一種與植物耐旱相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與植物耐旱相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白，稱為BhSMP1，來源于苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boea?hygrometrica），是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明篩選到一個受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的BhSMP1基因及其編碼的蛋白，該蛋白及其編碼基因?qū)τ谂嘤购?、抗鹽性提高的作物、林草等新品種具有重要的理論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定。
【專利說明】一種與植物耐旱相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種與植物耐旱相關(guān)的蛋白及其編碼基因與 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著全球水資源的缺乏和極端氣候事件的增長，干旱對作物的產(chǎn)量和品質(zhì)的影響 日趨顯著。因此，通過分子操作技術(shù)提高作物的抗旱性日顯重要。
[0003] 生物體受到干旱脅迫或其它不良環(huán)境因素后，會通過不同途徑抵抗不良脅迫。種 子成熟過程中也伴隨著這耐旱性的獲得，包括耐旱相關(guān)蛋白的合成與積累，保護(hù)物質(zhì)的產(chǎn) 生，有害物質(zhì)的清除等。種子成熟蛋白的含量與植物的耐旱性的形成具有重要作用，且能提 高逆境中的萌發(fā)率。
[0004] 復(fù)蘇植物因其可以忍受極度干旱的條件，待水份充足時又能很快恢復(fù)正常生命活 動的特性而被認(rèn)為是研究抗逆機(jī)制和提供抗逆基因的極好的植物資源。旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)是在我國分布的一種苦苣苔科復(fù)蘇植物，該植物的葉片具有很強(qiáng)的耐旱復(fù) 蘇能力，在室溫、相對空氣濕度為〇的條件下生長72小時后，葉片相對含水量降為3%左右， 葉片面積皺縮至原葉片面積的1/3以下，光合作用基本停止。只要重新給水，葉片就可以吸 水伸展，并恢復(fù)成未處理前的葉片表觀狀態(tài)和生理狀態(tài)(包括光合作用的恢復(fù))。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 本發(fā)明的一個目的是提供一種與植物耐旱相關(guān)的蛋白及其編碼基因。
[0006] 本發(fā)明提供的蛋白，稱為BhSMPl，來源于苦苣苔科的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)，是如下（a)或（b):
[0007] (a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008] (b)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/ 或缺失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
[0009] 上述蛋白中，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多 于十個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0010] 編碼上述蛋白的DNA分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0011] 上述DNA分子是如下（1)- (3)中任意一種的DNA分子：
[0012] (1)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第36-272位核苷酸所示的DNA分子；
[0013] (2)在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA 分子；
[0014] (3)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
[0015] 上述DNA分子也可以按照如下方法制備：用引物 5' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3' 和引物 5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3' ；以序列 表中的序列1所示的DNA分子為模板，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，再經(jīng)過BamH I和EcoR I雙酶 切，得到DNA分子。
[0016] 上述嚴(yán)格條件為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65oC下雜交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS 和 1 X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0017] 上述序列表中的序列1由443個堿基組成，其開放閱讀框架（0RF)為自5'末端第 36-272位堿基，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的BhSMPl。
[0018] 含有上述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍。
[0019] 上述重組載體為將上述DNA分子替換掉表達(dá)載體Binl9-35S-LEA-polyA中 的LEA片段，得到表達(dá)上述蛋白的重組載體。在本發(fā)明的實(shí)施例中，上述重組載體具體 可為將上述DNA分子取代Binl9-35S-LEA-polyA的BamH I和EcoR I酶切識別位點(diǎn) 間的小片段（LEA片段）得到的重組質(zhì)粒。上述DNA分子為按照如下方法制備：用引物 5' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3' 和引物 5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3' ；以序列 表中的序列1所示的DNA分子為模板，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物，再經(jīng)過BamH I和EcoR I雙酶 切，得到DNA分子。
