專利名稱：多對二硫鍵定點環(huán)化固相合成多肽新工藝的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及多肽合成領域，更具體地說，本發(fā)明涉及一種多對二硫鍵定點環(huán)化固相合成多肽新工藝。
背景技術：
多肽傳統(tǒng)的氧化方法是在樹脂上把序列合成完后，用酸把產(chǎn)物裂解下來，然后用空氣氧化或者DMSO氧化，或者雙氧水或者典等氧化的方法。傳統(tǒng)氧化方法存在以下缺點:空氣氧化和DMSO氧化缺點是溶劑體積太大，氧化時間過長，一般是Img產(chǎn)物對I毫升的溶齊U，最后都要有幾百毫升的體積，氧化好后還要去除溶劑然后再純化。而且這兩種多肽氧化方法耗時很長，一般氧化用時2天左右，除溶劑也要兩天左右。所以在整個生產(chǎn)過程中，氧化這一步驟就要占用很大的比例。雙氧水或者碘氧化的方法雖然用時比較短，但是都有局限性，序列中如果含有甲硫氨酸或者天門冬氨酸就不能用雙氧水這種強氧化劑氧化，而且他對溶劑的酸堿度等也有要求。碘氧化步驟比較繁瑣而且產(chǎn)率不高，氧化后要馬上處理否則樣品會有變的可能性。二硫鍵環(huán)化多肽也有固相環(huán)化的方法，既一般是用特殊的巰基保護基(比如ACM，MMT等)在多肽序列合成完后用特殊物質(zhì)去除巰基的特殊保護，然后在樹脂上氧化，這樣的好處是氧化完成后直接切割拿到的產(chǎn)物就是所需要的最終產(chǎn)物，節(jié)約了大量的人力物力。上述的方法大部分只能合成單個二硫鍵的環(huán)化，對于目前比較復雜的多對二硫鍵的多肽的合成則沒有什么優(yōu)勢，本發(fā)明涉及多對二硫鍵的定點環(huán)化固相合成多肽的新工藝。其中運用了低成 本環(huán)保的單保護的多肽二硫鍵環(huán)化固相技術和傳統(tǒng)的特殊巰基保護基的二硫鍵環(huán)化技術。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種提高工作效率、降低了原料成本和人工成本的多對二硫鍵定點環(huán)化固相合成多肽新工藝。本發(fā)明的目的是通過下述技術方案實現(xiàn)的:一種多對二硫鍵定點環(huán)化固相合成多肽新工藝，所述的新工藝亦稱樹脂上氧化工藝，所述的新工藝按如下具體步驟如下:第一步，由于需要多對二硫鍵，所以適宜的多肽序列含有四個以上半胱氨酸殘基，將要配對的半胱氨酸殘基進行編號；第二步，將配對的半胱氨酸殘基選擇一對用單保護的半胱氨酸，一對用H-Cys (Acm) -0H, 一對用 H-Cys (MMT) -OH ；第三步，應用多肽固相合成技術將多肽序列固定在固相載體上，其中對應的半胱氨酸殘基采用單保護或者用H-Cys (Acm) -OH或者用H-Cys (MMT) -OH ；第四步，序列合成完成后，將樹脂載體浸泡在有機溶劑中，然后添加氧化劑，將序列中兩個單保護的半胱氨酸殘基的-SH氧化，形成二硫鍵；第五步，用砂芯濾柱過濾掉溶劑，用純DCM和DMF清洗樹脂；
第六步，將樹脂加入含有I %的脫除劑的有機溶劑的容器中，進行其中兩個半胱氨酸殘基保護基的特異性去除；第七步，用砂芯濾柱過濾溶劑用ELLMAN試劑檢測，用純DCM和DMF清洗樹脂；第八步，將樹脂載體浸泡在有機溶劑中，添加氧化劑，將已去除-HS保護基的兩個半胱氨酸殘基的-SH氧化，形成二硫鍵；第九步，用砂芯濾柱過濾掉溶劑，用純DCM和DMF清洗樹脂；第十步，用ELLMAN試劑檢測，查看反應是否完全，對比本發(fā)明和常規(guī)工藝的兩對二硫鍵氧化肽合成的優(yōu)劣。與現(xiàn)有技術先比，本發(fā)明具有以下有益效果:節(jié)省時間、提高工作效率、降低了原料成本和人工成本。
