雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取條件優(yōu)化方法及提取方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取條件優(yōu)化方法及提取方法，其特征在于：針對雷公藤多指標(biāo)活性成分的最優(yōu)化提取，綜合現(xiàn)有技術(shù)中的雷公藤活性成分的超聲提取工藝，經(jīng)過單因素實驗考查，選取液料比、溶劑濃度和超聲功率三個對雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取總評值（OD值）影響較大的因數(shù)，利用design expert軟件，運用星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化法進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù)。本發(fā)明方法簡易，實驗精度高，能通過模型擬合求得最佳值，節(jié)約了資源和能耗，能為工業(yè)化提取生產(chǎn)提供指導(dǎo)。
【專利說明】雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取條件優(yōu)化方法及提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取條件優(yōu)化方法及雷公藤活性成分 的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雷公藤在中醫(yī)臨床上具有悠久的使用歷史，主要用于治療各種免疫和炎癥性疾 病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等。雷公藤活性成分具有很好的抗腫瘤、免疫抑 制、抗炎、抗生育、殺蟲等活性。雷公藤內(nèi)酯醇（即雷公藤甲素)是雷公藤中研究最多、活性最 好的成分，具有很好的抗腫瘤、免疫抑制、抗炎、抗生育、殺蟲等活性。雷公藤內(nèi)酯酮與雷公 藤內(nèi)酯醇結(jié)構(gòu)相似，活性也相當(dāng)。雷公藤紅素具有很強的抗腫瘤及較好的免疫抑制等活性。 去甲澤拉木醛具有較強的免疫抑制作用。因此這四個指標(biāo)活性成分已經(jīng)能夠反映雷公藤的 整體活性。目前國內(nèi)外對這些活性成分的研究已成熱點，主要集中在通過結(jié)構(gòu)改造等進行 創(chuàng)新藥物的研發(fā)，因此提取分離這些雷公藤活性成分具有重要意義。
[0003] 雷公藤傳統(tǒng)的提取方法有煎煮法、回流法、浸漬法、滲漉法。近年來一些新的提取 法，如超聲波提取法、超臨界萃取法和破碎提取法等，也越來越受到關(guān)注。但是在現(xiàn)有雷公 藤提取工藝中，一般只選用單個指標(biāo)成分，不能衡量提取物的整體組成；也有一些對一類成 分如總內(nèi)酯、總生物堿的提取報道，但提取目標(biāo)缺乏針對性、提取藥液雜質(zhì)多；一般很少采 用實驗優(yōu)化設(shè)計，從而無法判定提取工藝是否為最優(yōu)、是否科學(xué)合理。
[0004] 星點設(shè)計是在析因設(shè)計的基礎(chǔ)上，由析因點及中心點形成的可進行線性或非線性 擬合的實驗設(shè)計方法，具有實驗次數(shù)少、精度高等特點。響應(yīng)面法是根據(jù)幾個變量與一個或 多個應(yīng)變量之間的回歸關(guān)系，通過回歸分析得到提取條件和結(jié)果的回歸關(guān)系，從而求得最 佳提取工藝的一種數(shù)學(xué)優(yōu)化方法，具有科學(xué)直觀、方便有效等特點。
[0005] 超聲波提取技術(shù)是利用超聲波的空化作用及超聲波次級效應(yīng)使植物有效成分快 速溶出，具有提取簡易、效率高、能耗低、不破壞有效成分等特點。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 為了解決上述問題本發(fā)明提供一種運用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化雷公藤多指標(biāo) 活性成分的超聲提取工藝，選取液料比、溶劑濃度和超聲功率三個對雷公藤多指標(biāo)活性成 分的OD值影響較大的因數(shù)進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù)。
[0007] 本發(fā)明涉及一種雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取條件優(yōu)化方法，其特征在于：