[0020] 擴(kuò)增上述BhSMPl基因全長或其任一片段的引物對也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021] 用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種雙元農(nóng)桿菌載體或可用于 植物微彈轟擊的載體等，如 pBinl9、pBI121、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300 或其 它衍生植物表達(dá)載體。
[0022] 使用BhSMPl基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種 增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動子，如花椰菜花葉病毒（CAMV)35S啟動子、泛生 素基因 Ubiquitin啟動子（pUbi)等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此 夕卜，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng) 子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列 的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣 泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0023] 為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、GFP基 因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等）或 是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因（如抗除莠劑基因）等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0024] 上述蛋白、上述DNA分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控 植物耐逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；在上述應(yīng)用中所述調(diào)控植物耐逆性具體為提 高植物耐逆性；所述耐逆性具體為耐旱性；上述耐旱性通過如下體現(xiàn)：在PEG2000脅迫作用 下轉(zhuǎn)基因植物種子的萌發(fā)率大于所述目的植物。上述植物具體為雙子葉植物或單子葉植 物，上述雙子葉植物進(jìn)一步具體為擬南芥。
[0025] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼上述蛋白的 DNA分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
[0026] 上述方法中，所述耐逆性為耐旱性；
[0027] 編碼上述蛋白的DNA分子通過上述的重組載體導(dǎo)入目的植物。
[0028] 上述方法中，所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物具體為 擬南芥。
[0029] 上述耐旱性通過如下體現(xiàn)：在PEG2000脅迫作用下轉(zhuǎn)基因植物種子的萌發(fā)率大于 所述目的植物。
[0030] 攜帶有本發(fā)明的與植物抗旱、抗鹽相關(guān)蛋白編碼基因 BhSMPl的植物表達(dá)載體可 通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生 物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既可以是水稻、小麥、大豆、煙草、玉 米、油菜、高粱、棉花等農(nóng)作物，也可以是苜蓿、三葉草、冰草等牧草以及草莓、西紅柿等果蔬 花卉植物。
[0031] 本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明從復(fù)蘇植物旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)中篩選 到一個受干旱誘導(dǎo)表達(dá)的BhSMPl基因，將該基因?qū)霐M南芥，得到轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥，轉(zhuǎn) BhSMPl擬南芥的耐旱性明顯高于未轉(zhuǎn)基因的擬南芥，說明BhSMPl是與植物耐旱性相關(guān)的 蛋白。因此，該蛋白及其編碼基因?qū)τ谂嘤秃敌蕴岣叩淖魑铩⒘植莸刃缕贩N具有重要的理 論及實(shí)際意義，可用于農(nóng)牧業(yè)和生態(tài)環(huán)境治理所需的抗性植物品種的培育與鑒定。
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033] 圖1為BhSMPl基因在旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)干旱復(fù)蘇過程中的表達(dá)情 況
[0034] 圖2為T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的RT-PCR檢測結(jié)果
[0035] 圖3為T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥種子萌發(fā)過程中PEG8000耐受能力鑒定
【具體實(shí)施方式】
[0036] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0037] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0038] 實(shí)施例1、BhSMPl基因的獲得及在干旱脅迫處理中的表達(dá)
[0039] 一、BhSMPl基因的獲得
