專利名稱：一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的純化方法。本發(fā)明在純化工藝中采用了反相填料的精細(xì)分離純化步驟。同現(xiàn)有技術(shù)相比較，可以大幅度地提高重組人粒細(xì)胞刺激因子的純度、比活及穩(wěn)定性。
背景技術(shù)：
重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(rhG-CSF)是特異作用于粒系祖細(xì)胞、促進(jìn)其向成熟中性粒細(xì)胞增殖、分化的造血生長(zhǎng)因子。具有以下功能1.促進(jìn)骨髓移植后中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)增加。 2.癌癥化療引起的中性粒細(xì)胞減少。3.骨髓異常增生綜合癥伴發(fā)的中性粒細(xì)胞減少癥。4.再生障礙性貧血伴發(fā)的中性粒細(xì)胞減少癥。5.先天性、特發(fā)性中性粒細(xì)胞減少癥。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子已經(jīng)可以通過基因重組生物工程技術(shù)進(jìn)行量產(chǎn)。但其純化工藝經(jīng)過多年研究始終難以解決其純度問題，且比活下降明顯，如現(xiàn)有技術(shù)“粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)在大腸桿菌中的高效表達(dá)及快速純化工藝的建立”中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)《 1998，Vol. 14描述了以下技術(shù)方案稀釋復(fù)性蛋白，之后一步S P — S epharoseF F柱層析至均質(zhì).純化的G —C S F蛋白比活性達(dá)3. 4X 108U/mg，每升表達(dá)菌液回收的G —C S F總活性達(dá)1.06X10nU/mgU.純化產(chǎn)物的N—端氨基酸序列分析表明，對(duì)甲硫氨酸的去除徹底，用于人體時(shí)可能具有較小的免疫原性和毒性。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化《微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展》1998年02期描述了以下技術(shù)方案包涵體變性復(fù)性后，r h G — C S F的活性得到恢復(fù)。用離子交換和疏水層析純化了 r h G — C S F，比活性達(dá)1. 57X 108U/mg，純度大于9 8%。本發(fā)明經(jīng)過對(duì)不同純化工藝的研究，篩選出一種純化方法，其技術(shù)方案是在純化工藝中采用了反相填料的精細(xì)分離純化步驟。包括步驟a、選用工程菌做菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c、對(duì)精制包涵體進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性產(chǎn)物；d、對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產(chǎn)物；e、對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產(chǎn)物；f、對(duì)陽離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行精細(xì)分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。同現(xiàn)有技術(shù)相比較，采用本專利的反相填料精細(xì)分離，rhG-CSF電泳純度由90%提高到99 %，HPLC純度由90 %提高到99 %，其比活由O. 8 X 107U/mg提高到3 X 108U/mg?？梢?，采用本發(fā)明的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化工藝，可以大幅度的提高rhG-CSF的純度、比活，以及穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種rhG-CSF的純化方法，該方法包括以下步驟
a、選用工程菌做菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；C、對(duì)精制包涵體進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性產(chǎn)物；d、對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產(chǎn)物；e、對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產(chǎn)物；f、對(duì)陽離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行精細(xì)分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。
其中步驟a_c屬于現(xiàn)有技術(shù)，可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中的方法獲得。本發(fā)明所述的步驟d_f屬于純化步驟，屬于本發(fā)明的技術(shù)方案，其中，優(yōu)選的技術(shù)方案如下陰離子柱層析(XK50/30層析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L pH8. 2 Tris-HCl緩沖液)，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min。平衡8_10倍柱床體積。樣品預(yù)處理將復(fù)性產(chǎn)物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl調(diào)其pH值為8. 2，然后超濾濃縮至復(fù)性體積的1/10，即為上樣液。上樣上樣時(shí)泵流速為8. 0-49. 9ml/min。上樣結(jié)束后用平衡液平衡2_4個(gè)柱床體積。洗脫使用預(yù)洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液)進(jìn)行預(yù)洗，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min，洗脫2_4個(gè)柱床體積。然后將進(jìn)液管換至洗脫液(20mmol/L pH7. 8NaH2P04-Na2HP04緩沖液、O.1MNaCL)中，開始目標(biāo)峰洗脫，收集OD28tl大于O. 3洗脫峰。陽離子柱層析(XK50/30層析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L pH4. 5 HAc-NaAc緩沖液)，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床體積。上樣上樣液為上步得到的OD28tl大于O. 3的洗脫液，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min,開始上樣。上樣結(jié)束后，換至平衡液中，平衡2-4個(gè)柱床體積，至記錄筆回至基線。用預(yù)洗液(20mmol/L pH4. 5HAc_NaAc緩沖液、O. 15 MNaCL)進(jìn)行預(yù)洗，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min,至雜質(zhì)峰洗下為止。換至洗脫液(50mmol/LpH4. 5HAc-NaAc緩沖液、O. 2MNaCL進(jìn)行洗脫目的峰，收集OD28tl大于O. 3的洗脫峰。反相填料層析采用Pharmacia 公司的預(yù)裝型 SOURCE 5RPC 4. 6/150 柱(粒徑 5 μ m，4. 6 X 150mm、柱溫度2-6°C，流速l.Oml/min)。