專利名稱：一種卡貝縮宮素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽的純化技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及卡貝縮宮素的純化技術(shù)。
背景技術(shù)：
卡貝縮宮素(Carbetocin)是一種合成的具有激動(dòng)劑性質(zhì)的長(zhǎng)效催產(chǎn)素九肽類似物，對(duì)非妊娠的子宮沒有作用，但是對(duì)妊娠的子宮和剛生產(chǎn)的子宮具有有效的子宮收縮作用，其臨床和藥理特性與天然產(chǎn)生的催產(chǎn)素類似。像催產(chǎn)素一樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產(chǎn)素受體結(jié)合，引起子宮的節(jié)律性收縮，在原有的收縮基礎(chǔ)上，增加其頻率和增加子宮張力。在非妊娠狀態(tài)下，子宮的催產(chǎn)素受體含量很低，在妊娠期間增加，分娩時(shí)達(dá)高峰。硬膜外或腰麻下剖腹產(chǎn)術(shù)后可以立即單劑量靜脈給藥，以預(yù)防子宮張力不足和產(chǎn)后出血。不論是靜脈注射還是肌肉注射卡貝縮宮素后，子宮迅速收縮，可在兩分鐘內(nèi)達(dá)到一個(gè)明確強(qiáng)度。單劑量靜脈注射卡貝縮宮素對(duì)子宮的活性作用可持續(xù)大約一個(gè)小時(shí)，因此足以預(yù)防剛生產(chǎn)后的產(chǎn)后出血。產(chǎn)后給予卡貝縮宮素后，在收縮的頻率與幅度方面都比催產(chǎn)素要長(zhǎng)，并且對(duì)有出血傾向、需額外使用縮宮素者，卡貝縮宮素耐受性好，與縮宮素一樣有效甚至更有效。目前臨床常用的促進(jìn)子宮縮收藥物麥角新堿，會(huì)導(dǎo)致惡心、嘔吐、高血壓和冠脈痙攣等?？ㄘ惪s宮素是一種長(zhǎng)效的類催產(chǎn)素藥物。與麥角新堿相比，使用卡貝縮宮素在預(yù)防陰道分娩婦女的產(chǎn)后出血方面同樣有效，并且惡心、嘔吐、高血壓的發(fā)生比例顯著降低。因此，卡貝縮宮素在臨床應(yīng)用上，具有廣闊的市場(chǎng)前景?？ㄘ惪s宮素常用純化方法通常包括反相高效液相色譜法、凝膠法、離子交換法等，采用任何一種單一方法，都很難分離得到高純產(chǎn)品(< 99%)，或者收率較低(小于50%)。目前，很少有關(guān)于其分離純化方面的研究報(bào)道，程生強(qiáng)，馬亞平等在其研究中報(bào)道，以磷酸緩沖液作為洗脫液，采用反相高效液相色譜法純化卡貝縮宮素，并采用離子交換法轉(zhuǎn)鹽，得到醋酸卡貝縮宮素，收率為70%-75%，目的肽純度為98%。綜合分析國內(nèi)外關(guān)于合成卡貝縮宮素的純化方法，主要存在兩點(diǎn)問題①采用單一的純化方法，產(chǎn)品純度低；②采用多種純化手段，產(chǎn)品收率低。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有工藝的不足，提出一種卡貝縮宮素的分離純化方法，產(chǎn)品純度高，純化收率高。為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案采用反相離子對(duì)液相色譜法，將反相色譜和離子色譜的優(yōu)勢(shì)結(jié)合起來，減少純化步驟，提高產(chǎn)品純度，其方法包含以下步驟
步驟一、采用反相離子對(duì)液相色譜法，以反相色譜柱為固定相，一定濃度離子對(duì)試劑水溶液為流動(dòng)相A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動(dòng)相B相，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度B%為5-40%,優(yōu)選25%-35%，分三段收集目的峰，分別為峰前、合格品、峰后，合格品為純度達(dá)到99. 5%部分，峰前部分保留時(shí)間小于合格品的保留時(shí)間，純度為90. 0%-99. 5%，峰后部分保留時(shí)間大于合格品的保留時(shí)間，純度為90. 0%-99. 5%。步驟二、將以上①步得到峰前、峰后部分分別純化，采用反相離子對(duì)液相色譜法，以反相色譜柱為固定相，一定濃度離子對(duì)試劑水溶液為流動(dòng)相A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動(dòng)相B相，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度B%為5-40%，優(yōu)選25%-35%，將得到的合格品合并，得到純度為99. 5%以上的目的肽。步驟三、將以上得到的合格品，采用反相離子對(duì)液相色譜法，以反相色譜柱為固定相，一定濃度的補(bǔ)償離子水溶液為A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動(dòng)相B相，進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度B%為10-80%,優(yōu)選30%-70%，將得到的合格品合并，得到純度為99. 5%以上的目的肽。