[0040] 提取經(jīng)干旱脅迫(將土培苗小心清洗干凈，放于光照培養(yǎng)箱中自然干燥， 溫度：22. 0°C，濕度：50%RH，光周期：16光照/8黑暗）處理8小時的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica，記載在如下文獻(xiàn)中：Deng Xin, Hu Z, Wang H(1999):mRNA differential display visualized by silver staining tested on gene expression in resurrection plant Boea hygrometrica. Plant Mol Biol Repl7:279.公眾可從中國科 學(xué)院植物研究所獲得）葉片的總RNA，利用ZAP-cDNA?文庫構(gòu)建試劑盒（Stratagene，La Jolla，CA)構(gòu)建 cDNA 文庫。從中隨機(jī)挑選 4800 個基因，用 BioGrid robot (BioRobotics Ltd，Cambridge，UK)自動化點(diǎn)樣在 Hybond-礦尼龍膜（Amersham Biosciences， Freiburg，Germany)上，制成cDNA微陣列（cDNA芯片）。將該cDNA芯片分別與未經(jīng)干旱處 理正常生長的旋蒴苣苔葉片和經(jīng)干旱脅迫處理8小時的旋蒴苣苔葉片的polyA-RNA所制備 的33P標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，分析它們在正常條件及干旱誘導(dǎo)后基因表達(dá)的動態(tài)變化。結(jié)果 發(fā)現(xiàn)，有1個經(jīng)干旱誘導(dǎo)上調(diào)的基因。
[0041] 提取經(jīng)干旱脅迫處理8小時的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)葉片的總RNA 并以其為模板，用基因特異性引物GSP-Race 1:5 ' -GGCGTCCTCCACCTTTTCTT-3 '進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄。反應(yīng)體系為：總 RNA (2μ g/μ 1) 1. 0μ 1，GSP-Racel (ΙμΜ) 2μ 1，dNTP (2mM) 5μ 1， DEPC-H206.0 y 1，5XM-MLV buffer4y 1，RNase 抑制劑（5ιι/μ 1，購自 Takara 公司）1μ 1， M-MLV (購自Promega公司）1μ 1。37°C反應(yīng)lh后再65°C lOmin，純化回收(三博PCR產(chǎn)物 回收試劑盒）后加 C 尾。反應(yīng)體系為：cDNA5y 1，DEPC-H2013. 5μ l，5Xbuffer5y 1，dCTP (10πιΜ)0·5μ1。75°C反應(yīng) 5min后加入 Ιμ? TdT (購自 takara 公司），再 37°C反應(yīng) lh，得 到加 C尾的cDNA序列。
[0042] 以上述獲得的加 C尾的cDNA序列為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用反應(yīng)體系為： cDNAl μ 1，10XPCR bufferl μ 1，dNTP (2mM) 1 μ 1，引物 GSP-Race2:5, -GAATCGGTCCAGGTC ATCTTTAC-3 '（10μΜ)0·5μ1，多聚 G 錨定引物 5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACG-3 '（ 10 μ Μ) 0. 5μ l，Taq酶(購自takara公司）0. 1μ 1。反應(yīng)條件為：先95°C預(yù)變性4min，然后94°C變 性30秒，55°C退火30秒，再72延伸2分鐘，共35個循環(huán)；最后72°C延伸10分鐘。將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果得到450bp左右的條帶；回收該450bp左右的條帶，與 載體pGEM-T (購自promega公司）連接后進(jìn)行測序，得到443bp的PCR產(chǎn)物。
[0043] 根據(jù)測序結(jié)果設(shè)計引物5' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3，和引物 5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3' ；以干旱脅迫處理8小時的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)葉片的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板（也可以以序列表中的序列1 所示的DNA分子為模板)，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：cDNAl μ 1，10 X PCR bufferl μ 1，dNTP (2mM) 1 μ 1，引物各 0· 5 μ 1，Taq 酶(購自 takara 公司）0· 1 μ 1。程序?yàn)椋?95°C預(yù)變性4min，94°C變性45秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共27個循環(huán)；最后再 72 °C延伸10分鐘。
[0044] 得到250bp左右的產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該P(yáng)CR產(chǎn)物具有序列表中序列1自5'末端第 36-272位的核苷酸，該P(yáng)CR產(chǎn)物即為BhSMPl基因全序列，分析發(fā)現(xiàn)BhSMPl基因全序列包含 完整的BhSMPl基因的開放閱讀框（0RF)、5, -UTR(5' -非翻譯區(qū)）和3' -UTR，其BhSMPl基 因0RF為序列1自5'末端第36-272位的脫氧核糖核苷酸，編碼蛋白命名為BhSMPl，該蛋 白的氨基酸殘基序列如序列表中序列2所示。
[0045] 二、BhSMPl基因在旋蒴苣苔（Boea hygrometrica)干旱復(fù)蘇過程中的表達(dá)情況
[0046] 對旋蒴苣苔進(jìn)行8種不同程度的干旱處理，分別為：新鮮植株（F)，新鮮植株土里 慢速干旱5天(不澆水處理5天，SD5d)，新鮮植株土里慢速干旱14天(不澆水處理14天 SD14d)。分別提取3種處理旋蒴苣苔葉片的總RNA、反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。用基因特異性引物 BhSMPl-f5' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3'，和 BhSMPl-r5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGT G-3'進(jìn)行Q-PCR擴(kuò)增。并以18S rRNA基因?yàn)閮?nèi)參，擴(kuò)增引物為18S-f5' -CTTAGTTGGTGGAG CGATTTG-3 '，和 5 ' -CCTGTTATTGCCTCAAACTTCC-3 '。反應(yīng)體系為：cDNA 1 μ 1，10 μ 12 X SYBR Green Master Mix，引物各 0·5μ1，（Μ 水 8·5μ1。程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性 30 秒，95°C變性 5 秒，55 °C退火30秒，72 °C延伸30分鐘，共50個循環(huán)。