配制洗脫液A為含IOOmmolNaCl溶液IOmmol pH= 8.0Tris-HCl 緩沖液，洗脫液 B 為含 IOOmmolNaCl、50% 乙腈的 IOmmol pH= 8.0 Tris-HCl 緩沖液。先用洗脫液A洗脫；再用梯度20%-80%洗脫液B洗脫，15-35分鐘收集樣品峰。被收集的樣品經(jīng)低溫蒸發(fā)，除去有機(jī)物質(zhì)，然后透析濃縮后保存在2-8°C條件下。rhG-CSF經(jīng)陽離子交換層析分離純化樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳后，用凝膠成像掃描系統(tǒng)分析，其電泳純度為90 %，HPLC純度為90 %，其比活能達(dá)到O. 8 X 107U/mg，在2_8°C條件下放置該樣品3個(gè)月其電泳純度和活性均無顯著性變化。放置6個(gè)月其純度和比活降低?？纱_定穩(wěn)定性可以保證3個(gè)月。rhG-CSF經(jīng)反相填料層析分離純化樣品經(jīng)取樣檢測(cè)，其電泳純度與HPLC純度均大于99%，經(jīng)測(cè)定其比活可達(dá)到3.0X108U/mg。該樣品在4°C條件下放置12個(gè)月，該樣品電泳純度和活性均無顯著性變化。穩(wěn)定性可以保證12個(gè)月。其他質(zhì)量控制項(xiàng)目均符合藥典要求。采用本發(fā)明的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的純化工藝，可以大幅度地提高rhG-CSF的純度、比活、穩(wěn)定性。本發(fā)明的工藝方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下層析方式的選擇針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)設(shè)計(jì)了 5種層析方式，用這5種方式對(duì)復(fù)性溶液進(jìn)行純化，然后進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種rhG-CSF的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；C、對(duì)精制包涵體進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性產(chǎn)物；d、對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產(chǎn)物；e、對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產(chǎn)物；f、對(duì)陽離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行精細(xì)分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的純化方法，其特征在于，所述對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理方法如下陰離子柱層析(XK50/30層析柱，Q sepharose FF填料)使用平衡液(20mmol/L pH8. 2 Tris-HCl緩沖液)，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min，平衡8-10倍柱床體積，樣品預(yù)處理將復(fù)性產(chǎn)物用2mol/L pH8. 2 Tris-HCl調(diào)其pH值為8. 2，然后超濾濃縮至復(fù)性體積的1/10，即為上樣液，上樣上樣時(shí)泵流速為8. 0-49. 9ml/min，上樣結(jié)束后用平衡液平衡2_4個(gè)柱床體積，洗脫使用預(yù)洗液(20mmol/L pH7. 8 NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液)進(jìn)行預(yù)洗，調(diào)節(jié)泵流速為30.0-49.91111/1^11，洗脫2-4個(gè)柱床體積，然后將進(jìn)液管換至洗脫液(20臟01/1 pH7. 8 NaH2P04-Na2HP04緩沖液、O.1MNaCL)中，開始目標(biāo)峰洗脫，收集OD28tl大于O. 3洗脫峰。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的純化方法，其特征在于，所述對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽離子柱層析，方法如下陽離子柱層析(XK50/30層析柱，CM Sepharose FF填料)平衡使用平衡液(20mmol/L pH4. 5 HAc-NaAc緩沖液)，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/ min，平衡8_10倍柱床體積，上樣上樣液為上步得到的OD28tl大于O. 3的洗脫液，調(diào)節(jié)泵流速為30. 0-49. 9ml/min, 開始上樣，上樣結(jié)束后，換至平衡液中，平衡2-4個(gè)柱床體積，至記錄筆回至基線，用預(yù)洗液 (20mmol/L pH4. 5HAc-NaAc 緩沖液、O. 15 MNaCL)進(jìn)行預(yù)洗，調(diào)節(jié)泵流速為 30. 0-49. 9ml/ min,至雜質(zhì)峰洗下為止,換至洗脫液(50mmol/LpH4. 5HAc-NaAc緩沖液、O. 2 MNaCL進(jìn)行洗脫目的峰，收集OD28tl大于O. 3的洗脫峰。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的純化方法，其特征在于，所述對(duì)陽離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行精細(xì)分離， 采用反相填料柱層析處理，方法如下反相填料層析采用 Pharmacia 公司的預(yù)裝型 SOURCE 5RPC 4. 6/150 柱(粒徑 5 μ m，4. 6 X 150mm、柱溫度2_6°C,流速1. Oml/min),配制洗脫液A為含 IOOmmolNaCl 溶液 IOmmol pH= 8. O Tris-HCl 緩沖液，洗脫液B為含IOOmmolNaCl、50%乙腈的IOmmol pH= 8.0 Tris-HCl緩沖液，先用洗脫液A洗脫；再用梯度20%-80%洗脫液B洗脫，15-35分鐘收集樣品峰，被收集的樣品經(jīng)低溫蒸發(fā)，除去有機(jī)物質(zhì)，然后透析濃縮后保存在2-8 °C條件下。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的純化方法，該方法包括以下步驟a、選用工程菌做菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)；b、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)所得菌體進(jìn)行包涵體的分離和洗滌，得到精制包涵體；c、對(duì)精制包涵體進(jìn)行復(fù)性，得到復(fù)性產(chǎn)物；d、對(duì)復(fù)性產(chǎn)物進(jìn)行陰離子柱層析處理，得到陰離子柱層析產(chǎn)物；e、對(duì)陰離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行陽離子柱層析，得到陽離子柱層析產(chǎn)物；f、對(duì)陽離子柱層析產(chǎn)物進(jìn)行精細(xì)分離，采用反相填料柱層析處理，得到重組人粒細(xì)胞集落刺激因子。
文檔編號(hào)C07K1/18GK103014100SQ20121056982
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者王偉權(quán), 陸剛, 陳玉軍, 龐睿, 李邦東, 牛國(guó)玲, 于俊清, 楊鳳鐸, 陶永寶, 趙海丹, 宋成君 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)生物工程有限公司