專利名稱：制造人抗凝血酶-iii制品的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從人Cohn血漿組分中分離純化人抗凝血酶-1II的工藝，屬生物制藥領(lǐng)域。工藝步驟簡潔，只用一步親和層析，經(jīng)兩步不同的病毒滅活步驟，所得制品安全可靠。主要用來治療各種原因引起的抗凝血酶-1II缺乏患者。
背景技術(shù)：
人抗凝血酶-1IK可表示為AT-1II)為單肽鏈α糖蛋白，分子量約58kD (千道爾頓)，由423個氨基酸組成，是一種多功能絲氨酸蛋白酶抑制劑，在人體血漿中的抗凝作用占整個抗凝作用的70%左右，其半衰期為2. 69天，患病時半衰期縮短，其主要在肝臟合成，故在各種肝臟疾病發(fā)生時AT-1II有不同程度的獲得性缺乏。AT-1II制品主要用來治療先天性遺傳性抗凝血酶-1II缺乏，AT-1II缺乏癥為常染色體顯性遺傳，據(jù)統(tǒng)計，該癥在歐美的發(fā)生率為O. 2% O. 5%。AT-1II制 品還用來治療獲得性抗凝血酶III缺乏，見于各種肝病，如肝硬化、重癥呷、肝癌晚期等，以及各種病因引起的彌漫性血管內(nèi)凝血綜合癥，產(chǎn)科與外科手術(shù)等造成的血檢等。上世紀(jì)60 70年代即開始有人報道純化AT-1II的工藝，但是僅限于實驗室開發(fā)。1972年Heimburger et a7首次分離并鑒定AT-111為a2單鏈糖蛋白，但是其回收率較低，大約在2%左右。1974年Maggie Miller-Andersson et a7使用肝素親和膠從血衆(zhòng)中純化AT-1II，然后經(jīng)過DEAE- Sephadex and Sephadex G200層析處理，其活性回收率為34%，純度在90%以上。1979年，Wicker et 首先敘述了工業(yè)規(guī)模制備臨床用途的AT-1II濃縮物，其原料為工業(yè)生產(chǎn)丟棄的Cohn組分IV沉淀。1989年，Hoffman等報道了大量制備AT-1II的方法，原料為Cohn氏工藝提取的組分IV，通過肝素親和層析與其它蛋白分離，之后，在0.5M枸椽酸鈉溶液中將AT-1II濃縮物于60°C加熱10小時，以滅活乙肝病毒和其他傳染性病毒，再進行二次肝素親和層析，成品比活不低于6.4 IU/mg,純度大于95%，冷凍干燥后4°C存放2年，仍有90%以上的生物學(xué)活性。1994年，Wytold等發(fā)表了以重溶后Cohn氏組分IV沉淀為原料，進行人血漿AT-1II肝素親和層析的大規(guī)模提純改良法，該工藝包括了病毒滅活的加熱過程和為進一步提純目的的第二步肝素親和層析，上述方法可在5小時內(nèi)在40升柱上通過1800升的原液。AT-1II成品純度達95%以上，其平均效率為69%，比活性為7.7 IU/mg蛋白，由20 kg Cohn氏組分IV沉淀獲得30g AT-1II，收率可達到15 20%。該法最明顯的改進是用Heparin- Hyper D(Sepracor,硬性硅組成的肝素樹指)取代肝素U ltrogel，顯著增加了層析容量，提高了流速，降低了操作壓力。此法的最大特點亦是采用了 Cohn氏組分IV沉淀為AT-1II制備原料，便于充分利用原料血漿，降低成本并對其它血漿蛋白的制備無影響。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是以Cohn氏組分IV沉淀為原料，以氯化鈉-檸檬酸鈉溶液為抽提緩沖液對其融解，調(diào)整工藝盡可能使其中的AT-1II溶解；經(jīng)加入適當(dāng)保護劑以S/D病毒滅活工藝代替巴氏病毒滅活工藝，減少活性損失，縮短制備時間；并且只需一步肝素親和層析就可得到高純度的AT-1II溶液，再經(jīng)過超濾、冷凍干燥、干熱病毒滅活等步驟，最終制品純度在95%以上，比活在6. 5 IU/mg以上，高于歐洲藥典及美國藥典規(guī)定限度3. O IU/mg 0發(fā)明詳述
本發(fā)明是一種從Cohn低溫乙醇法分離血漿蛋白工藝組分IV沉淀中分離純化人抗凝血酶-1IKAT-1II)的工藝，具體實施過程如下
(I )、組分IV沉淀的抽提與處理
