基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體和應(yīng)用的制作方法

專利名稱：基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體及其在體外制備庚型肝炎病毒中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
庚型肝炎病毒(GB virus C，GBV-C)發(fā)現(xiàn)于二十世紀(jì)九十年代中期，屬于黃病毒科、單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約9.4kb。庚型肝炎病毒最大的特點(diǎn)在于其本身沒有致病性，但是和HIV共感染患者中，GBV-C的存在有益于HIV患者的疾病進(jìn)程，即延緩HIV患者的病程、延長(zhǎng)HIV患者的壽命和降低死亡率，具體表現(xiàn)為GBV-C和HIV共感染患者與HIV單感染患者相比，⑶4細(xì)胞數(shù)目明顯增加且HIV的病毒載量明顯下降。然而，研究報(bào)道，不同基因型的GBV-C對(duì)HIV的影響存在差異，其中2型和5型的GBV-C對(duì)HIV-1的作用更為明顯。根據(jù)基因序列同源性，目前GBV-C可分為六種基因型，各基因型具有典型的地域分布特征。其中GBV-C I型主要流行于非洲的西部，GBV-C 2型主要流行于歐洲和北美洲，GBV-C 3型流行于亞洲的中國(guó)和日本，GBV-C 4型流行于東南亞的緬甸和越南等地，GBV-C5型流行于非洲的南部和中部，于2006年新發(fā)現(xiàn)的GBV-C 6型主要流行于東南亞的印度尼西亞等地。云南省地處我國(guó)西南邊陲，與東南亞多國(guó)接壤，Btt鄰全球最大的毒品生產(chǎn)地一一金三角地區(qū)，是毒品運(yùn)輸?shù)闹匾緩?。研究表明，毒品的運(yùn)輸與病毒的傳播和基因型的演變直接相關(guān)。此外，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)，血緣性病毒的傳播途徑和毒品運(yùn)輸路徑直接相關(guān)，云南省因此成為HIV-1和HCV傳入我國(guó)，并向其他省份傳播的源頭地區(qū)。近期我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云南地區(qū)存在著又一種新的GBV-C基因型，并命名為7型。經(jīng)臨床指標(biāo)比較分析發(fā)現(xiàn)，7型GBV-C可以明顯的降低HIV患者的病毒載量和提高其⑶4細(xì)胞。到目前為止 ，就GBV-C于HIV之間的相互作用機(jī)制不清楚，其研究手段多采用GBV-C部分短肽在細(xì)胞水平進(jìn)行研究，該方法局限性較大且研究?jī)r(jià)值不明顯。其主要瓶頸在于沒有較好的GBV-C體外培養(yǎng)體系。鑒于本課題新發(fā)現(xiàn)的7型GBV-C及臨床指標(biāo)分析的結(jié)果，結(jié)合成熟的HCV體外培養(yǎng)體系的構(gòu)建方法和經(jīng)驗(yàn)。本發(fā)明旨在構(gòu)建7型GBV-C的感染性克隆載體，進(jìn)而構(gòu)建GBV-C的體外培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步研究GBV-C與HIV-1之間的作用機(jī)制，提供必備的工具，對(duì)今后GBV-C和HIV-1共感染情況下的疾病慢性化機(jī)制研究具有較大的科學(xué)意義和潛在應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體，該載體含有基因型7型庚型肝炎病毒基因，基因型7型庚型肝炎病毒基因來源于基因型7型庚型肝炎病毒，其在GenBank登錄號(hào)為HQ331233，該載體中7型庚型肝炎病毒基因5’端具有T7啟動(dòng)子區(qū)基因，3’端具有T7終止子區(qū)基因。本發(fā)明另一目的是將基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體應(yīng)用在體外制備庚型肝炎病毒中，利用構(gòu)建好的基因型7型庚型肝炎病毒感染性克隆載體，在正常人的PBMC細(xì)胞中驗(yàn)證了庚型肝炎病毒的產(chǎn)毒能力，并繪制了不同時(shí)間產(chǎn)毒的動(dòng)力學(xué)曲線。本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的:
1、根據(jù)7型GBV-C全基因組序列設(shè)計(jì)巢式PCR擴(kuò)增引物，其擴(kuò)增片段共計(jì)13段，每一擴(kuò)增片段的引物序列及擴(kuò)增片段大小如下:
片段一:
OlFl:CTGAATTC GACGTGGGGGGGTTGATCOlRl:CCACTGGTCCTTGTCAACTCG01R2: CAAGAGAGACATTGAAGGGCGAC擴(kuò)增片段大小為:229bp ；
片段二:
02F1: GGTTGGTAGGTCGTAAATCCCG02R1:AATGCCACCCGCCCTCA02F2:GTAGGTCGTAAATCCCGGTCA02R2:CGAAGGTTCTTGGGCTACC擴(kuò)增片段大小為:378bp;
片段三:
03F1: TCCACGTCGCCCTTCAATGT 03R1:GGAAGCAAACCAAGACACGGATC03F2:CGTCGCCCTTCAATGTCTCTCTT03R2:CCACTGATTTTGTCCGTGGCTC擴(kuò)增片段大小為:1061bp;
片段四:
04F1:GCGTCCTCACTGTGGGAGTTG04R1 =GGATCATACTSACGACGGGffAGG04F2:TGGGAGAGTGAGTTTTGGAGATGG04R2:GGAGRAGTATAAGCGGGACCAAC擴(kuò)增片段大小為:1300bp;
片段五:
05F1:GTCCTACACCATGACCAAGATCC05R1: CGACAYTCCGTCCTAGTGAAffG05F2:TGAAATGTCCCACYCCTGCC05R2:TCRCCAGCCATCACACARC擴(kuò)增片段大小為:1063bp;
片段六:
06F1: CGTGGTGYAARGGRTAYCAGG06R1:GTCTCAATGATGGANGGGTGCTG06F2:GAYGCYGTRATGHTGGTGGTG06R2:GCCTAGGGTTGGCAAGRAAC擴(kuò)增片段大小為:1273bp;
片段七:
07F1:GAATGCTSGTGTCMGTGCTTCAYTC07R1: CATCCCARTCTGTHACCACCAC07F2:CATGGGSCACAARGTCCTBAT07R2 =GASCCRGTGTAffGACGCRTAGATCAT擴(kuò)增片段大小為:1302bp;
片段八:
08F1: TGGGTGTTCAGCGGACSATGT08R1:AGRCAGCGRCTYTCCACATG08F2:CCRAATCCTGTCCCRYTACTGC08R2:CARTGCCACAAAGGDAGYGAC擴(kuò)增片段大小為:1262bp;
片段九:
09F1: TCAGCffAACAACTCffGGCACT09R1: TCTGAGCTGCTCTCCGTAACC09F2:TGYATYCCRGACAGYTAYTTCCAAC09R2:CGAGATAAGTGCAGGCGATGG擴(kuò)增片段大小為:963bp;
片段十:
IOFl:TCCARGCBATHGAGAATGCTGIORl:TGRTTKGGGGTGTACTGGAAGGC10F2: TGTCATCATGGAGGAYTGYAGTACAC10R2:CCTTCTCCTCCTTffCGGTCT擴(kuò)增片段大小為:965bp;
片段十一:
IlFl:GAGGAGGCAATAAGGACTGTYAGIlRl:CCACGATGATGTTRGGCAGTT11F2: CAATAAGGACTGTHAGGCCRC11R2:ACTTGTAGTARTTRCCATGHACCTG擴(kuò)增片段大小為:1047bp;
片段十二:
12F1: CATGTCSAGYGAGTACAGTGAYCC12R1: TTAGTAACCACCATGCCTCCCAAG12F2 =GAGTACAGYGAYCCffATGGCT12R2:GCYACGATGAGCAGGGYTAAG擴(kuò)增片段大小為:542bp;
片段十二:
13F1: GYCAGGTKCATGGYAAYTACTACAAGT13R1: CGTCTAGAAGTAGAACCCGGCCTTTGG13F2: CGCAGACACAACYAAAACMAAAATG擴(kuò)增片段大小為:642bp ；
片段一對(duì)應(yīng)病毒基因組-420 -191;片段二對(duì)應(yīng)病毒基因組-414 -37;片段三對(duì)應(yīng)病毒基因組-214 846;片段四對(duì)應(yīng)病毒基因組409 1708;片段五對(duì)應(yīng)病毒基因組1328 2390;片段六對(duì)應(yīng)病毒基因組2245 3517;片段七對(duì)應(yīng)病毒基因組3330 4631;片段八對(duì)應(yīng)病毒基因組4441 5702;片段九對(duì)應(yīng)病毒基因組5467 6429;片段十對(duì)應(yīng)病毒基因組6324 7288;片段i^一對(duì)應(yīng)病毒基因組7100 8146;片段十二對(duì)應(yīng)病毒基因組7978 8519;片段十三對(duì)應(yīng)病毒基因組8120 8844。2、在已確診的基因型7型GBV-C病人血漿中提取病毒RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA ；
3、以步驟2中所獲得的GBV-C的cDNA為模板，采用步驟I中設(shè)計(jì)的引物，應(yīng)用巢式PCR方法，將病毒全基因組分為13個(gè)片段分別進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增；
4、對(duì)13個(gè)PCR擴(kuò)增片段膠回收進(jìn)行純化；
5、對(duì)已純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序；
6、將測(cè)序結(jié)果，利用Blast進(jìn)行比對(duì)，比對(duì)結(jié)果無誤后，對(duì)上述獲得的13段PCR產(chǎn)物，利用重疊PCR技術(shù)進(jìn)行拼接，其策略如下:
(O以片段一和片段二進(jìn)行拼接，其拼接產(chǎn)物與片段三進(jìn)行拼接，片段一、二和三拼接產(chǎn)物與片段四進(jìn)行拼接獲得P(l-2-3-4);以片段五和六拼接獲得拼接產(chǎn)物P (5-6);然后將P(l-2-3-4)和P (5-6)進(jìn)行拼接獲得拼接產(chǎn)物P(l-2-3-4-5-6)。
·
(2)以片段七和八進(jìn)行拼接獲得拼接產(chǎn)物P(7_8);以片段九和十進(jìn)行拼接獲得產(chǎn)物P(9-10);以片段十二和十三進(jìn)行拼接，其拼接產(chǎn)物再與片段十一進(jìn)行拼接獲得拼接產(chǎn)物P(ll-12_13);然后以片段P(9-10)和P(ll_12_13)進(jìn)行拼接獲得拼接產(chǎn)物P(9-10-11-12-13);最后完成P(7-8)和P(9-10-11-12-13)的拼接獲得拼接產(chǎn)物P(7-8-9-10-11-12-13)。(3)分別對(duì)拼接好的兩個(gè)大片段P(l-2-3-4-5-6)和P (7-8-9-10-11-12-13)進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)比對(duì)分析無誤后完成以上兩片段的拼接，從而獲得GBV-C的全長(zhǎng)基因組序列。7、在步驟6中所得GBV-C全基因組序列的5’端和3’段分別引入了 EcoRl和Xbal的酶切位點(diǎn)，分別對(duì)載體pBluescript II (SK+)和GBV-C全長(zhǎng)基因進(jìn)行以上兩個(gè)限制性內(nèi)切酶的酶切和連接最后獲得含基因型7型GBV-C全長(zhǎng)基因組的感染性克隆載體。本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果:
目前已有庚型肝炎病毒2型和3型毒株感染性克隆載體構(gòu)建的相關(guān)報(bào)道，但是利用以上質(zhì)粒制備的病毒毒力較差、感染性不強(qiáng)且很難在體外制備大量病毒株，因此未應(yīng)用于庚型病毒研究中，本發(fā)明基于該課題組在云南地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)并命名的基因型7型庚型肝炎病毒的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了該感染性克隆質(zhì)粒，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該毒株的感染性克隆質(zhì)粒與已報(bào)道的其它質(zhì)粒相比，通過該質(zhì)粒經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后可產(chǎn)生，病毒載量高達(dá)106-107COpies/ml的病毒，且該病毒具有較好的感染性，因此利用該質(zhì)粒構(gòu)建的庚型肝炎病毒，制備高毒力、高感染力、可重復(fù)性和可操作的GBV-C病毒，為今后開展庚型肝炎病毒的研究提供了良好的工具。


圖1是本發(fā)明中基因型7型GBV-C全基因組13個(gè)擴(kuò)增片段的重組PCR拼接示意 圖2是本發(fā)明中基因型7型GBV-C全基因組13個(gè)PCR擴(kuò)增片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果示意 圖3本發(fā)明中基因型7型GBV-C全基因組9.4kb經(jīng)重疊PCR拼接后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果示意 圖4是本發(fā)明中基因型7型GBV-C全基因組克隆入pBluescript II (SK+)質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒pBluescript-GBV-C 7的構(gòu)建示意 圖5是本發(fā)明中利用7型GBV-C全基因組感染性克隆質(zhì)粒在人PBMC細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)后，利用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)產(chǎn)毒能力的檢測(cè)示意圖，圖中:M0L=1表示RNA質(zhì)量:脂質(zhì)體體積=1:1，M0L=2表示RNA質(zhì)量:脂質(zhì)體體積=2:1。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中方法如無特殊說明的采用常規(guī)方法，使用的實(shí)際如無特殊說明的使用常規(guī)市售試劑或按常規(guī)方法配置的試劑。實(shí)施例1:基因型7型GBV-C感染者血漿中病毒RNA的提取
病毒 RNA 的提取參照 Highpure Viral Nueleie Aeid Kit (Roche, Germany)說明書進(jìn)行，具體操作步驟如下: (1)在200μ I血漿中加入200 μ I結(jié)合緩沖液(已添加poly A載體RNA)和50 μ I蛋白酶K，立即混合均勻，72°C水浴保溫10 min后再加入100 μ I結(jié)合緩沖液并混合均勻；
(2)將聞純度提取柱和收集管組裝在一起，將如一步處理過的樣品加到聞純度提取柱中，8000g 離心 I min;
(3)棄去收集管和廢液，將高純度提取柱裝入新的收集管中，在提取柱中加入500μ I去除抑制子緩沖液，8000g離心I min ；
(4)棄去收集管和廢液，將高純度提取柱裝入新的收集管中，在提取柱中加入450μ I洗漆緩沖液，8000g離心I min;
(5)重復(fù)上一步操作；
(6)棄去廢液13，000離心30s；
(7)棄去收集管和廢液，將高純度提取柱裝入新的1.5mL EP管中，在提取柱中加入50 μ I洗脫緩沖液，8000g離心I min，獲得的HCV RNA儲(chǔ)存-80°C，待用。本實(shí)例提取的RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均能檢測(cè)到5s、18sRNA和28sRNA三條清晰條帶的存在，且分光光度計(jì)0D260/280讀值為1.82。因此，本實(shí)例提取的RNA純度較好，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例2 =GBV-C cDNA的合成
(1)向PCR 反應(yīng)管中加入 2 μ I Random Primers (隨機(jī)引物)(500 μ g/ml,Promega),再加入10 μ I的RNA溶液，混勻后95°C水浴5min，立即冰浴3min ；
(2)向反應(yīng)管中繼續(xù)加入4 μ I 的 5XRT Buffer,2 μ I dNTP Mixture (各 10mM)、含有20U的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和20U的RNA酶抑制劑的反應(yīng)液8 μ 1，緩慢混勻；