[0047] 結(jié)果如圖1所示，其中，F(xiàn)表示新鮮未處理的旋蒴苣苔，SD5d、SD14d分別表示脫水 5天和14天，可以看出該基因明顯受干旱誘導(dǎo)。
[0048] 實(shí)施例2、轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的獲得及其功能研究
[0049] 一、轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的獲得
[0050] 1、重組載體pBinl9-BhSMPl的獲得
[0051] 用引物 5 ' -AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3 ' 和引物 5' -TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3' ；以序列表中的序列1所示的DNA分子為模板，得到 258bp的PCR產(chǎn)物。
[0052] 重組載體pBinl9-BhSMPl具體構(gòu)建方法如下：
[0053] 1)將258bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和EcoR I (購自大連寶生物公司）雙酶切后，回 收約258bp的片段(具有序列表中序列1自5'末端第36-272位的核苷酸）；
[0054] 2)將含CaMV35Sq啟動子和pA 的載體Binl9-35S-LEA_polyA(Liu X.，Wang Z, Wang L. L. , ffu R. H. Phillips J.and Deng X〇 LEA4group genes from the resurrection plant Boea hygrometrica confer dehydration tolerance in transgenic tobacco, Plant Sciencel76 (2009) 90 - 98 ;公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得）用BamH I和EcoR I酶 切去掉LEA片段，回收約13kb的載體骨架，將載體骨架與1)得到的258bp的片段連接，獲 得重組載體pBinl9-BhSMPl (用BamH I和EcoR I酶切驗(yàn)證，得到258bp為陽性)。
[0055] 經(jīng)過測序，該重組載體pBinl9-BhSMPl為將258bp的片段(具有序列表中序列1自 5'末端第36-272位的核苷酸）取代載體Binl9-35S-LEA-polyA的BamH I和EcoR I酶切 位點(diǎn)間的小片段（LEA片段)，得到的載體。
[0056] 該重組載體 pBinl9-BhSMPl 受 35S 啟動子（Odell, JI^Nagy^iChi^NH-identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus35S promoter. Nature. 313 (2005) : 810 - 812)控制。
[0057] 2、重組菌的獲得
[0058] 將上述1得到的重組載體pBinl9-BhSMPl轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌Gv3101細(xì)胞(公眾可 從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載在如下文獻(xiàn)中：Holsters M，Silva B，Van Vliet F,Genetello C, De Block M, Dhaese P,Depicker A,Inz6D, Engler G,Vi 1laroel R, Van Montagu M, Schell J(1980)The functional organization of the nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid3:212-230)中，用含有 50 μ g/ml 硫酸卡那霉素、 50 μ g/ml慶大霉素和50 μ g/ml利福平的YEB固體平板培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，得到轉(zhuǎn)化子，提 取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒送去測序，質(zhì)粒為pBinl9-BhSMPl，則將含有該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子命名為重組菌 Gv3101/pBinl9-BhSMPl〇
[0059] 3、轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的獲得及分子鑒定
[0060] 1)轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的獲得
[0061] 將重組菌Gv3101/pBinl9-BhSMPl采用花器官浸泡法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-0 (ecotype Columbia, Arabidopsis thaliana;公眾可從中國科學(xué)院植物研究所獲得，記載 在如下文獻(xiàn)中：Arabidopsis, a useful weed. Meyerowitz EM，Cell (1989) 56:263-270.) 的花，得到TO代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥。轉(zhuǎn)化方法如下：將重組菌50uL接種于50mL含35mg/L 利福平、50mg/L硫酸慶大霉素、50mg/L卡那霉素的YEB培養(yǎng)基中，28°C，160rpm搖至0D值 1. 5左右，離心收集菌體，用同體積的5%蔗糖重懸，并加入10uL助滲劑，將擬南芥花浸于重 旋液中浸泡1分鐘即可。完成浸花后用黑色塑料袋遮光1天，第二天恢復(fù)自然光照，得到το 代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥。
