專利名稱：血清學h-y抗原基因dby抗體制備及其xy精子免疫分選法的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領域，具體涉及一種血清學H-Y抗原基因DBY重組抗原肽，及其血清學H-Y抗原基因DBY抗體制備和XY精子免疫分選法。
背景技術(shù)：
雄性特異性弱組織相容性抗原(Malespecific minor histompatibilityantigens, H_Y抗原)最初發(fā)現(xiàn)是作為一種異性間移植抗原，為雄性動物特有的物質(zhì)，在雄性個體中無組織和器官特異性。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)H-Y抗原是糖蛋白，存在于雄性哺乳動物細胞表面。H-Y抗體在哺乳動物性別鑒定和控制的理論和實踐研究上具有重要意義，國內(nèi)外多個實驗室生產(chǎn)了 H-Y抗原抗血清及單克隆抗體，并進行了胚胎的性別鑒定和控制，但由于其抗原的特異性較弱和復雜性，抗體實際應用效果不理想，未能在生產(chǎn)中得到廣泛應用。雄性傳遞偏移現(xiàn)象和性別偏移現(xiàn)象的發(fā)生證明了 X和Y精子間存在非共享蛋白(Hendriksen et al.，1996)，同時血清學H-Y抗原部分抗原表位的成功鑒定、X和Y精子免疫學分離實驗結(jié)果以及Y精子特異性蛋白的檢測結(jié)果都為X和Y精子膜蛋白差異的存在提供了間接的證據(jù)(Grant et al., 2008;Robbins et al., 2008;Zhang et al.，2008)。Blecher等(1999)用色譜柱得到相對保守的牛精子性別特異性蛋白(Sex specificproteins, SSPs),研究發(fā)現(xiàn)SSPs抗體可引起約 半數(shù)的牛精子凝集,未凝集精子體外受精，生產(chǎn)出90%以上雄性胚胎；Souza等(1999)純化并產(chǎn)生了一個針對19kDa的牛精子膜蛋白的單克隆抗體，流式細胞儀分析顯示結(jié)合約60%的精子，免疫組化僅有雄性組織被染色。然而，到目前為止，仍未見用上述法產(chǎn)生性別控制后代的實際應用研究報道。利用H-Y抗原進行胚胎早期性別鑒定和精子的分離應用于生產(chǎn)研究。無論是應用免疫技術(shù)分離X精子與Y精子，還是進行胚胎的性別鑒定，都必須依賴高純度、高效價的特異H-Y抗體。早期研究已分別采用雄性動物細胞免疫雌性動物的方法和單克隆抗體技術(shù)來制備H-Y抗體，但其特異性不強，且操作繁瑣。H-Y抗體純度低、效價不高，這些都限制了 H-Y抗體的應用及H-Y抗原的研究。Y精子的血清學H-Y抗原是一弱自身組織抗原，這為H-Y抗原候選蛋白和抗體的篩選帶來了挑戰(zhàn)，借助基因序列信息和生物信息學技術(shù)來篩選血清學H-Y抗原的候選抗原表位，為血清學H-Y抗體的研究提供了新技術(shù)途徑。DBY基因為血清學H-Y抗原的候選基因之一，定位于Y染色體短臂末梢AZFa區(qū)域Xpll.3-11.23，含有17個外顯子，編碼660個氨基酸殘基，為ATP依賴性RNA解螺旋酶，是DEAD-Box (天冬氨酸-谷氨酸-丙氨酸-天冬氨酸序列)RNA解旋酶基因家族成員之一。DBY的轉(zhuǎn)錄子僅在雄性胚胎細胞中檢測到，在胚胎性腺發(fā)育17.5天DBY基因表達水平達到最高峰，出生后有所降低，但在成年雄性性腺中仍維持較低水平；可育小鼠精子中，DBYmRNA被選擇性保留，并且在受精時通過反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應轉(zhuǎn)移到卵子內(nèi)，在雄性小鼠合子早期受精卵發(fā)育中起重要作用。同時DBY基因編碼一個僅在睪丸中表達的短轉(zhuǎn)錄子，由此推斷DBY在精子發(fā)生過程中起重要作用。
由于DBY基因與X染色體上的對應基因Dbx有較高的同源性，這為DBY特異性抗體的制備帶來很大的難度。利用生物信息學方法分析DBY與DBX間的同源性，去掉高度同源序列區(qū)域，在序列差異區(qū)域選擇DBY特異性抗原表位為特異性抗體的制備提供了新的思路。在本發(fā)明中我們通過選取具有代表性和應運廣泛性的幾個軟件模型來研究DBY蛋白的線性B細胞表位，全面分析了 DBY蛋白的生物特性。分別進行跨膜區(qū)分析和序列比對去除同源區(qū)，利用在線軟件預測獲得優(yōu)選序列區(qū)域，最后用獨立軟件進一步篩選，綜合評價得出抗原肽序列。小鼠DBY蛋白的空間構(gòu)象相關信息還沒有公布，而沒有分析其構(gòu)象表位，所以在DBY抗原肽篩選中我們選取了 3段序列，用于下游實驗抗原肽表達的參考。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種DBY重組抗原肽，及其基于血清學H-Y抗原基因DBY的抗原表位抗體的制備方法和XY精子免疫分選法。一種DBY重組抗原肽，包含以下三段蛋白序列:DBY-1KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY
SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFERSGHSRffSDRSDEDDffSKDBY-1ISIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATDBY-1II
SRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFY剛DGYGGNYNSQAVDffffGN。一種DBY重組抗原肽，蛋白序列如下:KSSDNQNGGGN TESKGRYIPPHLRNRET SKGVCDKDSSGWSCSKDKDAYSSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER
SGHSRffSDRSDEDDffSKPLPACTSIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATAVAAGSSRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFYNNDGYGGNYNSQAVDffffGN。血清學H-Y抗原基因DBY抗體制備方法，是以上述的重組抗原肽為抗原免疫試驗動物，獲得多克隆抗體。所述的重組抗原肽的制備過程如下:提取雄性小鼠腦組織中總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，設計特異性引物
DBV-1 -F5、GCCK〕AAnCGACC-似
DBY-1 -R5’-CCGGAGCTCTGGTTTTGTCATC-3，
DBY Il-F5:-GGCGAGCTCTTTC'AAGTATGCG'
DBY [1-R5,-GGGTCG ACC ACTA A ACTTTCG-r
DB^IIl-F5’-CGGTCGACGGACGTTAGCAGA-3’
DBY-1l 1-R5 -G C G A A Cj CTTA C CAA ATGTTGTGo '，將3段DBY抗原肽核酸片段擴增出來；將抗原肽核酸片段分別克隆進入pMD18_T載體，篩選陽性質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切(見表I)后，將DBY1、DBY2和DBY3核酸片段用T4連接酶連接后克隆入pET-32a表達載體中，篩選出陽性克隆質(zhì)粒pET-32a-DBY，然后進行原核表達，獲得的DBY重組抗原肽進行純化。XY精子免疫分選法，以上述制備的抗體與動物精子進行免疫反應,來鑒別或者分離X和Y精子。所述的動物精子包括小鼠的精子。本發(fā)明的創(chuàng)新性在于:精子分離需要X和Y精子之間存在可檢測的差異，到目前為止，只有利用DNA結(jié)合的染料直接檢測DNA含量的流式細胞分離X和Y精子是行之有效的方法，在牛性別選擇方面得到商業(yè)應用(準確度可達90%以上)。但使用流式細胞儀作為性別選擇常規(guī)工具應用于動物育種是相對低效的，因為每單位時間內(nèi)產(chǎn)生的精子是有限的，性別控制精液的精子數(shù)量比正常精液低，；需要價格昂貴的專門設備(Seidel，2003)、專利授權(quán)和操作高度熟練的的技術(shù)人員(Hendriksen，1999)，此法未得到廣泛應用。而且精子在分離、后續(xù)的處理、保存、使用等階段都可能受到許多因素(高度稀釋、核染色、機械高壓、激光照射、離心、冷凍等)的損害，使得分離精子活力、精液的密度等精子的常規(guī)性狀受到影響，導致牛性控后代出現(xiàn)個體差異(Rath et al.2009,陸陽清，2005, Spinaciet al.，2006; Berme jo-人丨varezet al., 2008) 0免疫學分選方法可避免或減少與DNA含量檢測有關的影響。本發(fā)明探求X和Y精子表面的特異性標記蛋白的序列和結(jié)構(gòu)信息，首次利用Y精子特異性表面抗原(血清學檢測H-Y抗原復合物)的候選基因DBY抗原表位制備抗體，建立了簡單、高效的X和Y精子免疫學分選法。
圖1為pET-32a_DBY誘導表達結(jié)果圖；1:37°C , Oh ；2:37°C，Ih ；3:37°C,3h ；4:37°C,6h 沉淀；5:37°C,6h 上清；6:30°C,6h 沉淀；7:30°C,6h 上清；圖2為DBY多肽抗血清與雌鼠脾細胞進行細胞免疫熒光反應結(jié)果(200倍)；圖3為DBY多肽抗血清與雄鼠脾細胞進行細胞免疫熒光反應結(jié)果(200倍)；圖4為小鼠精子細胞免疫熒光反應統(tǒng)計結(jié)果；圖5為DBY多肽抗血清與小鼠精子反應結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施方式
進一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。1、DBY抗原肽的生物信息學預測和篩選利用DNAStar 軟件 PROTEAN program (Gamier-Robson program)、在線蛋白質(zhì)分析工具 ABCpred servers(http://www.1mtech.res, in/raghava/abcpred/)、BepiPredl.0servers (http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred)等生物信息學技術(shù)，分別從蛋白質(zhì)跨膜區(qū)、一級結(jié)構(gòu)同源性、二級結(jié)構(gòu)、親水性、可塑性、表面可極性以及抗原指數(shù)等方面，綜合分析DBY蛋白全序列的結(jié)構(gòu)特性，同時我們對DBY蛋白進行跨膜區(qū)預測。雄性個體的DBY與雌性個體的DBX進行序列比對，去除冗余序列和同源的重復序列進一步縮小預測范圍。