專利名稱：改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物及制備方法。
背景技術(shù)：
基因治療是一種將外源基因?qū)肽康募?xì)胞并有效表達(dá)，從而達(dá)到治病目的的治療方法。裸露的外源基因帶負(fù)電，難以滲入同樣帶負(fù)電的細(xì)胞膜且容易被機(jī)體或細(xì)胞降解，因而難以表達(dá)。所以基因治療的關(guān)鍵是選擇合適的基因載體及基因?qū)敕椒?，使目的基因能夠在靶?xì)胞中獲得安全、高效、可控且穩(wěn)定的表達(dá)?；蜉d體主要有病毒載體和非病毒載體兩類。1.病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但也有能誘導(dǎo)宿主免疫反應(yīng)、潛在的致瘤性、裝載容量有限、代價(jià)高等缺點(diǎn)，限制了它們的應(yīng)用。2.非病毒載體是目前公認(rèn)可替代病毒載體的基因載體系統(tǒng)，它可避免諸如免疫原性、毒性等病毒載體的缺陷。具有低毒、低免疫反應(yīng)，外源基因隨機(jī)整合率低且攜帶基因大小類型不受限制等優(yōu)點(diǎn)。雖然非病毒載體安全性好，但存在轉(zhuǎn)染、整合效率低等缺點(diǎn)。因此，如何研制出安全有效的、生物相容性好的基因藥物載體，如何提高非病毒性基因載體的靶向特異性和體內(nèi)外轉(zhuǎn)染效率，已經(jīng)是迫在眉睫的關(guān)鍵問題。陽離子脂質(zhì)體和陽離子聚合物載體屬于非病毒性基因載體。它們是利用結(jié)構(gòu)上帶正電的氨基靜電復(fù)合基因，再通過靜電作用結(jié)合細(xì)胞膜或通過攜帶的靶向配體與細(xì)胞膜上的帶負(fù)電荷的受體結(jié)合，通過內(nèi)吞、逃離內(nèi)體和胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的方式表達(dá)目的基因。但是，陽離子載體與基因組裝形成的復(fù)合物帶有過量正電荷，易與血清中帶負(fù)電的蛋白非特異性結(jié)合。當(dāng)靜脈注射后，復(fù)合物因聚集而被清除。另外，陽離子載體易與血液成分作用，會導(dǎo)致補(bǔ)體激活、血細(xì)胞凝結(jié)、血小板減少、白細(xì)胞減少等不良現(xiàn)象。因此，屏蔽掉陽離子載體-基因二元復(fù) 合物表面過量的正電荷，是一種合理有效的解決途徑。目前主要有兩種方法:一種是將二元復(fù)合物表面PEG化，增強(qiáng)復(fù)合物的水溶性，在復(fù)合物周圍形成一層水分子膜，使得復(fù)合物與血液中帶負(fù)電的物質(zhì)減少接觸；另一種方法是將帶正電的二元復(fù)合物與帶負(fù)電的大分子通過靜電作用進(jìn)行組裝，形成三元復(fù)合物，從而中和掉過量的正電荷。目前，將蛋白作為第三元物質(zhì)來屏蔽過量正電荷的方法得到越來越廣泛的研究。蛋白的來源非常豐富，而且具有良好生物相容性和生物可降解性。蛋白分子表面存在的氨基和羧基官能團(tuán)易于共價(jià)改性，從而有效地與靶向配體偶合，增強(qiáng)載體的靶向性。因此采用蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物可高效安全地將基因遞送到靶向部位，從而實(shí)現(xiàn)基因治療，具有良好的研究如景。另一方面，基因載體的轉(zhuǎn)染效率很大程度上決定于其逃離細(xì)胞內(nèi)涵體的能力，陽離子載體如PE1、PDMAEMA等具有大量未質(zhì)子化的叔胺和仲胺基團(tuán)，能在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境下進(jìn)一步質(zhì)子化，使內(nèi)涵體內(nèi)正電荷數(shù)目上升。與此同時(shí)，為平衡電荷，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)負(fù)離子進(jìn)入內(nèi)涵體，使內(nèi)涵體內(nèi)滲透壓上升，從而漲破內(nèi)涵體，釋放基因載體與基因。這就是聚陽離子基因載體的“質(zhì)子海綿效應(yīng)”。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種改性蛋白。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種改性蛋白的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)染效率高及生物相容性好的改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物的制備方法。一種改性蛋白，是用式(I)或(II)表示:
權(quán)利要求
1.一種改性蛋白，其特征是用式(I)或(II)表示:
2.權(quán)利要求1改性蛋白的制備方法，其特征包括如下步驟: (1)取400mg蛋白溶于40-80mL雙蒸水中溶解； (2)將80-100mL乙胺或80_100mL濃度為2_4mg/mL的巰基乙胺水溶液滴加到步驟(I)制備的蛋白溶液中，調(diào)節(jié)PH至4.7-4.8 ； (3)取80-100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶于8_12mL雙蒸水中溶解，加入步驟(2)獲得的溶液中，在20-30°C水浴中反應(yīng)l_4h ； (4)將步驟(3)獲得的溶液用截止分子量3500 10000的透析袋在純水中透析2 14天; (5)將步驟(4)獲得的透析產(chǎn)物冷凍干燥后得到改性蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種改性蛋白的制備方法，其特征是所述蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白或膠原蛋白。
4.性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物，其特征是在陽離子載體-基因復(fù)合物上結(jié)合有改性蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物，其特征是所述陽離子載體為脂質(zhì)體2000、聚乙烯亞胺、聚乙烯吡咯烷酮接枝聚甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、聚賴氨酸或殼聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物，其特征是所述基因?yàn)榫G色熒光蛋白編碼的質(zhì)?；蚋蓴_核糖核酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物，其特征是所述改性蛋白是用式(1)或(II)表示:
8.權(quán)利要求4-7之一的改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物的制備方法，其特征包括如下步驟: (1)將陽離子載體與基因復(fù)合得到陽離子載體-基因復(fù)合物； (2)在pH=7.4條件下，將權(quán)利要求1的改性蛋白與陽離子載體-基因復(fù)合物復(fù)合，得到粒徑均一的改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物納米粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物及制備方法，改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物，是在陽離子載體-基因復(fù)合物上結(jié)合有改性蛋白。本發(fā)明所制備的改性蛋白等電點(diǎn)約在5.5-6.5，具有內(nèi)涵體環(huán)境下電荷反轉(zhuǎn)能力。其能在pH大于7的情況下帶負(fù)電荷，能與陽離子載體-基因二元復(fù)合物結(jié)合，屏蔽其正電荷從而降低毒性；在pH小于5的情況下帶正電荷，改性蛋白從陽離子載體-基因二元復(fù)合物上脫落，與陽離子基因載體共同發(fā)揮“質(zhì)子海綿效應(yīng)”，使陽離子復(fù)合物基因載體從內(nèi)涵體內(nèi)逃離。改性蛋白和改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物的制備方法簡單。改性蛋白-陽離子載體-基因三元復(fù)合物的基因轉(zhuǎn)染效率高，生物毒性低。
文檔編號C07K14/765GK103087185SQ20131003167
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者邢金峰, 張寧, 王重夕 申請人:天津大學(xué)