[0062] 將TO代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥自交，收集T1代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥種子，取100粒播種于 含有100 μ g/ml硫酸卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，將在上述含有100 μ g/ml硫酸卡那霉素的MS 培養(yǎng)基上抗性分離比為3 :1的T1代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的成活幼苗移至溫室培養(yǎng)，收集種子， 播種，共獲得3個T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥純合株系：0E10-4、0E26-3、0E31-2。
[0063] 2)轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的分子鑒定
[0064] 提取50天苗齡的上述3個T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥純合株系：0E10-4、0E26-3、 0E31-2的果莢的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA為模板，以SMPl-f2
[0065] 5 '-AGGATCCTTAAGGATGTCGGGAGCT-3,和 SMPl-r2
[0066] 5 '-TGAATTCCTTAAGCTGTGCCCGTG-3'為引物進(jìn)行RT-PCR，同時以未轉(zhuǎn)基因的野生 型擬南芥（WT)作為對照。
[0067] 內(nèi)參基因?yàn)?Actin，引物為 actinF:5 '-AGGAACACCCTGTTCTCCTGACTG-3'，actinR:5 '-CAGAGAAAGCACAGCCTGGATAG-3,。
[0068] PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性4min，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30 秒，共28個循環(huán)；最后再72°C延伸10分鐘；同時以actin基因做為內(nèi)參，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95°C預(yù)變性4min，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共28個循環(huán)；最后再 72 °C延伸10分鐘。
[0069] 對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，每組樣品進(jìn)行2次重復(fù)，結(jié)果如圖2所示， 可以看出，未轉(zhuǎn)基因的野生型擬南芥（WT)中沒有擴(kuò)增出條帶，T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥純合 株系：0E10-4、0E26-3、0E31-2中，皆有258bp目的基因 BhSMPl表達(dá)。進(jìn)一步證明，T2代轉(zhuǎn) BhSMPl擬南芥純合株系為陽性轉(zhuǎn)基因植株。
[0070] 采用同樣的方法，將空載體Binl9-35S-LEA-polyA轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，得到T0 代轉(zhuǎn)pBinl9擬南芥；將TO代轉(zhuǎn)pBinl9擬南芥收種、播種，直到得到T2代轉(zhuǎn)pBinl9擬南 芥。
[0071] 二、轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的耐旱研究
[0072] 檢測T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥種子萌發(fā)過程中對PEG8000耐受能力從而體現(xiàn)出其耐 旱：
[0073] 將收獲一月后的上述一獲得的3個株系T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥純合株系：0E10-4、 0E26-3、0E31-2、T2代轉(zhuǎn)pBinl9擬南芥和野生型擬南芥的種子分別均勻的撒播于含有15% (質(zhì)量百分含量)、20% (質(zhì)量百分含量）PEG8000的萌發(fā)盒中，4°C春化4天后，培養(yǎng)在22°C、 50%濕度、光照16h和黑暗8h的條件下，從培養(yǎng)開始第一天每天統(tǒng)計萌發(fā)率，5天后照相并 完成統(tǒng)計。實(shí)驗(yàn)共設(shè)三次重復(fù)，每次重復(fù)中每個株系200顆種子。
[0074] 結(jié)果如圖3所示，A為含15%PEG的萌發(fā)盒中擬南芥的萌發(fā)率統(tǒng)計圖，B為含20%PEG 的萌發(fā)盒中擬南芥的萌發(fā)率統(tǒng)計，C為含15%PEG的萌發(fā)盒中擬南芥的萌發(fā)照片；
[0075] T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥純合株系0E10-4在培養(yǎng)第1、2、3、4、5天的萌發(fā)率分別為 86. 91%、95. 92%、97. 83%、99. 85%、99. 85% ;
[0076] T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥純合株系0E26-3在培養(yǎng)第1、2、3、4、5天的萌發(fā)率分別為 75. 63%、89. 31%、90. 68%、94. 12%、94. 72% ;
[0077] T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥純合株系0E31-2在培養(yǎng)第1、2、3、4、5天的萌發(fā)率分別為 72. 13%, 86. 77%, 89. 77%, 97. 83%, 99. 03% ；
[0078] 野生型擬南芥（col)在培養(yǎng)第1、2、3、4、5天的萌發(fā)率分別為30·23%、46·85%、 55. 53%、61· 13%、62· 63%。
[0079] Τ2代轉(zhuǎn)pBinl9擬南芥和野生型擬南芥無顯著差異。