抽提緩沖液(氯化鈉-檸檬酸鈉溶液)與組分IV沉淀的混合比例為12:1 3:1 (m/v)；抽提溫度為4 36°C;抽提pH為5. 5 11，抽提時間為I 2小時；然后在4 20°C溫度下，用氣動隔膜泵將抽提混合液進行壓濾，去除不溶物；將壓濾濾出液PH值調(diào)至7. 2左右，采用IOkD超濾膜進行超濾濃縮；
(2)、S/D病毒滅活
按步驟(I)最終所得液體體積的10%，加入11% S/D病毒滅活液，在24 25°C攪拌6小時，其中的11%S/D病毒滅活液，用含吐溫-80和磷酸三丁酯(TNBP)，按每IlOg吐溫-80和33g TNBP加水至I千克的方法配制；
(3)親和層析
以肝素親和膠為吸附純化載體，經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到AT-1II原液，其中層析溫度范圍為4 36°C，各步驟液體流速為每小時6 9個柱體積。①平衡用平衡液對 肝素親和膠進行平衡，平衡液體積不少于4個柱體積；
②上樣將步驟(2)S/D病毒滅活最終所得液體泵入層析柱中，通過肝素親和膠進行吸
附；
③洗滌用洗滌液對親和膠進行洗滌，洗滌液體積不少于8個柱體積，觀察在線紫外吸收圖譜，至圖譜趨于水平時停止洗滌；
④洗脫對肝素親和膠進行洗脫，觀察在線紫外吸收圖譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液，即為AT-1II原液。(4)、超濾
對步驟(3)中所得AT-1II原液用IOkD孔徑超濾膜超濾，添加必要的冷凍干燥保護劑，本保護劑是指甘氨酸，其最終濃度為O. 6 1. 6% ；
(5)除菌過濾
(6)分裝
(7)冷凍干燥
①分裝后的制品常溫入柜，
②將隔板溫度在40分鐘內(nèi)降至-40°C，保持3小時；
③開啟真空泵，真空度控制在7 15Pa；
④2小時后將隔板溫度升至_30°C，保持3小時；
⑤4小時后隔板溫度升至_20°C，保持6小時；
⑥8小時后將隔板溫度升至0°C，保持20小時；
⑦10小時后將溫度升至30°C，保持6小時；真空度控制在5Pa以下保持I小時；
⑧真空壓塞出柜。
(8)干熱病毒滅活,干熱溫度100°C,時間為30min 60min。其中
抽提緩沖液中含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為O. 09 O. 15M，檸檬 酸鈉濃度為O. 015 O. 025M, pH為5. 5 11，其余為水；
平衡液為含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為O. 09 O. 15M，檸檬酸鈉濃度為O. 015 O. 025M, pH 為 6. 5 7. 5，其余為水；
洗滌液中含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為O. 3 O. 5M，檸檬酸鈉濃度為O. 015 O. 025M, pH 為 6. 5 7. 5 ;其余為水；
洗脫液中含氯化鈉和檸檬酸鈉，其中氯化鈉濃度為2 3M，檸檬酸鈉濃度為O. 015 O. 025M, pH為6. 5 7. 5 ;其余為水；
以上百分比除特別說明外均為質(zhì)量百分比；以上需要調(diào)節(jié)PH的地方，所用酸堿均為O.1M鹽酸和O. 2M氫氧化鈉。本發(fā)明的有益效果，以Cohn氏組分IV沉淀為原料，以氯化鈉-檸檬酸鈉溶液為抽提緩沖液對其融解，調(diào)整工藝盡可能使其中的AT-1II溶解；經(jīng)加入適當(dāng)保護劑以S/D病毒滅活工藝代替巴氏病毒滅活工藝，減少活性損失，縮短制備時間；并且只需一步肝素親和層析就可得到高純度的AT-1II溶液，再經(jīng)過超濾、冷凍干燥、干熱病毒滅活等步驟，最終制品純度在95%以上，比活在6. 5 IU/mg以上，高于歐洲藥典及美國藥典規(guī)定限度3. O IU/mg 0
具體實施例方式實施例1 對上樣層析條件進行優(yōu)化，以組分IV沉淀抽提緩沖液PH值、氯化鈉濃度及檸檬酸鈉濃度為因素，設(shè)計三因素三水平正交實驗，具體設(shè)計方案見下表所示。以三次實驗回收活性平均值為考察指標(biāo)，實驗?zāi)康墨@得最佳上樣層析條件組合。具體實施過程如下