最后結(jié)合在線線性B細胞軟件預測結(jié)果篩選出3段DBY抗原肽序列(DBY-1，DBY-1I，DBY-1II，見序列表)。2、DBY抗原肽的原核表達利用Trizol法提取雄性小鼠腦組織中總RNA,再用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，根據(jù)3段DBY抗原肽序列(DBY-1 ,DBY-1I，DBY-1II)設計特異性引物(見表1)，將3段DBY抗原肽核酸片段擴增出來。將抗原肽核酸片段分別克隆進入PMD18-T載體(大連寶生物工程有限公司)，提取重組質(zhì)粒進行PCR鑒定和測序驗證。然后用原核表達載體pET-32a(大連寶生物工程有限公司)，進行原核表達，獲得的DBY抗原肽(見序列表)用His純化試劑盒進行純化。表IDBY抗原肽引物設計結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種DBY重組抗原肽，其特征在于，包含以下三段蛋白序列:DBY-1KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAYSSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFERSGHSRffSDRSDEDDffSKDBY-1ISIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILVATDBY-1IISRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGSSHNRGFGGGGYGGFYNNDGYGGNYNSQAVDffffGN。
2.—種DBY重組抗原肽，其特征在于，蛋白序列如下: KSSDNQNGGGNTESKGRYIPPHLRNRETSKGVCDKDSSGWSCSKDKDAY SSFGSRDSRGKPNYFSDRGSGSRGRFDDHGRNDYDGIGGRDRTGFGKFER SGHSRffSDRSDEDDffSKPLPACTSIHGDRSQKDREEALHQFRSGRKPILV ATAVAAGSSRGRSKSRFSGGFGARDYRQSSGSANAGFNSNRANSSRSSGS SHNRGFGGGGYGGFY剛DGYGGNYNSQAVDffffGN0
3.血清學H-Y抗原基因DBY抗體制備方法，其特征在于， 以權(quán)利要求2所述的重組抗原肽為 抗原免疫試驗動物，獲得多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于， 所述的重組抗原肽的制備過程如下: 提取雄性小鼠腦組織中總RNA，再用逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，設計特異性引物 DBY-1-F5,-GCGGAATTCGA€CTGAAAGAT-3,DBY-1 -R5' -C'CGGAGC-1 (:' IGGTTTTGTC'/VIC'-.3:DBY I1-F55-GGCGAGCTCTTTCAAGTATGCG-3’DBY [1-R5 '-GGGTCGACCACTAAACTTTCG-31DBY-1I1-F5’-CGGTCGACGGACGTTAGCAGA-3’ BV-1ll-R5 ■■(；( (i A A (i('iIA( ('A A AK.'I i(i Ki " ，將3段DBY抗原肽核酸片段擴增出來；將抗原肽核酸片段分別克隆進入PMD18-T載體，篩選陽性質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切后，將DBY1、DBY2和DBY3核酸片段用T4連接酶連接后克隆入pET-32a表達載體中，篩選出陽性克隆質(zhì)粒 pET-32a-DBY,然后進行原核表達，獲得的DBY重組抗原肽進行純化。
5.XY精子免疫分選法，其特征在于，以權(quán)利要求3或4制備的抗體與動物精子進行免疫反應，來鑒別或者分離X和Y精子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的免疫分選法，其特征在于，所述的動物精子包括小鼠的精子。
全文摘要
本發(fā)明公開了血清學H-Y抗原基因DBY抗體制備及其XY精子免疫分選法。利用生物信息學方法預測并篩選出血清學H-Y抗原基因DBY的3個B細胞表位抗原肽，連接、重組、原核表達，得到了高純度的DBY重組抗原肽。以重組抗原肽為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得效價高、特異性強的多克隆抗體。利用DBY抗體結(jié)合流式細胞技術(shù)分選出約63.2±4.5%精子。本發(fā)明建立了以血清學H-Y抗原基因DBY抗體為基礎的X和Y精子的免疫分選法，利用該抗體來分離X和Y精子，可建立簡單、高效、安全的性別選擇的理想方法，可更好地控制種用品種(或品種)的遺傳改良，獲得更快的遺傳進展和畜牧業(yè)生產(chǎn)與管理的效率優(yōu)勢。
文檔編號C07K16/40GK103114079SQ20131002877
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月25日
發(fā)明者王乃東, 譚慶輝, 薛立群, 袁安文, 許道軍 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學