[0080] 從圖3中可以看出，T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥種子比野生型擬南芥相比，在PEG8000 的脅迫下，萌發(fā)率提高，說明T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥具有很強(qiáng)的耐PEG性，表明，T2代轉(zhuǎn) BhSMPl擬南芥具有很強(qiáng)的耐旱性。
[0081] 結(jié)果表明，T2代轉(zhuǎn)BhSMPl擬南芥的耐旱性明顯優(yōu)于野生型擬南芥，說明BhSMPl是 與植物耐旱相關(guān)的蛋白。
[0001] 序列表 〈11〇>中B科學(xué)院植物研究所 <120>+-種與植物耐旱相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用 <160〉 2 <210〉 1 <211>443 <212〉 DNA <213〉旋蒴苣苔（Soea A.ygrrmeirfca) <400> 1 tccgaagaac aatatcgaat ccagtttact gaaggatgtc gggagctcaa ggaacacagc 60 cgccggagtc gttcacagct acgacttacg agtcagtggg gagcggagat aacaagacgc 120 ggcttgatat ccggtccaag gaagatgagg gcggaatcaa gatcgataaa ttgcaagaaa 180 aggtggagga cgccgccggg aaaggaggtc cagtcttcgg cgcaggcaag gatgatgaca 240 aagglgacll ggglgccacg ggcacagcll aaggcgllea Iccaacltgc cgtgllgali 300 gcatgctctt gttetettea acgttttgtt ttgttccctt agtctgttca tgtcttgtgt 360 tgatgaattt ctcctgtaaa tgggctttcg gatcggccct tgtatccgaa ctccacgctc 420 gtaatgaact tgatttcctc agt 413 <210>2 <211>78 <212>PRT 〈213〉旋葡宦苔（Boea Jiygrcmetrica) <400> 2 Met Ser Gly Ala Gin Gly Thr Gin Pro Pro Glu Ser Phe Thr Ala Thr 1 5 10 15 Thr Tyr Glu Ser Val Gly Ser Gly Asp Asn Lys Thr Arg Leu Asp lie 20 25 30
[0002] Arg Ser Lys Glu Asp Glu Gly Gly lie Lys lie Asp Lys Leu Gin Glu 35 40 45 Lys Val Glu Asp Ala Ala Gly Lys Gly Gly Pro Val Phe Gly Ala Gly 50 55 60 Lys Asp Asp Asp Lys Gly Asp Leu Gly Ala Thr Gly Thr Ala 65 70 75
【權(quán)利要求】
1. 一種蛋白，是如下（a)或（b): (a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b) 將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且與植物耐逆性相關(guān)的由序列2衍生的蛋白質(zhì)。
2. 編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子。
3. 如權(quán)利要求2所述的DNA分子，其特征在于：所述DNA分子是如下（1)- (3)中任一 種的DNA分子： (1)編碼區(qū)為序列表中序列1自5'末端第36-272位核苷酸所示的DNA分子； (2 )在嚴(yán)格條件下與（1)限定的DNA序列雜交且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分 子； (3)與（1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、 至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同 源性且編碼與植物耐逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。
4. 含有權(quán)利要求2或3所述DNA分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5. 如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于： 所述重組載體為將權(quán)利要求2或3所述DNA分子替換掉表達(dá)載體 Binl9-35S-LEA-polyA中的LEA片段，得到表達(dá)權(quán)利要求1所述蛋白的重組載體。
6. 擴(kuò)增權(quán)利要求2或3所述DNA分子全長或其任意片段的引物對。
7. 權(quán)利要求1所述蛋白、權(quán)利要求2或3所述DNA分子或權(quán)利要求4所述重組載體、表 達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物耐逆性中的應(yīng)用； 所述耐逆性具體為耐旱性； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物。
8. -種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子導(dǎo)入目的植 物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于所述目的植物。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于：所述耐逆性為耐旱性； 所述編碼權(quán)利要求1所述蛋白的DNA分子通過權(quán)利要求4或5所述的重組載體導(dǎo)入目 的植物。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其特征在于： 所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
【文檔編號】C07K14/415GK104119430SQ201310149496
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月26日
【發(fā)明者】鄧馨, 李美靜 申請人:中國科學(xué)院植物研究所