專利名稱：一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及牛冷凍精液精子質(zhì)量評定技術(shù)，尤其涉及ー種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法。
背景技術(shù)：
家畜精液的冷凍保存是20世紀(jì)以來隨著人工授精技術(shù)的廣泛應(yīng)用而產(chǎn)生，通過超低溫降低或抑制精子新陳代謝的速度，使精子生命在相對靜止的狀態(tài)下保存起來，以延長體外存活的時間。精液冷凍保存技術(shù)的應(yīng)用不僅解決了精液長期保存的問題、便于開展國內(nèi)外合作與交流，降低人工授精的成本，而且有利于高效利用優(yōu)秀種公畜的遺傳資源，加快遺傳進(jìn)展，加速品種改良，提高家畜的繁殖效率。人工授精技術(shù)作為養(yǎng)牛業(yè)應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一，雖然目前已經(jīng)取得了良好效果，但一般的研究僅僅涉及不同稀釋液對精液冷凍質(zhì)量的影響，探求適宜的冷凍稀釋液配方。關(guān)于稀釋液中不同成分提高精子活力的機(jī)理，影響精子凍后活力的相關(guān)基因、蛋白及其相互作用和表達(dá)的信號途徑等相對研究較少，由于對其作用機(jī)理不甚清楚，從而影響精液品質(zhì)的進(jìn)ー步提高。
發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于建立一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法。該提取方法探索最優(yōu)精液細(xì)管數(shù)與裂解液搭配比例，從而提高精子蛋白的濃度。實現(xiàn)上述發(fā)明目 的的技術(shù)方案是，一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法，包括下列步驟:
1)將冷凍精液解凍后轉(zhuǎn)移到離心管中，在4で、1000Xg條件下離心5 min，棄上清液；
2)加入Iml預(yù)冷到4°C的PBS洗滌，在4で、1000 X g條件下離心5 min，重復(fù)3次；
3)向上述沉淀中加200W蛋白裂解液(solarbio，RIPA組織/細(xì)胞裂解液)，用渦旋儀(2800 r/min)渦旋混勻，使樣品充分溶解；
4)靜置5min后，在4で、12000 Xg條件下離心30 min，上清即為精子蛋白溶液。本發(fā)明從牛冷凍精子中提取蛋白的提取主要由三個步驟組成，分別是精子的洗滌、精子蛋白的提取和SDS-PAGE精子蛋白的分離，并以HSP90蛋白表達(dá)量與牛精子抗凍性關(guān)系為例說明精子蛋白濃度達(dá)到后續(xù)試驗要求的水平。假陰道法采集9頭牛的精液，測定新鮮精液指標(biāo)(活力、形態(tài)、活率和密度)。精液樣品經(jīng)過冷凍-解凍后檢測其品質(zhì)，并按照凍后精子活力和質(zhì)膜完整性進(jìn)行分組，提取精子蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，經(jīng)Western blot分析，以驗證HSP90含量與精子抗凍性的關(guān)系。SDS-PAGE電泳顯示，不同質(zhì)量精子蛋白樣品中，90 kDa蛋白表達(dá)量差異顯著(P < 0.05)。Western blot分析驗證該蛋白為HSP90，HSP90蛋白的表達(dá)量與冷凍-解凍后的牛精子品質(zhì)具有明顯的相關(guān)性。此結(jié)果表明:通過HSP90的Western blot可以預(yù)測不同精子的抗凍性,冷凍-解凍后,精子中HSP90表達(dá)量越高精子凍后活力越高，而HSP90表達(dá)量越低，其精子凍后活力越低。本發(fā)明為將來從分子手段研究精子冷凍保護(hù)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，可以進(jìn)ー步提升精子冷凍后的活力。
圖1為精子蛋白SDS-PAGE凝膠考馬斯亮藍(lán)染色圖譜。圖2為HSP90蛋白的表達(dá)圖譜。下面結(jié)合發(fā)明人給的具體試驗數(shù)據(jù)和使用方法，進(jìn)步ー步說明本發(fā)明的顯著效果。實施例1
1)將冷凍精液解凍后轉(zhuǎn)移到離心管中，在4で、1000Xg條件下離心5 min，棄上清液；
2)加入Iml預(yù)冷到4 0C的PBS洗滌，在4 V、1000 X g條件下離心5 min,重復(fù)3次； 3)向上述沉淀中加200W蛋白裂解液(solarbio，RIPA組織/細(xì)胞裂解液)，用渦旋儀(2800 r/min)渦旋混勻，使樣品充分溶解；