[0008] 1.針對雷公藤多指標(biāo)活性成分的最優(yōu)化提取，所提取優(yōu)化的雷公藤多指標(biāo)活性成 分可以為雷公藤內(nèi)酯醇、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素和去甲澤拉木醛中的兩種或三種以上 成分。
[0009] 2.運用星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化雷公藤多指標(biāo)活性成分的超聲提取工藝，按 以下步驟進行：
[0010] 1)綜合現(xiàn)有技術(shù)中的雷公藤活性成分的超聲提取工藝為：取雷公藤藥材根的粉 末，采用甲醇、乙酸乙酯、乙腈中的一種或兩種以上成分混合溶液提取，按照提取溶液與粉 末為1:1?80:1的液料比，于50?400W功率下超聲提取5?60分鐘；固液分離，得含有 雷公藤活性成分的提取液；
[0011] 2)提取工藝中單因數(shù)實驗考查：
[0012] 當(dāng)其它因數(shù)在較優(yōu)水平范圍時，改變某一因素，例如：
[0013] 當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，液料比在16:1?48:1，超聲功率在100? 400W，提取時間在15?45分鐘的較優(yōu)水平范圍時，乙酸乙酯甲醇混合溶液中乙酸乙酯體積 濃度在〇?100%范圍內(nèi)分散選取5個或6個以上點值作為實驗水平，進行單因素實驗；
[0014] 當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度在50?100%，超聲功率 在100?400W，提取時間在15?45分鐘的較優(yōu)水平范圍時，液料比在1:1?80:1范圍內(nèi) 分散選取8個或9個以上實驗水平，進行單因素實驗；
[0015] 當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度在50?100%，液料比在 16:1?48:1，提取時間在15?45分鐘的較優(yōu)水平范圍時，超聲功率在50?400W范圍內(nèi) 分散選取5個或6個以上實驗水平，進行單因素實驗；
[0016] 當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度在50?100%，液料比在 16:1?48:1，超聲功率在100?400W的較優(yōu)水平范圍時，提取時間在5?60分鐘范圍內(nèi) 分散選取6個或7個以上實驗水平，進行單因素實驗；
[0017] 按實驗超聲提取后固液分離，得含有雷公藤活性成分的提取液；提取液過濾膜后 即用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測；計算OD值，OD值越高，表明提取率越高，對應(yīng)的提取工藝參 數(shù)越優(yōu)；進行數(shù)據(jù)分析處理(如圖2);
[0018] 每次處理重復(fù)三次或四次以上；根據(jù)單因素實驗考查結(jié)果得知，雷公藤多指標(biāo)活 性成分的超聲提取工藝優(yōu)化較佳參數(shù)為：采用乙酸乙酯體積濃度為50?100%的乙酸乙酯 或乙酸乙酯甲醇混合溶液提取，按照提取溶液與粉末為24:1?40:1的液料比，于100? 400W功率下超聲提取30分鐘；
[0019] 3)經(jīng)過單因素實驗考查結(jié)果，選取液料比、溶劑濃度和超聲功率三個對雷公藤多 指標(biāo)活性成分的OD值影響較大的因數(shù)，利用design expert軟件，運用星點設(shè)計-響應(yīng)面 法(李東東，放茂良，高云濤，等.星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取青竹標(biāo)多酚[J].中藥 材，2011，34(1) : 129-133.)進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù)：液料比為34. 60,乙酸乙酯 體積濃度為74. 36%，超聲功率為299. 5W，超聲提取30分鐘。
[0020] 本發(fā)明還涉及一種雷公藤活性成分的提取方法，其特征在于：取雷公藤藥材根的 粉末，采用乙酸乙酯體積濃度為50?100%的乙酸乙酯或乙酸乙酯甲醇混合溶液提取，按照 提取溶液與粉末為24:1?40:1的液料比，于100?400W功率下超聲提取30分鐘；固液分 離，得含有雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取液。
[0021] 雷公藤藥材根的粉末是指干燥至含水率< 8% (重量含量）雷公藤藥材根部，粉碎 后通過60目篩的篩下組分。
[0022] 本發(fā)明總結(jié)：
