專利名稱：一種生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取青蒿素的工藝，尤其是涉及一種生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝。
背景技術(shù)：
青蒿素是我國在世界上首先研制成功的一種抗瘧新藥，它是從我國民間治療瘧疾的草藥黃花蒿中分離出來的有效單體。它的研究始于上世紀60年代中期，是數(shù)百名科學(xué)家經(jīng)過堅持不懈的深入研究而取得的成果。它是由我國科學(xué)家自主研究開發(fā)并在國際上注冊的為數(shù)不多的一類新藥之一，被世界衛(wèi)生組織評價為治療惡性瘧疾惟一真正有效的藥物。主要用于間日瘧、惡性瘧的癥狀控制，以及耐氯喹蟲株的治療，也可用以治療兇險型惡性瘧，如腦型瘧、黃疸型瘧疾等；亦可用以治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡與盤狀紅斑狼瘡。目前，我國的青蒿素產(chǎn)業(yè)已經(jīng)具有一定規(guī)模，從原料種植到產(chǎn)品生產(chǎn)都取得了長足的發(fā)展?，F(xiàn)有制備青蒿素的方法包括有機溶劑提取法、超臨界CO2萃取法、微波萃取法等，但有機溶劑提取法提取率不高，超臨界CO2萃取法生產(chǎn)成本太高，微波萃取處理量小，成本聞。中國發(fā)明專利申請201010508561.4公開了一種生物復(fù)合酶法提取青蒿素的工藝，大大提高了青蒿素的提取率，但也存在著酶處理時間長，結(jié)晶步驟多，生產(chǎn)周期長等不足。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提取率高，設(shè)備簡單，生產(chǎn)成本低的生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝。本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是:
一種生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，采用的生物酶是一種復(fù)合酶，能破壞蠟油成分，破壞細胞壁的纖維素、果膠等，使青蒿素提取率大大提高，通過柱層析除去其它雜質(zhì)，得到純度較高的青蒿素，再通過適宜溶劑結(jié)晶，得到高純度的青蒿素。具體包括以下步驟:
(O原料復(fù)合酶處理:在青蒿草干葉葉面噴灑相當(dāng)于青蒿草干葉重量0.1% - 0.3%的植物提取復(fù)合酶，再將青蒿葉堆積在溫度40±2°C的暗室內(nèi)，堆頭上面覆蓋一層塑料膜，發(fā)酵 12 — 24h ；
(2)有機溶劑提取:將經(jīng)步驟(I)發(fā)酵的青蒿葉片晾干或烘干，將青蒿干葉投入滲漉裝置中，按每千克原料青蒿草干葉加提取有機溶劑A > 5.0升(優(yōu)選5.4 6.5升)的比例加入有機溶劑A，浸泡2-4h，再開始滲漉，收集滲漉液；
進一步，滲漉時，優(yōu)選加壓10kPa_60kPa (表壓)；
(3)層析柱層析:將步驟(2)所得滲漉液直接通過裝有硅膠的層析柱，硅膠的重量為青蒿草干葉原料重量的1/5 - 1/2，過柱流出液回收用作步驟(2)中提取溶劑，再用有機溶劑B洗脫硅膠柱，薄層層析(TLC)監(jiān)測，直到層析柱無青蒿素流出，收集洗脫液；