(3)在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，其程序?yàn)?37°C 60 min，95°C 5 min。通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備了高質(zhì)量的cDNA，為后續(xù)PCR反應(yīng)提供了模板。實(shí)施例3 =GBV-C的13個(gè)片段PCR反應(yīng)
本擴(kuò)增采用了巢式PCR技術(shù)，其特點(diǎn)在于分兩輪PCR進(jìn)行反應(yīng)，其中第一輪PCR產(chǎn)物作為第二輪PCR的模板，13段擴(kuò)增片段的引物序列及擴(kuò)增片段大小如下:
片段一:
OlFl:CTGAATTC GACGTGGGGGGGTTGATCOlRl:CCACTGGTCCTTGTCAACTCG01R2: CAAGAGAGACATTGAAGGGCGAC擴(kuò)增片段大小為:229bp ；
片段二:
02F1: GGTTGGTAGGTCGTAAATCCCG02R1:AATGCCACCCGCCCTCA02F2:GTAGGTCGTAAATCCCGGTCA02R2:CGAAGGTTCTTGGGCTACC擴(kuò)增片段大小為:378bp;
片段三:
03F1: TCCACGTCGCCCTTCAATGT03R1:GGAAGCAAACCAAGACACGGATC03F2:CGTCGCCCTTCAATGTCTCTCTT03R2:CCACTGATTTTGTCCGTGGCTC擴(kuò)增片段大小為:1061bp;
片段四:
04F1:GCGTCCTCACTGTGGGAGTTG04R1 =GGATCATACTSACGACGGGffAGG04F2:TGGGAGAGTGAGTTTTGGAGATGG04R2:GGAGRAGTATAAGCGGGACCAAC擴(kuò)增片段大小為:1300bp;
片段五:
05F1:GTCCTACACCATGACCAAGATCC05R1: CGACAYTCCGTCCTAGTGAAffG05F2:TGAAATGTCCCACYCCTGCC05R2:TCRCCAGCCATCACACARC擴(kuò)增片段大小為:1063bp;
片段六:
06F1: CGTGGTGYAARGGRTAYCAGG06R1:GTCTCAATGATGGANGGGTGCTG06F2:GAYGCYGTRATGHTGGTGGTG06R2:GCCTAGGGTTGGCAAGRAAC擴(kuò)增片段大小為:1273bp;
片段七:
07F1:GAATGCTSGTGTCMGTGCTTCAYTC07R1: CATCCCARTCTGTHACCACCAC07F2:CATGGGSCACAARGTCCTBAT07R2 =GASCCRGTGTAffGACGCRTAGATCAT擴(kuò)增片段大小為:1302bp;
片段八:
08F1: TGGGTGTTCAGCGGACSATGT08R1:AGRCAGCGRCTYTCCACATG08F2:CCRAATCCTGTCCCRYTACTGC08R2:CARTGCCACAAAGGDAGYGAC擴(kuò)增片段大小為:1262bp;
片段九:
09F1: TCAGCffAACAACTCffGGCACT09R1: TCTGAGCTGCTCTCCGTAACC09F2:TGYATYCCRGACAGYTAYTTCCAAC09R2:CGAGATAAGTGCAGGCGATGG擴(kuò)增片段大小為:963bp;
片段十:
IOFl:TCCARGCBATHGAGAATGCTGIORl:TGRTTKGGGGTGTACTGGAAGGC10F2: TGTCATCATGGAGGAYTGYAGTACAC10R2:CCTTCTCCTCCTTffCGGTCT擴(kuò)增片段大小為:965bp;
片段十一:
IlFl:GAGGAGGCAATAAGGACTGTYAGIlRl:CCACGATGATGTTRGGCAGTT11F2: CAATAAGGACTGTHAGGCCRC11R2:ACTTGTAGTARTTRCCATGHACCTG擴(kuò)增片段大小為:1047bp;
片段十二:
12F1: CATGTCSAGYGAGTACAGTGAYCC12R1: TTAGTAACCACCATGCCTCCCAAG12F2 =GAGTACAGYGAYCCffATGGCT12R2:GCYACGATGAGCAGGGYTAAG擴(kuò)增片段大小為:542bp;
片段十二:13F1: GYCAGGTKCATGGYAAYTACTACAAGT13R1: CGTCTAGAAGTAGAACCCGGCCTTTGG13F2: CGCAGACACAACYAAAACMAAAATG擴(kuò)增片段大小為:642bp ；
(I)第一輪PCR反應(yīng)
該P(yáng)CR擴(kuò)增弓丨物序列如上所示，該輪PCR反應(yīng)均采用各片段的Fl和Rl引物(外圍引物)，具體反應(yīng)試劑和條件如下:
以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如下:cDNA 5 μ 1、各GBV-C片段的外圍引物(Fl 和 Rl)各 1μ 1(25 pmol/μ I) UOXPCR Bufer 5 μ I, dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ I, TaqDNA聚合酶(2.5 U/μ I) I μ 1，加入H2O補(bǔ)齊總體積至50 μ I ；PRC擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性3 min ;94°C變性 30s，50°C退火 30 s，72°C延伸 2min，共 40 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min。(2)第二輪 PCR 反應(yīng)
該P(yáng)CR擴(kuò)增弓丨物序列如上所示，該輪PCR反應(yīng)均采用各片段的F2和R2引物(內(nèi)圍引物)，具體反應(yīng)試劑和條件如下:
以合成的第一輪PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，體系如下:第一輪PCR產(chǎn)物5 μ 1、HCV6u 基因型內(nèi)側(cè)引物各 I μ I (25 pmol/μ I)、10XPCR Bufer 5 μ 1、dNTP (2.5mmol/L) 4 μ 1、Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μ I) I μ 1，加入 H2O 補(bǔ)齊總體積至 50 μ I。PRC擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性4 min ;94°C變性45 s，52°C退火40 s，72°C延伸40s，共30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。本實(shí)驗(yàn)分十三段PCR片段完成GBV-C全基因組9.4kb序列的擴(kuò)增，十三個(gè)不同片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，各片段擴(kuò)增條帶清晰，片段大小與預(yù)計(jì)一致(如圖2所示)。實(shí)施例4: PCR產(chǎn)物的純化
使用DNA Gel Extraction Kit (BBI, USA)完成PCR產(chǎn)物的純化，按說明書操作進(jìn)行，具體操作步驟如下:
(1)配制1%瓊脂糖凝膠，將上述PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，80伏電壓電泳45min；
(2)在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖膠塊，放入新的1.5mlEP管中；
(3)按每400μ l/100mg瓊脂糖凝膠的比例加入Binding Buffer,置于50 60°C水浴中IOmin,使膠徹底融化；
(4)將融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到套放于收集管內(nèi)的純化柱中，室溫放置2min，8000rpm離心Imin ；
(5)取下純化柱，倒掉收集管中的廢液，將純化柱放入同一個(gè)收集管中，加入500μ IWash Solution, 8000rpm 室溫離心 Imin ；
(6)重復(fù)步驟(5)—次;
(7)取下純化柱，倒掉收集管中的廢液，將純化柱放入同一個(gè)收集管中，12，OOOrpm室溫尚心15s ；
(8)將純化柱放入一個(gè)新的1.5ml EP管中，在柱子膜中央加入30 μ I Elution Buffer或水(pH>7.0)，室溫或37°C放置2min ；
(9)12, OOOrpm室溫離心lmin，純化的PCR產(chǎn)物儲(chǔ)存于_70°C，待用。
本實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增的十三PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，去除了部分雜條帶，提高了 DNA的濃度和純度，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了保障。實(shí)施例5:核酸序列測(cè)定
本發(fā)明中所有PCR產(chǎn)物測(cè)序，均委托深圳華大基因測(cè)序服務(wù)有限公司完成，測(cè)序結(jié)果利用Chromos和BioEdit軟件進(jìn)行序列處理和編輯。核酸序列測(cè)定后，與預(yù)計(jì)的GBV-C 7型序列進(jìn)行了序列比對(duì)，結(jié)果顯示序列相似度為100%，在PCR擴(kuò)增中沒有任何基因突變的堿基。實(shí)施例6:利用重疊PCR技術(shù)對(duì)庚型肝炎病毒全基因組序列的拼接 1、第一輪片段的拼接
本發(fā)明中擴(kuò)增的13個(gè)片 段，每相鄰兩片段均有近200bp的重疊序列，根據(jù)以下重疊方式完成重疊PCR反應(yīng)。(I)取片段一和片段二的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以O(shè)lFl和02R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P1-2 ；
(2)取片段三和片段四的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以03F2和04R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P3-4 ；
(3)取片段五和片段六的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以05F2和06R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P5-6 ；
(4)取片段七和片段八的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以07F2和08R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P7-8 ；
(5)取片段九和片段十的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以09F2和10R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P9-10 ；