[0023] 1.本發(fā)明選用多指標(biāo)成分進行提取優(yōu)化，既有低含量的活性成分雷公藤內(nèi)酯醇和 雷公藤內(nèi)酯酮，又有高含量的活性成分雷公藤紅素和去甲澤拉木醛，兼顧高低含量主要活 性成分的同時提取優(yōu)化，使提取物能更全面地反映雷公藤的整體活性組成。
[0024] 2.本發(fā)明應(yīng)用星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化雷公藤多指標(biāo)活性成分提取工藝，星點設(shè) 計比正交設(shè)計更簡化，比均勻設(shè)計法更全面，而且其實驗次數(shù)少（正交設(shè)計5 3組實驗），實 驗精度1?。
[0025] 3.在某些實施例中，提取溶劑可以不為甲醇、乙酸乙酯、乙腈或其混合溶液；提取 次數(shù)可以多次。
[0026] 4.正交設(shè)計和均勻設(shè)計是基于線性模型的設(shè)計，某些設(shè)計表如正交設(shè)計L9 (34) 不適合用于二次及以上多項式模型，由于受所選模型的限制，只能指出某一因素的取值方 向，但無法求得最佳值。星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化就能通過多項式模型擬合求得最佳值， 科學(xué)有效地得到最佳提取工藝、最佳OD值和最佳提取率。
[0027] 5.本發(fā)明采用超聲波提取技術(shù)，具有提取簡易、效率高、能耗低、不破壞有效成分 等優(yōu)點。
[0028] 6.本發(fā)明提高了提取效率和雷公藤資源的利用率，節(jié)約了資源和能耗，能夠為雷 公藤的工業(yè)化提取生產(chǎn)提供指導(dǎo)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0029] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】做進一步詳細(xì)說明。
[0030] 圖1雷公藤對照品溶液和提取物中四個指標(biāo)活性成分的提取離子流色譜圖：雷公 藤內(nèi)酯醇（1)、雷公藤內(nèi)酯酮（1)、去甲澤拉木醛（3)、雷公藤紅素（4);
[0031] 圖2是單因素實驗中不同提取因數(shù)對雷公藤多指標(biāo)活性成分OD值的影響圖：
[0032] (1)為液料比對雷公藤多指標(biāo)活性成分OD值的影響圖
[0033] (2)為溶劑濃度對雷公藤多指標(biāo)活性成分OD值的影響圖
[0034] (3)為超聲功率對雷公藤多指標(biāo)活性成分OD值的影響圖
[0035] (4)為提取時間對雷公藤多指標(biāo)活性成分OD值的影響圖；
[0036] 圖3是提取因素對雷公藤多指標(biāo)活性成分OD值影響的響應(yīng)面三維、二維圖：
[0037] (a)上圖為液料比與濃度對OD值影響的響應(yīng)面三維圖
[0038] (a)下圖為液料比與濃度對OD值影響的響應(yīng)面二維圖
[0039] (b)上圖為液料比與超聲功率對OD值影響的響應(yīng)面三維圖
[0040] (b)下圖為液料比與超聲功率對OD值影響的響應(yīng)面二維圖
[0041] (c)上圖為濃度與超聲功率對OD值影響的響應(yīng)面三維圖
[0042] (c)下圖為濃度比與超聲功率對OD值影響的響應(yīng)面二維圖。
【具體實施方式】
[0043] 現(xiàn)結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明，實施例僅限于說明本發(fā)明，而 非對本發(fā)明的限定。
[0044] 實施例1
[0045] 一種雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取條件優(yōu)化方法
[0046] L提取實驗
[0047] 用天平稱取雷公藤藥材根的粉末，采用甲醇、乙酸乙酯、乙腈中的一種或兩種以 上成分混合溶液提取，按照提取溶液與粉末為1:1?80:1的液料比，于50?400W功率 下超聲提取5?60分鐘；固液分離，得含有雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取液。提取液過 濾膜后即用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測（R.J. Zhuo, H.B. Xiao et al. Rapid simultaneous quantitative determination of terpenoids in Tripterygium wilfordii Hook F by ultrahigh-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-〇f-flight mass spectrometry. Analytical Methods, 2013, 5, 2046 - 2052)。利用色 譜的強大分離能力和質(zhì)譜的高分辨高靈敏，得到基線分離的四個指標(biāo)活性成分的提取離子 流色譜圖(見圖1 )，利用四個化合物的積分峰面積計算提取總評值（0D值)。