(4)結(jié)晶:將步驟(3)收集得到的洗脫液濃縮干，得到青蒿素粗品，回收洗脫液；青蒿素粗品用有機溶劑A洗滌至少2次，每次洗滌按每千克青蒿素粗品加1.0 — 2.5升有機溶劑A的比例加入有機溶劑A，然后抽濾，濾渣放入烘箱中在55-75°C下干燥4-8h，得經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品，濾液投入滲漉裝置中作為下一批生產(chǎn)步驟(2)中的提取溶劑，按每千克經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品(濾渣)加有機溶劑C 90 — 110升(優(yōu)選95 - 105升)的比例加入有機溶劑C，溶解，過濾，濾液濃縮至原體積的5% - 8%，回收有機溶劑C ;濃縮后的濾液靜置，0_30°C結(jié)晶4_12h,過濾,得到青高素。步驟(I)中，所述植物提取復(fù)合酶由以下重量百分比的酶組成:纖維素酶20%-30%、半纖維素酶10%-15%、果膠酶20%-30%、脂肪酶25%_35%、淀粉酶1%_1.5%、蛋白酶1%-1.5%、β 一葡聚糖酶1%_1.5%、木聚糖酶1%-1.5%，各種酶的重量百分比之和為100%。所述有機溶劑A優(yōu)選石油醚、6#溶劑油、120#溶劑油、200#溶劑油或正已烷等。所述有機溶劑B優(yōu)選石油醚、6#溶劑油、120#溶劑油、200#溶劑油或正已烷，所述石油醚、6#溶劑油、120#溶劑油、200#溶劑油、正已烷中含有4.0wt%-5.5wt%的乙酸乙酷；
所述有機溶劑C為體積濃度> 85%的乙醇。本發(fā)明采用植物提取復(fù)合酶，可以降低酶處理溫度，并大大縮短處理時間，提高生產(chǎn)效率；采用滲漉提取，可以大大提高青蒿素的提取率，與中國發(fā)明專利申請201010508561.4相比較，青蒿素的提取率可以提高3 — 5%;通過柱層析后處理得到的青蒿素純度可達> 99%，可減少結(jié)晶步驟，簡化生產(chǎn)工藝。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例1
本實施例包括以下步驟:
(O原料復(fù)合酶處理:取青蒿草干葉500kg (青蒿素質(zhì)量含量0.42%)在青蒿草干葉葉面噴灑IOOOg的植物提取復(fù)合酶，再將青蒿葉堆積在溫度40±2°C的暗室內(nèi)，堆頭上面覆蓋一層塑料膜，發(fā)酵24h ；
所述植物提取復(fù)合酶由以下重量百分比的酶組成:纖維素酶25%、半纖維素酶15%、果膠酶20%、脂肪酶35%、淀粉酶1%、蛋白酶1%、β 一葡聚糖酶1.5%、木聚糖酶1.5%。(2)有機溶劑提取:將經(jīng)步驟(I)發(fā)酵的青蒿葉片晾干，將青蒿干葉投入滲漉裝置中，再加2700L石油醚，浸泡2h，再加壓25KPa (表壓)滲漉，收集滲漉液；
(3)層析柱層析:將步驟(2)所得的滲漉液直接通過裝有120kg硅膠的層析柱，過柱流出液回收用作步驟(2)中提取溶劑，再用含有4.5wt%乙酸乙酯的石油醚洗脫硅膠柱，薄層層析(TLC)監(jiān)測，直到層析柱無青蒿素流出，收集洗脫液；
(4)結(jié)晶:將步驟(3)收集得到的洗脫液濃縮干，得到青蒿素粗品2.21kg，回收洗脫液；青蒿素粗品用石油醚洗滌2次，每次洗滌所用石油醚的量為3L，然后抽濾，濾渣放入烘箱中在70°C下干燥5h，得到經(jīng)洗 滌干燥的青蒿素粗品2.16 kg，濾液投入滲漉裝置中作為下一批步驟(2)中的提取溶劑，將經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品用225L體積濃度為95%的乙醇溶解后，過濾，濾液濃縮至17.5L并回收乙醇；濃縮液轉(zhuǎn)入結(jié)晶罐中15°C結(jié)晶4h，放罐抽濾，得到含量為99.5wt%的青蒿素2.0lkg0青蒿素得率95.7%。實施例2
本實施例包括以下步驟:
(I)原料復(fù)合酶處理:取青蒿草干葉500kg (青蒿素質(zhì)量含量0.72%)，在青蒿草干葉葉面噴灑800g的植物提取復(fù)合酶，再將青蒿葉堆積在溫度40±2°C的暗室內(nèi)，堆頭上面覆蓋一層塑料膜，發(fā)酵18h ；