(6)取片段十二和片段十三的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以12F2和13R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P12-13。上述PCR反應(yīng)體系如下:PCR產(chǎn)物等量混合物(含兩種PCR產(chǎn)物各5ng) 5 μ 1、引物各 I μ 1(25 pmol/μ I) UOXPCR Bufer 5 μ l.dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ l.pfu DNA 聚合酶(2.5υ/μ1) I μ 1，加入H2O補(bǔ)齊總體積至50 μ I。PRC擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性4 min ;94°C變性45 s，50°C退火lmin，72°C延伸3min,共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。2、第二輪片段的拼接
(1)取P1-2和P3-4的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以O(shè)lFl和04R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P1-2-3-4 ；
(2)取P7-8和P9-10的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以07F2和10R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P7-8-9-10 ；
(3)取片段i^一和P12-13的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以11F2和13R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P11-12-13 ；
上述PCR反應(yīng)體系如下:PCR產(chǎn)物等量混合物(含兩種PCR產(chǎn)物各5ng) 5 μ 1、引物各I μ 1(25 pmol/μ I) UOXPCR Bufer 5 μ 1、dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ l.pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μ I) I μ 1，加入H2O補(bǔ)齊總體積至50 μ I。PRC擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性4 min ;94°C變性45 s，50°C退火lmin，72°C延伸4min,共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。3、第三輪片段的拼接
(I)取P1-2-3-4和P5-6的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以O(shè)lFl和06R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P1-2-3-4-5-6。(2)取P7-8-9-10和P11-12-13的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以07F21和13R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段P7-8-9-10-11-12-13。上述PCR反應(yīng)體系如下:PCR產(chǎn)物等量混合物(含兩種PCR產(chǎn)物各5ng) 5 μ 1、引物各 I μ 1(25 pmol/μ I) UOXPCR Bufer 5 μ l.dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ l.pfu DNA 聚合酶(2.5 U/μ I) I μ 1，加入H2O補(bǔ)齊總體積至50 μ I。PRC擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性4 min ;94°C變性45s，50°C退火lmin，72°C延伸5min,共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min
4、測(cè)序鑒定
將拼接后獲得的P1-2-3-4-5-6和P7-8-9-10-11-12-13全長(zhǎng)測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)無誤后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。5、第四輪片段的拼接
取P1-2-3-4-5-6和P7-8-9-10-11-12-13的PCR產(chǎn)物等量混合作為模板，以O(shè)lFl和13R2為引物，通過重疊PCR反應(yīng)獲取兩片段的拼接產(chǎn)物，經(jīng)膠回收純化后獲得片段GBV-C全基因組序列的拼接片段(見圖1)。 上述PCR反應(yīng)體系如下:PCR產(chǎn)物等量混合物5 μ I (各5ng)、引物各I μ I (25pmol/ μ I) UOXPCR Bufer 5 μ l.dNTP (2.5 mmol/L) 4 μ \、pfu DNA聚合酶(2.5 U/μ I)I μ I，加入H2O補(bǔ)齊總體積至50 μ I。PRC擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)變性4 min ;94°C變性45s，50°C退火 lmin，72°C延伸 7min，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min。經(jīng)重疊PCR反應(yīng)后，本實(shí)驗(yàn)中的13個(gè)片段兩兩拼接，最終拼接成長(zhǎng)度為9.4kb的GBV-C全基因組的大片段，拼接后PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，條帶清晰，片段大小一致(圖3所示)，說明本次重疊PCR反應(yīng)成功。實(shí)施例7:基因型7型庚型肝炎病毒克隆載體的構(gòu)建 1、拼接產(chǎn)物和載體的酶切連接反應(yīng)