分別稱取50g組分IV沉淀溶于不同濃度抽提緩沖液中，抽提緩沖液與組分IV比例為4 1 (v/m),按設(shè)計方案調(diào)節(jié)pH值,室溫下攪拌I小時,然后將其在4°C、4500rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，去除沉淀，收集上清液。過濾上清液，采用O. 45Mm孔徑的過濾膜，過濾液上柱進行層析。層析過程如發(fā)明詳述過程所述，其中柱高10cm，截面積2. Ocm2，上樣量為100ml。實驗設(shè)計及結(jié)果見下表1:
表I以平均回收活性多少為目的時最優(yōu)組合計算表
權(quán)利要求
1.制造人抗凝血酶-1II制品的方法，其特征是一種從Cohn低溫乙醇法分離血漿蛋白工藝組分IV沉淀中分離純化人抗凝血酶-1II (AT-1II)的工藝，具體實施過程如下步驟 (I )、組分IV沉淀的抽提與處理 抽提緩沖液(氯化鈉-檸檬酸鈉溶液)與組分IV沉淀的混合比例為12:1 3:1 m/v；抽提溫度為4 36°C;抽提pH為5. 5 11，抽提時間為I 2小時；然后在4 20°C溫度下，用氣動隔膜泵將抽提混合液進行壓濾，去除不溶物；將壓濾濾出液PH值調(diào)至7. 2左右，采用IOkD超濾膜進行超濾濃縮； (2)、S/D病毒滅活 按組分IV沉淀的抽提與處理步驟最終所得液體體積的10%，加入11% S/D病毒滅活液，在24 25°C攪拌6小時，其中的11%S/D病毒滅活液，用含吐溫_80和磷酸三丁酯TNBP，按每IlOg吐溫-80和33g TNBP加水至I千克的方法配制； (3)親和層析 以肝素親和膠為吸附純化載體，經(jīng)過平衡、上樣、洗滌、洗脫等步驟得到AT-1II原液，其中層析溫度范圍為4 36°C，各步驟液體流速為每小時6 9個柱體積； ①平衡用平衡液對肝素親和膠進行平衡，平衡液體積不少于4個柱體積； ②上樣將S/D病毒滅活步驟最終所得液體泵入層析柱中，通過肝素親和膠進行吸附； ③洗滌用洗滌液對親和膠進行洗滌，洗滌液體積不少于8個柱體積，觀察在線紫外吸收圖譜，至圖譜趨于水平時停止洗滌； ④洗脫對肝素親和膠進行洗脫，觀察在線紫外吸收圖譜，并用潔凈的容器收集吸收峰處的流出液，即為AT-1II原液； (4)、超濾 對親和層析步驟中所得AT-1II原液用IOkD孔徑超濾膜超濾，添加必要的冷凍干燥保護齊[J，本冷凍干燥保護劑是指甘氨酸，其最終濃度為O. 6 1. 6% ； (5)、除菌過濾 (6)、分裝 (7)、冷凍干燥 ①分裝后的制品常溫入柜 ②將隔板溫度在40分鐘內(nèi)降至-40°C，保持3小時； ③開啟真空泵，真空度控制在7 15Pa； ④2小時后將隔板溫度升至_30°C，保持3小時； ⑤4小時后隔板溫度升至_20°C，保持6小時； ⑥8小時后將隔板溫度升至0°C，保持20小時； ⑦10小時后將溫度升至30°C，保持6小時；真空度控制在5Pa以下保持I小時； ⑧真空壓塞出柜 (8)、干熱病毒滅活 干熱溫度100°C,時間為30min 60min。
全文摘要
本專利涉及一種制造人抗凝血酶-III制品的方法，以Cohn低溫乙醇法分離血漿蛋白工藝的組分Ⅳ沉淀為原料，經(jīng)過抽提、壓濾、肝素親和層析、超濾、除菌過濾、凍干等工序以及必要的S/D及干熱病毒滅活工藝，最終制備出高純的抗凝血酶-Ⅲ凍干制品。本方法調(diào)整工藝盡可能使其中的AT-Ⅲ溶解；經(jīng)加入適當(dāng)保護劑以S/D病毒滅活工藝代替巴氏病毒滅活工藝，減少活性損失，縮短制備時間；并且只需一步肝素親和層析就可得到高純度的AT-Ⅲ溶液，再經(jīng)過超濾、冷凍干燥、干熱病毒滅活等步驟，最終制品純度在95%以上，比活在6.5IU/mg以上，高于歐洲藥典及美國藥典規(guī)定限度3.0IU/mg。
文檔編號C07K1/36GK103059129SQ20131003044
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月28日
發(fā)明者胡吉軍, 曹海軍, 葉生亮, 袁靖, 李長清, 陳云華, 劉欣晏, 楊剛 申請人:貴州泰邦生物制品有限公司, 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院輸血研究所