4)靜置5min后，在4で、12000 Xg條件下離心30 min，上清即為精子蛋白溶液。試驗例I以HSP90蛋白表達(dá)量與牛精子抗凍性關(guān)系進(jìn)行說明
1.SDS-PAGE精子蛋白的分離
蛋白與SDS-PAGE上樣緩沖液混勻后，在95で煮5 min，取20 W蛋白樣品進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后利用考馬斯亮藍(lán)染色，最后用BIO-RAD凝膠成像分析儀對凝膠進(jìn)行拍照，并用Image Lab軟件對蛋白圖譜進(jìn)行分析。本發(fā)明探索了不同冷凍精液細(xì)管數(shù)與蛋白裂解液之間的搭配比例，實驗結(jié)果表明本搭配可以較為徹底地裂解精子細(xì)胞，并使精子蛋白濃度達(dá)到較高的水平，可以進(jìn)行后續(xù)的試驗和分析。圖1.精子蛋白SDS-PAGE凝膠考馬斯亮藍(lán)染色圖譜:a 2只細(xì)管裂解于200 W裂解液中，b 3只細(xì)管裂解于200 W裂解液中，c 4只細(xì)管裂解于200 W裂解液中，d 4只細(xì)管裂解于150 W裂解液中?？梢钥闯觯?只細(xì)管裂解于200 W裂解液時，蛋白濃度最高。2.精液的采集與冷凍
用假陰道法采集種公牛精液，測定射精量后立即保存在37で水浴鍋中。同時在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行精液常規(guī)品質(zhì)檢查，光密度法測定精子密度。將新鮮精液經(jīng)過品質(zhì)評定后，對于合格精液用商用冷凍稀釋液進(jìn)行稀釋，井分裝到聚氯こ烯(PVC)管(0.25 ml)中。冷凍時，首先使用程序冷凍儀，經(jīng)過1.5 h，將細(xì)管精液從37で冷卻到4で，接著在4で條件下平衡2.5 h，然后將細(xì)管冷凍架置于裝有液氮的冷凍箱內(nèi)，并將細(xì)管置于距液氮面2 3 cm處，熏蒸8 10 min，最后浸入液氮中保存。3.精液解凍
將冷凍細(xì)管從液氮罐中迅速取出后，立即投入37で水浴鍋中解凍40 S。所有用于精液品質(zhì)鑒定或蛋白表達(dá)檢測的精子均在同一時間進(jìn)行解凍，以保持樣本處理的一致性。4.精液品質(zhì)檢測
I)精子活率評定對于每ー個樣品，毎次解凍3支細(xì)管凍精，以檢測精液品質(zhì)。采用主觀目測法評定精子活率。細(xì)管精液溶解后立即取10沿精液滴到干凈載玻片上，蓋上蓋玻片后在400 X光學(xué)顯微鏡下評定直線運(yùn)動精子的百分率。毎次至少檢查300個精子，重復(fù)3次。2)精子質(zhì)膜完整性測定將50 W精液稀釋于I ml果糖檸檬酸鈉低滲液中，在37で條件下孵育60 min。取15 W混合均勻的精液懸滴于載玻片上，在400X光學(xué)顯微鏡上觀察，統(tǒng)計尾巴彎曲的精子的百分率。每次至少檢查300個精子，重復(fù)3次。3)精子頂體完整性檢測細(xì)管精液解凍后，轉(zhuǎn)移至離心管中，800Xg離心3 min，棄掉上清液。用37で緩沖液調(diào)整密度，然后吸取30沿精子懸液涂片，干燥后，用甲醇固定，接著加入30 W FITC-PNA染液，37°C避光潮濕環(huán)境下，用緩沖液沖洗，干燥后封片，400 X熒光顯微鏡下觀察，并至少計數(shù)300個精子中頂體完整的精子數(shù)量，統(tǒng)計頂體完整精子的百分率。每個樣品重復(fù)3次。5.試驗設(shè)計
將9頭牛的精液按照完全相同的方式進(jìn)行冷凍處理，解凍后檢測精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性，根據(jù)精子活率和質(zhì)膜完整性統(tǒng)計分析結(jié)果，將其分為兩組:HFR (Highfreezing resistance teams,冷凍-解凍后精子活率高于 40%)和 LFR (Low freezingresistance teams,冷凍-解凍后精子活率低于40%),并且兩組之間統(tǒng)計分析結(jié)果達(dá)到差異顯著的水平(P<0.05)。另外，在分組時舍掉活力居中的ー種精液，每組各包含4個不同牛個體的精液樣品，以保持兩組精液樣品量的一致性。根據(jù)分組結(jié)果，從剩余的8種精液樣品中提取精子蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot分析。整個試驗重復(fù)3次。6.Western blot 分析