分別取實(shí)施例6中所獲得的GBV-C全長(zhǎng)DNA和pBluescript II (SK+)質(zhì)粒各15uL(lug)，加入酶切緩沖液2uL、EcoRI和XbaI各2uL，37°C條件下酶切4h，經(jīng)膠回收純化后，分別取 GBV-C 全長(zhǎng) DNAIOuL (15ng)和 pBluescript II (SK+)質(zhì)粒 2uL(3ng)混合均勻后，加入2uL連接緩沖液和1.5uL連接酶混合均勻后16°C連接12h。2、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a
在IOOuL感受態(tài)細(xì)胞中，加入與載體連接好的DNA 5uL，冰浴30min，42°C熱休克90s，再冰浴2min，然后加入400 uL 37°C預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，于37°C搖床振蕩培養(yǎng)45min。離心取沉淀或不離心取培養(yǎng)液均勻涂布于含100 ug/ml Amp的LB平皿上；將平皿放置于37°C培養(yǎng)12h，挑取20個(gè)左右的單菌落進(jìn)行PCR快速鑒定。3、陽(yáng)性的篩選、鑒定
(I)挑取在含Amp選擇培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落，先于含100 ug/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 mL，然后在37°C振蕩培養(yǎng)過夜；
(2)取500uL菌懸液，離心沉淀，倒掉上清，加入170uL STET裂解液重懸；
(3)將菌體煮沸裂解45s，12000rpm離心10min，取上清I uL作為PCR鑒定用的模板；
(4)用對(duì)應(yīng)的內(nèi)引物進(jìn)行PCR鑒定，有預(yù)期正確擴(kuò)增條帶者為陽(yáng)性克隆。4、陽(yáng)性克隆質(zhì)粒的提取
(1)取4mL培養(yǎng)的陽(yáng)性克隆菌液到E P管中，12000r/min離心lmin,棄去上清,盡可能吸干培養(yǎng)液；
(2)在菌體沉淀中加入250μ I的DNA結(jié)合液，劇烈振蕩充分懸浮菌體；
(3)加入250μ I裂解液，上下顛倒混勻，室溫放置不超過5 min ；
(4)加入350μ I結(jié)合液,上下顛倒混合,冰浴5 min, 12 000 r/min,離心10 min ；
(5)吸取離心后的上清,加入吸附柱中，10000r/min離心I min,棄去濾液；
(6)于吸附柱中加入500μ I去蛋白緩沖液10000 r/min離心I min,棄去濾液；
(7)于吸附柱中加入700μ I洗漆緩沖液Wash Buffer 10000 r/min離心I min,棄去濾液，重復(fù)該步驟一次；
(8)10000r/min離心2 min后，取出吸附柱芯，放入新的EP管中，在吸附柱中央滴入60°C預(yù)熱的洗脫緩沖液洗脫液40 μ 1，室溫靜置5 min, 10000 r/min離心2min ；
(9)取5μI提取質(zhì)粒進(jìn)行1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)質(zhì)粒提取效果。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建好的質(zhì)粒分別通過菌落PCR檢測(cè)、質(zhì)粒酶切鑒定、序列測(cè)定和比對(duì)，序列測(cè)定結(jié)果如SEQ ID NO:1所示，表明該質(zhì)粒構(gòu)建成功(見圖4)。實(shí)施例8:基因型7型庚型肝炎病毒的體外培養(yǎng)和檢測(cè)
1、質(zhì)粒的純化
Cl)取實(shí)例6中提取的7型庚型肝炎病毒的感染性克隆載體200μ1 JpATE Buffer200μ1，加入苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1) 200μ1混合均勻，高速震蕩5min, 12000g離心15min ；
(2)吸取上清與一新Eppendorf管中加入ΙΟΟμΙ氯仿混合均勻后12000g離心15min,吸取上清與一新EP管中加入0.1倍3M NaHAc, 2.5倍無水乙醇混合均勻，放入_80°C 2h ；
(3)在4°C條件下，13000rpm離心15min棄去上清,加入75%乙醇500μ1,上下顛倒6次；
(4)在4°C條件下，13000rpm離心5min棄去上清，室溫放置IOmin加入50μ1DEPC水混合均勻備用；
(5)用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定260nm、280nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值，計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度。2、質(zhì)粒線性化
(1)吸取GBV-C 7 質(zhì)粒 16μδ(2.5μ1)，分別加入 IOXM Bufferl2Pl、0.l%BSA12Pl、XbaI內(nèi)切酶6μ1、無菌水67.5μ1，共計(jì)ΙΟΟμΙ體系，在37°C條件下進(jìn)行6h酶切；
(2)利用本實(shí)例I中質(zhì)粒純化的方法對(duì)線性化的質(zhì)粒進(jìn)行純化。3、質(zhì)粒單鏈化
(1)吸取2中純化后的線性化質(zhì)粒43μ1加入Mungbean nuclease buffer (IOX)5M-1> Mung bean nuclease 2μ1 混合均勻，在 37°C條件下放置 20min ;
(2)吸取上述(I)中單鏈化后的質(zhì)粒50μ1加入10%SDS(wt/vol) 10Pl、Proteinase Ksolution (20M-g/M-l) 2M-1> Nuc I ease-free water I38Ml,共計(jì) 200μ1 體系在 5CTC 條件下放置Ih ；