[0048] OD=(LOGI0(AI*V)*L0GI0(A2*V)*L0GI0(A3*V)*L0GI0(A4*V)Γ(1/4)
[0049] A1、A2、A3、A4分別表示四個指標(biāo)活性成分雷公藤內(nèi)酯醇、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅 素、去甲澤拉木醛的提取離子流色譜圖（EIC)積分峰面積，V為液料比。
[0050] 提取率=0D/0D 總 *100%
[0051] 在最優(yōu)提取條件下，分級超聲提取雷公藤藥材根的粉末，直至提取液無色且檢測 不到四個活性成分中的任意一個，按實際檢測到的化合物來計算，得到分級各次提取的OD 值，其加和為0D&
[0052] 2.實驗設(shè)計與統(tǒng)計分析
[0053] 1)提取工藝中單因數(shù)實驗考查：
[0054] 當(dāng)固定提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，液料比為32:1，超聲功率為250W，提 取時間為30分鐘時，取乙酸乙酯甲醇混合溶液中乙酸乙酯體積濃度分別為0、25、50、75、 100%，進行單因素實驗，考察溶劑濃度對OD值的影響；
[0055] 當(dāng)固定提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度為75%，超聲功率為 250W，提取時間為30分鐘時，取液料比分別為1 :1、2:1、4:1、8:1、16:1、32 :1、48:1、80:1，進 行單因素實驗，考察液料比對OD值的影響；
[0056] 當(dāng)固定提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度為75%，液料比為 32:1，提取時間為30分鐘時，取超聲功率分別為50、150、250、350、4001，進行單因素實驗， 考察超聲功率對OD值的影響；
[0057] 當(dāng)固定提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度為75%，液料比為 32:1，超聲功率為2501時，取提取時間分別為5、10、15、30、45、60分鐘，進行單因素實驗，考 察提取時間對OD值的影響；
[0058] 按實驗超聲提取后固液分離，得含有雷公藤活性成分的提取液；提取液過濾膜后 即用于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測；計算OD值，OD值越高，表明提取率越高，對應(yīng)的提取工藝參 數(shù)越優(yōu)；進行數(shù)據(jù)分析處理(如圖2);
[0059] 每次處理重復(fù)三次或四次以上；根據(jù)單因素實驗考查結(jié)果得知，雷公藤多指標(biāo)活 性成分的超聲提取工藝優(yōu)化較佳參數(shù)為：采用乙酸乙酯體積濃度為50?100%的乙酸乙酯 或乙酸乙酯甲醇混合溶液提取，按照提取溶液與粉末為24:1?40:1的液料比，于100? 400W功率下超聲提取30分鐘。
[0060] 2)響應(yīng)面法設(shè)計優(yōu)化
[0061] 根據(jù)單因素實驗考查結(jié)果，選取對OD值影響較顯著的液料比、溶劑濃度和超聲功 率這三個因素，利用design expert軟件根據(jù)星點設(shè)計原則設(shè)計實驗，進行實驗因素與水平 的設(shè)定，設(shè)定結(jié)果見表1。
[0062] 表1實驗因素與水平設(shè)定
[0063]
【權(quán)利要求】
1. 一種雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取條件優(yōu)化方法，其特征在于：針對雷公藤多指標(biāo) 活性成分的最優(yōu)化提取，所提取優(yōu)化的雷公藤多指標(biāo)活性成分可以為雷公藤內(nèi)酯醇、雷公 藤內(nèi)酯酮、雷公藤紅素和去甲澤拉木醛中的兩種或三種以上成分； 按以下步驟進行： 1) 綜合現(xiàn)有技術(shù)中的雷公藤活性成分的超聲提取工藝； 2) 提取工藝中單因數(shù)實驗考查； 3) 運用星點設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化雷公藤多指標(biāo)活性成分的超聲提取工藝。