具體實施例方式下面將通過實施例對本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容作進一步的詳細描述:經(jīng)過實驗驗證本氧 化方法在多肽固相有機合成中的實用性、有效性和先進性。實施例:合成一條序列為DKCYGLACASCEFEPCLL的肽，序列中兩端兩個半胱氨酸之間形成一對二硫鍵，中間兩個半胱氨酸之間形成一對二硫鍵。原理:通過載體固定序列的羧基端，按照順序合成，待合成完序列后在把序列從載體上裂解下來之前，讓序列中兩個半胱氨酸上的巰基通過一定的技術手段形成二硫鍵，并計算收率。準備工作:配置茚三酮檢測試劑20ml，20%的六氫吡啶脫帽液，DMF, DCM,甲醇，配
置好的三氟乙酸裂解液。其它原料:Fmoc-Leu_wang樹脂，HBTU, DIEA, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Cys-OH,Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Arg (pbf) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu (Otbu) -OH, Fmoc-Ser (Tbu) -0H,Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(Otbu)-OH, Fmoc-Cys(MMT) -OH, Fmoc-Tyr(Tbu)-OH, Fmoc-Giy-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Ala-OH.
實驗步驟:I。精確稱取擔載量為0.5的Fmoc-Leu-wang樹脂1G，投入定制的反應柱中，然后再在反應柱中加入IOML的DCM，浸泡十分鐘，待樹脂完全膨脹開，抽掉DCM。2.向反應柱中加入IOml的配置好的20%的六氫吡啶，反應十分鐘，然后抽掉反應液，重復兩次，目的是完全去除Fmoc,反應完成后用DCM和DMF反復交替清洗樹脂把殘留的六氫吡啶洗掉。洗完后用茚三酮檢測樹脂上是否有游離的氨基。3.精確稱取 Fmoc-Leu-OH0.7g，HBTU0.4g，用 4ml 的 DMF 溶解好后，加入 0.5ml 的DIEA，混合均勻后投入2步驟的反應柱中，用氮氣鼓泡攪拌，反應30，min后抽掉反應液，清洗樹脂。取幾粒樹脂裝入小試管中，然后在小試管中加入少量事先配置好的茚三酮檢測試齊U，加熱3min無色則說明反應已經(jīng)完全，然后加入IOml的配置好的20%的六氫吡啶，去除Fmoc,方法同步驟2。4.精確稱取 Fmoc-Cys-OH0.5g，HBTU0.6g，用 4ml 的 DMF 溶解好后，加入 0.5ml 的DIEA，混合均勻后投入反應柱中，然后加入少許抗氧化劑，用氮氣鼓泡攪拌，反應30min后抽掉反應液，清洗樹脂，檢測，無色則，去除Fmoc保護基，檢測有藍紫色。5.精確稱取 Fmoc-Pro-OH0.51g, HBTU0.6g,用 4mlDMF 溶解，加入 0.5ml 的 DIEA，混合均勻投入反應柱，加入少許抗氧化劑，反應30min后抽掉反應液，清洗樹脂，檢測，無色則去除Fmoc保護基，檢測有藍紫色。6.同理，按照多肽序列中氨基酸殘基的次序由C端往N端依次鏈接，在第二個第三個半胱氨酸殘基的時候用Fmoc-Cys(MMT),最右端的半胱氨酸殘基用Fmoc-Cys-OH7.