(3)利用本實(shí)施例1中質(zhì)粒純化的方法對(duì)單鏈化的質(zhì)粒進(jìn)行純化。4、體外轉(zhuǎn)錄
(1)利用Τ7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，分別吸取10ΧΤ7RNA PolymeraseBuffer 3μ1、DTT (50mm) 3μ1、NTP mixture (each2.5mm) 6ul、RNase Inhibitor 5μ1、T7RNA Polymerase 3μ1、Template DNA 10μ1、DEPC 水 20μ1，共計(jì) 50μ1 體系在 37°C條件下放置Ih ；
(2)利用DNaseI酶除去轉(zhuǎn)錄后的RNA中可能的DNA污染，分別吸取10XDNase I Buffer 5μ1、DNase I 3μ1、RNase Inhibitor 2μ1。5、RNA 純化
(1)吸取經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄后的RNA200μ1，加入TE Buffer 200μ1，加入苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1) 200μ1 混合均勻，高速震蕩 5min, 12000g 離心 15min ；
(2)吸取上清與一新EPPEND0RF管中加入ΙΟΟμΙ氯仿混合均勻后12000g離心15min；
(3)吸取上清與一新EPPEND0RF管中加入0.1倍3M NaHAc, 2.5倍無水乙醇混合均勻，放入-80°C 2h ；
(4)在4°C條件下，13000rpm離心15min棄去上清,加入75%乙醇500μ1,上下顛倒6次；
(5)在4°C條件下，13000rpm離心5min棄去上清，室溫放置IOmin加入50μ1DEPC水混合均勻備用；·
(6)用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定260nm、280nm波長(zhǎng)時(shí)的OD值，計(jì)算待測(cè)樣品的濃度與純度:RNA樣品的濃度(μ g/μ I):0D260X稀釋倍數(shù)X40/1000。6、庚型肝炎病毒的細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)
(1)利用上述5中得到的RNA，根據(jù)混合比例分別為1:1和1:2(脂質(zhì)體體積:RNA質(zhì)量)來轉(zhuǎn)染正常人的I X IO5密度的PBMC細(xì)胞；
(2)在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基，將混合液在室溫放置IOmin；
(3)吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次；
(4)加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，培養(yǎng)13天時(shí)收取上清檢測(cè)病毒拷貝數(shù)(見圖5)。通過該質(zhì)粒經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后可產(chǎn)生，病毒載量高達(dá)6.03X 106COpieS/ml的病毒，且該病毒具有較好的感染性，因此利用該質(zhì)粒構(gòu)建的庚型肝炎病毒，制備高毒力、高感染力、可重復(fù)性和可操作的GBV-C病毒。
權(quán)利要求
1.一種基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體，其特征在于其含有基因型7型庚型肝炎病毒基因，7型庚型肝炎病毒基因5’端具有T7啟動(dòng)子區(qū)基因，3’端具有T7終止子區(qū)基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體，其特征在于基因型7型庚型肝炎病毒基因來源于基因型7型庚型肝炎病毒，其在GenBank登錄號(hào)為HQ331233。
3.權(quán)利要求2所述基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體在體外制備庚型肝炎病毒中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基因型7型庚型肝炎病毒基因的感染性克隆載體，本發(fā)明通過巢式PCR，獲取GBV-C基因型7型全基因組13條PCR擴(kuò)增片段；采用重疊PCR技術(shù)經(jīng)4輪重疊PCR反應(yīng)，將13個(gè)片段依次進(jìn)行了片段的拼接，獲取GBV-C基因型7全基因組克隆，將該全長(zhǎng)克隆經(jīng)EcoRI與XbaI雙酶切后連入噬菌粒載體pBluescriptII(SK+)中相應(yīng)酶切位點(diǎn)中，獲得含有GBV-C基因型7全基因組克隆的重組質(zhì)粒PGBV-C7，利用該感染性克隆質(zhì)粒，可以在正常人的PBMC細(xì)胞中產(chǎn)生庚型肝炎病毒，進(jìn)而繪制了該病毒動(dòng)力學(xué)增長(zhǎng)曲線，該發(fā)明為研究GBV-C7型的生物學(xué)特性奠定了基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究GBV-C與HIV-1之間的作用機(jī)制，提供必備的工具。
文檔編號(hào)C12R1/93GK103255157SQ20131007255
公開日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月7日
發(fā)明者馮悅, 夏雪山, 趙文華, 劉麗, 張阿梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)