SDS-PAGE結(jié)束后，采用半干 法(18 v,45 min)將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，并將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中室溫封閉30 min，與HSP90或P-action—抗4で孵育過夜，然后用辣根過氧化物標(biāo)記的ニ抗繼續(xù)孵育I h。最后與ECL試劑反應(yīng)5 min。7.評定結(jié)果
I) Western blot 結(jié)果，見圖 2。2)冷凍-解凍牛精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整率
冷凍-解凍牛精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整率見表I。從表I可以看出，不同牛個體間凍后精液品質(zhì)相差較大，其中精液樣品1、2、3、6組凍后精子活率偏低，低于40%，而精液樣品5、7、8、9組凍后精子活率較高，最高達(dá)到52.7%，精液樣品4的精子活率居兩者之間，為41.5%。據(jù)此，將9種精液樣品根據(jù)凍后平均精子活率和質(zhì)膜完整性分為兩組，精液樣品
5、7、8和9分為HFR (High freezing resistance teams)組,其平均凍后精子活率和質(zhì)膜完整性大于40% ;精液樣品1、2、3和6分為LFR (Low freezing resistance teams)組,平均凍后精子活率和質(zhì)膜完整性均小于40%。為了平衡兩組精液樣品數(shù)量，保持后續(xù)測定精子蛋白時兩組精液樣品量的一致性，將精液樣品4略棹。統(tǒng)計分析表明，HFR組精子各項指標(biāo)顯著高于LFR組精子(P < 0.05)，達(dá)到后續(xù)試驗分析的要求，見表2。表I冷凍-解凍后牛精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整率
幕W品I精子活率(%) I質(zhì)膜完整性(%) I頂體完整性
135.1±0.2° 37.3±0.9° 33.7±4.1°
2[39- 8±0.1b [41.3 + 2.1ab [40.3 + 2.1bc
權(quán)利要求
1.ー種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法，其特征在于，包括下列步驟:1)將冷凍精液解凍后轉(zhuǎn)移到離心管中，在4で、1000Xg條件下離心5 min，棄上清液；2)加入Iml預(yù)冷到4 0C的PBS洗滌，在4 V、1000 X g條件下離心5 min,重復(fù)3次； 3)向上述沉淀中加200 W蛋白裂解液，渦旋混勻，使樣品充分溶解；4)靜置5 min后，在4で、12000 Xg條件下離心30 min，上清即為精子蛋白溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從牛冷凍精子中提取蛋白的方法，其特征在于，所述的蛋白裂解液是solarbio RIPA組織/細(xì)胞裂解液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從 牛冷凍精子中提取蛋白的方法，其特征在于，所述的渦旋的轉(zhuǎn)速是2800 r/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從牛冷凍精子中提取蛋白的方法，包括以下步驟將冷凍精液解凍后轉(zhuǎn)移到離心管中，在4℃、1000×g條件下離心5min，棄上清液；2)加入1ml預(yù)冷到4℃的PBS洗滌，在4℃、1000×g條件下離心5min，重復(fù)3次；3)向上述沉淀中加200μl蛋白裂解液，渦旋，使樣品充分溶解；4)靜置5min后，在4℃、12000×g條件下離心30min，上清即為精子蛋白溶液。本發(fā)明從牛冷凍精子中提取蛋白的方法操作簡單，為將來從分子手段研究精子冷凍保護(hù)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，可以進(jìn)一步提升精子冷凍后的活力。
文檔編號C07K1/14GK103113454SQ20131002902
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月12日
發(fā)明者胡建宏, 王紅, 李青旺, 王鵬, 洪潔赟, 王艷風(fēng), 侯放亮, 馬國際, 賈永宏 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)