待序列合成完成后，用甲醇沖洗樹脂，抽干，配置含有氧化劑的有機溶劑，將樹脂投入溶劑中進行第一個二硫鍵的環(huán)化，期間用Ellman試劑進行監(jiān)控，待檢測無色時將溶劑濾掉。然后用DCM清洗樹脂。8.配置含有I %冰醋酸的DCM溶劑，將樹脂投入溶劑中反應60min。將剩余的兩個保護氨基酸的側鏈-HS的保護基去除，然后濾掉溶劑，DM清洗，加入7中的氧化劑進行第二對二硫鍵的環(huán)化，期間用Ellman試劑進行監(jiān)控，待檢測無色時將溶劑濾掉。然后用DCM清洗樹脂。9.抽干，倒入50ML離心管中，倒入配置好的切割液比例約為IOml每克樹脂，需要注意的是切割液中不要加硫醇。10.將離心管放在恒溫振蕩器上，震蕩2h。11.用砂芯漏斗過濾掉樹脂，得到濾液，然后往濾液中加入乙醚，比例是每ml濾液加20ml乙醚，目的是將產(chǎn)物析出，
12.離心。去掉上清液即得到粗品。13.經(jīng)分離提純，凍干等步得到最終合格的產(chǎn)品。結論:經(jīng)MS，HPLC，等鑒定產(chǎn)物與用傳統(tǒng)方法環(huán)化得到的產(chǎn)物結構相同，具有相同的生物活性,但是產(chǎn)率比傳統(tǒng)方法提高了 15個百分點。時間成本，原料成本，人工成本等都顯著減少。
權利要求
1.一種多對二硫鍵定點環(huán)化固相合成多肽新工藝，所述的新工藝亦稱樹脂上氧化工藝，其特征在于，所述的新工藝按如下具體步驟如下: 第一步，由于需要多對二硫鍵，所以適宜的多肽序列含有四個以上半胱氨酸殘基，將要配對的半胱氨酸殘基進行編號； 第二步，將配對的半胱氨酸殘基選擇一對用單保護的半胱氨酸，一對用H-Cys (Acm) -OH, 一對用 H-Cys (MMT) -OH ； 第三步，應用多肽固相合成技術將多肽序列固定在固相載體上，其中對應的半胱氨酸殘基采用單保護或者用H-Cys (Acm) -OH或者用H-Cys (MMT) -OH ； 第四步，序列合成完成后，將樹脂載體浸泡在有機溶劑中，然后添加氧化劑，將序列中兩個單保護的半胱氨酸殘基的-SH氧化，形成二硫鍵； 第五步，用砂芯濾柱過濾掉溶劑，用純DCM和DMF清洗樹脂； 第六步，將樹脂加入含有I %的脫除劑的有機溶劑的容器中，對其中兩個半胱氨酸殘基保護基的特異性去除； 第七步，用砂芯濾柱過濾溶劑，用ELLMAN試劑檢測，用純DCM和DMF清洗樹脂； 第八步，將樹脂載體浸泡在有機溶劑中，添加氧化劑，將已去除-HS保護基的兩個半胱氨酸殘基的-SH氧化，形成二硫鍵； 第九步，用砂芯濾柱過濾掉溶劑，用純DCM和DMF清洗樹脂； 第十步，用ELLMAN試劑檢測，查看反應是否完全，對比本發(fā)明和常規(guī)工藝的兩對二硫鍵氧化肽合成的優(yōu)劣。
全文摘要
本發(fā)明公開了多肽合成領域的一種多對二硫鍵定點環(huán)化固相合成多肽新工藝，該工藝共有十個步驟將配對半胱氨酸殘基編號；選擇三對配對的半胱氨酸殘基；將多肽序列固定在固相載體上；浸泡樹脂、添加氧化劑、形成二硫鍵；過濾溶劑、清洗樹脂；去除半胱氨酸殘基中的特異性；過濾溶劑、檢測、清洗樹脂；浸泡樹脂、添加氧化劑、形成二硫鍵；過濾溶劑、清洗樹脂；用試劑檢測、對比本發(fā)明與常規(guī)工藝的優(yōu)劣。本發(fā)明具有節(jié)省時間、提高工作效率、降低了原料成本和人工成本的優(yōu)點。
文檔編號C07K1/04GK103214550SQ20131007996
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月14日 優(yōu)先權日2013年3月14日
發(fā)明者王錫平 申請人:蘇州強耀生物科技有限公司