2. 按照權(quán)利要求1所述的的提取條件優(yōu)化方法，其特征在于：運用星點設(shè)計_響應(yīng)面 優(yōu)化法優(yōu)化雷公藤多指標(biāo)活性成分的超聲提取工藝，按以下步驟進行： 1) 綜合現(xiàn)有技術(shù)中的雷公藤活性成分的超聲提取工藝為：取雷公藤藥材根的粉末，采 用甲醇、乙酸乙酯、乙腈中的一種或兩種以上成分混合溶液提取，按照提取溶液與粉末為 1:1?80:1的液料比，于50?400W功率下超聲提取5?60分鐘；固液分離，得含有雷公 藤活性成分的提取液； 2) 提取工藝中單因數(shù)實驗考查： 當(dāng)其它因數(shù)在較優(yōu)水平范圍時，改變某一因素，例如： 當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，液料比在16:1?48:1，超聲功率在100? 400W，提取時間在15?45分鐘的較優(yōu)水平范圍時，乙酸乙酯甲醇混合溶液中乙酸乙酯體積 濃度在〇?100%范圍內(nèi)分散選取5個或6個以上點值作為實驗水平，進行單因素實驗； 當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度在50?100%，超聲功率在 100?400W，提取時間在15?45分鐘的較優(yōu)水平范圍時，液料比在1:1?80:1范圍內(nèi)分 散選取8個或9個以上實驗水平，進行單因素實驗； 當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度在50?100%，液料比在 16:1?48:1，提取時間在15?45分鐘的較優(yōu)水平范圍時，超聲功率在50?400W范圍內(nèi) 分散選取5個或6個以上實驗水平，進行單因素實驗； 當(dāng)提取溶劑為乙酸乙酯甲醇混合溶液，乙酸乙酯體積濃度在50?100%，液料比在 16:1?48:1，超聲功率在100?400W的較優(yōu)水平范圍時，提取時間在5?60分鐘范圍內(nèi) 分散選取6個或7個以上實驗水平，進行單因素實驗； 按實驗超聲提取后固液分離，得含有雷公藤活性成分的提取液；提取液過濾膜后即用 于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測；計算雷公藤多指標(biāo)活性成分的提取總評值（OD值)，OD值越高， 表明提取率越高，對應(yīng)的提取工藝參數(shù)越優(yōu)； 每次處理重復(fù)三次或四次以上；根據(jù)單因素實驗考查結(jié)果得知，雷公藤多指標(biāo)活性成 分的超聲提取工藝優(yōu)化較佳參數(shù)為：采用乙酸乙酯體積濃度為50?100%的乙酸乙酯或乙 酸乙酯甲醇混合溶液提取，按照提取溶液與粉末為24:1?40:1的液料比，于100?400W 功率下超聲提取30分鐘； 3) 經(jīng)過單因素實驗考查結(jié)果，選取液料比、溶劑濃度和超聲功率三個對雷公藤多指標(biāo) 活性成分的OD值影響較大的因數(shù)，利用design expert軟件，運用星點設(shè)計-響應(yīng)面法 (李東東，放茂良，高云濤，等.星點設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取青竹標(biāo)多酚[J].中藥 材，2011，34(1) : 129-133.)進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝參數(shù)：液料比為34. 60,乙酸乙酯 體積濃度為74. 36%，超聲功率為299. 5W，超聲提取30分鐘。
3. -種雷公藤活性成分的提取方法，其特征在于：取雷公藤藥材根的粉末，采用乙酸 乙酯體積濃度為50?100%的乙酸乙酯或乙酸乙酯甲醇混合溶液提取，按照提取溶液與粉 末為24:1?40:1的液料比，于100?400W功率下超聲提取30分鐘；固液分離，得含有雷 公藤多指標(biāo)活性成分的提取液。
4. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于： 液料比為34. 60,乙酸乙酯體積濃度為74. 36%，超聲功率為299. 5W，超聲提取30分鐘。
5. 按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于： 雷公藤藥材根的粉末是指干燥至含水率< 8% (重量含量）雷公藤藥材根部，粉碎后通 過60目篩的篩下組分。
【文檔編號】C07J73/00GK104418931SQ201310379726
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】肖紅斌, 卓榮杰, 張曉哲, 王莉, 高明哲 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所