基或肽殘基，所述氨基酸殘基或 肽殘基任選地在氨基酸殘基的側(cè)鏈官能團(tuán)或在肽殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)上被保護(hù)， -并且其中，寡肽酯任選地包含N末端保護(hù)， 與 ii) 包含4個(gè)或更多氨基酸殘基的寡肽親核劑， -其包含N末端胺基，和至少兩個(gè)氨基酸殘基，每個(gè)氨基酸殘基帶有被保護(hù)基保護(hù)的側(cè) 鏈官能團(tuán)，并且 -其中，所述寡肽親核劑任選地包含C末端保護(hù)， 偶聯(lián)，所述偶聯(lián)在包含相對(duì)于偶聯(lián)反應(yīng)主要發(fā)生于其中的液體總量的〇. 1體積％或以 下的水的有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物中，在枯草桿菌蛋白酶的存在下施行，并且其中除去 在偶聯(lián)反應(yīng)過(guò)程期間通過(guò)酶釋放的水。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，寡肽酯通過(guò)使用連接物的固相合成來(lái)獲 得。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，連接物是Sieber或Ramage連接物。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所有側(cè)鏈官能團(tuán)中的至少 50 %被保護(hù)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，每個(gè)X表不氫原子。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，凡和R2兩者都表示氫原子。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，&表不氫原子，R2表不帶有 C末端羧酰胺或羧酸官能團(tuán)的氨基酸殘基或肽殘基，任選地，其氨基酸殘基的側(cè)鏈官能團(tuán)或 者肽殘基的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈官能團(tuán)被保護(hù)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，除了寡肽酯的C末端氨基酸 殘基的側(cè)鏈官能團(tuán)之外，寡肽酯和寡肽親核劑的所有側(cè)鏈官能團(tuán)被保護(hù)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，枯草桿菌蛋白酶是野生型 枯草桿菌蛋白酶的變異體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用固定形式的枯草桿菌 蛋白酶。
11. 根據(jù)權(quán)利要求1-10中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，枯草桿菌蛋白酶以交聯(lián) 酶聚集體的形式固定。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混 合物包含MTBE、THF、Me-THF、1，2-二甲氧基乙烷、二氯甲烷、1，2-二氯乙烷、TFE、DMF、NMP、 DMA 或 DMS0。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混合物包含MTBE、 MTBE與DMF或NMP或DMA或DMS0的混合物、二氯甲烷或者二氯甲烷與DMF或NMP或DMA或 DMSO的混合物。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑混 合物具有〇. 05體積％或以下的水含量。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1-14中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，連續(xù)除去通過(guò)酶釋放的 水。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1-15中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，使用分子篩除去通過(guò)酶 釋放的水。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1-16中任意一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，偶聯(lián)反應(yīng)在不存在鹽的 條件下進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C07K1/02GK104284901SQ201380022510
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2013年2月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月29日
【發(fā)明者】彼得·賈恩·萊納德·馬里奧·庫(kù)埃迪弗利艾格, 蒂莫·努伊金斯 申請(qǐng)人:恩細(xì)貝普有限公司