所述植物提取復(fù)合酶由以下重量百分比的酶組成:纖維素酶20%、半纖維素酶15%、果膠酶25%、脂肪酶35%、淀粉酶1%、蛋白酶1.5%、β 一葡聚糖酶1%、木聚糖酶1.5%。(2)有機溶劑提取:將經(jīng)步驟(I)發(fā)酵的青蒿葉片晾干，將青蒿干葉投入滲漉裝置中，再加2800L6#溶劑油，浸泡3h，再加壓40KPa (表壓)滲漉，收集滲漉液；
(3)層析柱層析:將步驟(2)所得的滲漉液直接通過裝有150kg硅膠的層析柱，過柱流出液回收用作步驟(2)中提取溶劑，再用含有5.0wt%乙酸乙酯的6#溶劑油洗脫硅膠柱，薄層層析(TLC)監(jiān)測，直到層析柱無青蒿素流出，收集洗脫液；
(4)結(jié)晶:將步驟(3)收集得到的洗脫液濃縮干，得到青蒿素粗品3.75 kg,回收洗脫液；青蒿素粗品用6#溶劑油洗漆2次,每次洗漆所用6#溶劑油的量為5L,然后抽濾,濾洛放入烘箱中在60°C下干燥6h，得到經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品3.63kg，濾液投入滲漉裝置中作為下一批步驟(2)中的提取溶劑，將經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品用375L體積濃度為92%的乙醇溶解后，過濾，濾液濃縮至25L并回收乙醇；濃縮液轉(zhuǎn)入結(jié)晶罐中20°C結(jié)晶6h，放罐抽濾得到含量為99.3wt%的青蒿素3.48kg。青蒿素得率96.7%。實施例3
本實施例包括以下步驟:
(I)原料復(fù)合酶處理:取青蒿草干葉500kg (青蒿素質(zhì)量含量0.95%)，在青蒿草干葉葉面噴灑800g的植物提取復(fù)合酶，再將青蒿葉堆積在溫度40±2°C的暗室內(nèi)，堆頭上面覆蓋一層塑料膜，發(fā)酵24h ；
所述植物提取復(fù)合酶由以下重量百分比的酶組成:纖維素酶30%、半纖維素酶10%、果膠酶25%、脂肪酶30%、淀粉酶1%、蛋白酶1.5%、β 一葡聚糖酶1.5%、木聚糖酶1%。(2)有機溶劑提取:將經(jīng)步驟(I)發(fā)酵的青蒿葉片晾干，將青蒿干葉投入滲漉裝置中，再加3200L正已烷，浸泡4h，再加壓50KPa (表壓)滲漉，收集滲漉液；
(3)層析柱層析:將步驟(2)所得的滲漉液直接通過裝有180kg硅膠的層析柱，過柱流出液回收用作步驟(2)中提取溶劑，再用含有5.5wt%乙酸乙酯的正已烷洗脫硅膠柱，薄層層析(TLC)監(jiān)測，直到層析柱無青蒿素流出，收集洗脫液；
(4)結(jié)晶:將步驟(3)收集得到的洗脫液濃縮干，得到青蒿素粗品4.85 kg,回收洗脫液；青蒿素粗品用正已烷洗滌2次，每次洗滌所用正已烷的量為10L，然后抽濾，濾渣放入烘箱中在75°C下干燥4h，得到經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品4.78kg，濾液投入滲漉裝置中作為下一批步驟(2)中的提取溶劑，將經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品用500L體積濃度為90%的乙醇溶解后，過濾，濾液濃縮至30L并回收乙醇；濃縮液轉(zhuǎn)入結(jié)晶罐中25°C結(jié)晶8h，放罐抽濾得到含量為99.3wt%的青蒿素4.60kg。青蒿素得率96.8%。實施例4本實施例包括以下步驟:
(O原料復(fù)合酶處理:取青蒿草干葉500kg (青蒿素質(zhì)量含量0.55%)在青蒿草干葉葉面噴灑900g的植物提取復(fù)合酶，再將青蒿葉堆積在溫度40±2°C的暗室內(nèi)，堆頭上面覆蓋一層塑料膜，發(fā)酵16h ；
所述植物提取復(fù)合酶由以下重量百分比的酶組成:纖維素酶25%、半纖維素酶15%、果膠酶30%、脂肪酶25%、淀粉酶1.5%、蛋白酶1.5%、β 一葡聚糖酶1%、木聚糖酶1%。(2)有機溶劑提取:將經(jīng)步驟(I)發(fā)酵的青蒿葉片晾干，將青蒿干葉投入滲漉裝置中，再加3000L 120#溶劑油，浸泡2h，再加壓35KPa (表壓)滲漉，收集滲漉液；
(3)層析柱層析:將步驟(2)所得的滲漉液直接通過裝有200kg硅膠的層析柱，過柱流出液回收用作步驟(2)中提取溶劑，再用含有4.0wt%乙酸乙酯的120#溶劑油洗脫硅膠柱，薄層層析監(jiān)測，直到層析柱無青蒿素流出，收集洗脫液；
(4)結(jié)晶:將步驟(3)收集得到的洗脫液濃縮干，得到青蒿素粗品3.17 kg,回收洗脫液；青蒿素粗品用120#溶劑油洗漆2次,每次洗漆所用120#溶劑油的量為6L,然后抽濾,濾渣放入烘箱中在60°C下干燥7h，得到經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品3.05kg，濾液投入滲漉裝置中作為下一批步驟(2)中的提取溶劑，將經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品用300L體積濃度為89%的乙醇溶解后，過濾，濾液濃縮至1 8.75L并回收乙醇；濃縮液轉(zhuǎn)入結(jié)晶罐中30°C結(jié)晶8h，放罐抽濾，得到含量為99.lwt%的青蒿素2.60kg。青蒿素得率94.5%。實施例5
本實施例包括以下步驟:
(I)原料復(fù)合酶處理:取青蒿草干葉500kg (青蒿素質(zhì)量含量0.58%)，在青蒿草干葉葉面噴灑1200g的植物提取復(fù)合酶，再將青蒿葉堆積在溫度40±2°C的暗室內(nèi)，堆頭上面覆蓋一層塑料膜，發(fā)酵12h ；
所述植物提取復(fù)合酶由以下重量百分比的酶組成:纖維素酶25%、半纖維素酶15%、果膠酶25%、脂肪酶30%、淀粉酶1.5%、蛋白酶1%、β 一葡聚糖酶1%、木聚糖酶1.5%。(2)有機溶劑提取:將經(jīng)步驟(I)發(fā)酵的青蒿葉片晾干，將青蒿干葉投入滲漉裝置中，再加2900L 200#溶劑油，浸泡2h，再加壓60KPa (表壓)滲漉，收集滲漉液；
(3)層析柱層析:將步驟(2)所得滲漉液直接通過裝有160kg硅膠的層析柱，過柱流出液回收用作步驟(2)中提取溶劑，再用含有4.4wt%乙酸乙酯的200#溶劑油洗脫硅膠柱，薄層層析監(jiān)測，直到層析柱無青蒿素流出，收集洗脫液；
(4)結(jié)晶:將步驟(3)收集得到的洗脫液濃縮干，得到青蒿素粗品3.10kg，回收洗脫液；青蒿素粗品用200#溶劑油洗滌2次，每次洗滌所用200#溶劑油的量為7L，然后抽濾，濾渣放入烘箱中在55°C下干燥8h，得到經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品2.97kg，濾液投入滲漉裝置中作為下一批生產(chǎn)步驟(2)中的提取溶劑，將經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品用300L體積濃度為93%的乙醇溶解后，過濾，濾液濃縮至20L并回收乙醇；濃縮液轉(zhuǎn)入結(jié)晶罐中30°C結(jié)晶6h，放罐抽濾，得到含量為99.2wt%的青蒿素2.71kg。青蒿素得率93.4%。
權(quán)利要求
1.一種生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，其特征在于，包括以下步驟: (O原料復(fù)合酶處理:在青蒿草干葉葉面噴灑相當(dāng)于青蒿草干葉重量0.1% - 0.3%的植物提取復(fù)合酶，再將青蒿葉堆積在溫度40±2°C的暗室內(nèi)，堆頭上面覆蓋一層塑料膜，發(fā)酵 12 — 24h ； (2)有機溶劑提取:將經(jīng)步驟(I)發(fā)酵的青蒿葉片晾干或烘干，將青蒿干葉投入滲漉裝置中，按每千克原料青蒿草干葉加提取有機溶劑A > 5.0升的比例加入有機溶劑A，浸泡2-4h,再開始滲漉,收集滲漉液； (3)層析柱層析:將步驟(2)所得滲漉液直接通過裝有硅膠的層析柱，硅膠的重量為青蒿草干葉原料重量的1/5 - 1/2，過柱流出液回收用作步驟(2)中提取溶劑，再用有機溶劑B洗脫硅膠柱，薄層層析監(jiān)測，直到層析柱無青蒿素流出，收集洗脫液； (4)結(jié)晶:將步驟(3)收集得到的洗脫液濃縮干，得到青蒿素粗品；青蒿素粗品用有機溶劑A洗滌至少2次，每次洗滌按每千克青蒿素粗品加1.0 — 2.5升有機溶劑A的比例加入有機溶劑A，然后抽濾，濾渣放入烘箱中在55-75°C下干燥4-8h，得經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品，按每千克經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品加有機溶劑C 90 — 110升的比例加入有機溶劑C，溶解，過濾，濾液濃縮至原體積的5% - 8% ;濃縮后的濾液靜置，0-30°C結(jié)晶4-12h，過濾，得到青蒿素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，其特征在于，步驟(I)中，所述植物提取復(fù)合酶由以下重量百分比的酶組成:纖維素酶20%-30%、半纖維素酶10%-15%、果膠酶20%-30%、脂肪酶25%-35%、淀粉酶1%_1.5%、蛋白酶1%_1.5%、β 一葡聚糖酶1%-1.5%、木聚糖酶1%-1.5%，各種酶的重量百分比之和為100%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，其特征在于，所述有機溶劑A為石油醚、6# 溶劑油、120#溶劑油、200#溶劑油或正已烷。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，其特征在于，所述有機溶劑B為石油醚、6#溶劑油、120#溶劑油、200#溶劑油或正已烷，所述石油醚、6#溶劑油、120#溶劑油、200#溶劑油、正已烷中含有4.0wt%-5.5wt%的乙酸乙酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，其特征在于，所述有機溶劑C為體積濃度> 85%的乙醇。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，其特征在于，步驟(2)中，將青蒿干葉投入滲漉裝置中，按每千克原料青蒿草干葉加提取有機溶劑A 5.4-6.5升的比例加入有機溶劑A。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，其特征在于，步驟(2)中，滲漉時，加壓表壓為10kPa_60kPa。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，其特征在于，步驟(4)中，按每千克經(jīng)洗滌干燥的青蒿素粗品加有機溶劑C 95 — 105升的比例加入有機溶劑C溶解洗滌干燥的青蒿素粗品。
全文摘要
一種生物酶-滲漉法提取青蒿素的工藝，包括以下步驟(1)原料復(fù)合酶處理；(2)有機溶劑提取；(3)層析柱層析；(4)結(jié)晶。本發(fā)明采用植物提取復(fù)合酶，可以降低酶處理溫度，并大大縮短處理時間，提高生產(chǎn)效率；采用滲漉提取，可以大大提高青蒿素的提取率，與中國發(fā)明專利申請201010508561.4相比較，青蒿素的提取率可以提高3－5％；通過柱層析后處理得到的青蒿素純度可達≥99%，可減少結(jié)晶步驟，簡化生產(chǎn)工藝。
文檔編號C07D493/20GK103073561SQ20131004887
公開日2013年5月1日 申請日期2013年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月7日
發(fā)明者肖文中, 胡亮亮 申請人:湖南威嘉生物科技有限公司