將洗脫液添加補(bǔ)償離子，包括醋酸、磷酸、鹽酸、三氟乙酸等，得到不同鹽形式的卡貝縮
宮素。與已有工藝相比，本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，一步純化達(dá)到99. 5%的純度，收率達(dá)到70%-75%，具有明顯的成本優(yōu)勢(shì)。
具體實(shí)施例方式本文所述，術(shù)語“反相離子對(duì)色譜法”指以反相填料為固定相，離子對(duì)試劑為流動(dòng)相的色譜行為，或者是以離子交換填料為固定相，有機(jī)溶劑為流動(dòng)相的色譜行為，目的是結(jié)合離子色譜和反相色譜的優(yōu)勢(shì)，高效分離純化合成卡貝縮宮素。本文所述，術(shù)語“離子對(duì)試劑”包括R-SO3Na或R-SO4Na,其中R選自甲基、乙基、
丙基、丁基、戍基、己基、庚基、羊基、壬基、癸基、十一燒基、十_■燒基、十二燒基、十四燒基、十五烷基、十六烷基。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。實(shí)施例I :
I、預(yù)處理將待純化卡貝縮宮素配制成濃度為200-300mg/ml的水 溶液，經(jīng)孔徑為O. 45um的微孔濾膜過濾，收集濾液。反相色譜柱預(yù)處理使用60%的乙腈水溶液沖洗色譜柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。離子交換色譜柱預(yù)處理濃度為2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用純水洗至中性。2、分離純化取濾液，注入處理好的色譜柱進(jìn)行分離純化，對(duì)目的洗脫
液劃分峰為前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分純度90%-99. 5%，合格品部分純度大于99. 5%，峰后部分純度90%-99. 5% ;分別將峰前、峰后部分洗脫液分離純化，色譜條件與原始樣品的分離純化相同。合并合格品，備用。分離純化色譜條件色譜柱以反相C18為固定相的色譜柱，柱子規(guī)格為50mmX 250mm ;流動(dòng)相A相10mmol/L的庚燒磺酸鈉,磷酸調(diào)pH至2. O ,流動(dòng)相B相乙腈，流速為80ml/min ;梯度以乙腈濃度計(jì)，25%-35%，時(shí)間為40min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;上樣量 l_1.2g
3、脫鹽、干燥將經(jīng)分離純化后卡貝縮宮素合格品注入預(yù)處理好的色譜柱，梯度洗脫，收集目的肽；將脫鹽后的卡貝縮宮素目的肽濃縮至120-150mg/ml，低溫冷凍干燥得到凍干粉。產(chǎn)品純度為99. 7%，收率為72. 8%。脫鹽色譜條件色譜柱陽離子交換樹脂普爾樹脂D201，柱子直徑和長(zhǎng)度50mmX 400mm;流動(dòng)相A相0· 1%的醋酸水溶液，流動(dòng)相B相乙醇；洗脫梯度以乙醇濃度計(jì)，30-70%，時(shí)間為70min;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;上樣量4. 5-5. Ogo實(shí)施例2
I、預(yù)處理將待純化卡貝縮宮素配制成濃度為200-300mg/ml的水 溶液，經(jīng)孔徑為O. 45um的微孔濾膜過濾，收集濾液。 反相色譜柱預(yù)處理使用60%的乙腈水溶液沖洗色譜柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。離子交換色譜柱預(yù)處理濃度為2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用純水洗至中性。2、分離純化取濾液，注入處理好的色譜柱進(jìn)行分離純化，對(duì)目的洗脫
液劃分峰為前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分純度90%-99. 5%，合格品部分純度大于99. 5%，峰后部分純度90%-99. 5% ;分別將峰前、峰后部分洗脫液分離純化，色譜條件與原始樣品的分離純化相同。合并合格品，備用。分離純化色譜條件色譜柱以反相C18為固定相的色譜柱，柱子規(guī)格為50mmX250mm;流動(dòng)相A相l(xiāng)Ommol/L的十二烷基磺酸鈉，磷酸調(diào)pH至2. O，流動(dòng)相B相乙腈，流速為80ml/min ;梯度以乙腈濃度計(jì)，25% -35%，時(shí)間為40min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ；上樣量1-1. 2g
3、脫鹽、干燥將經(jīng)分離純化后卡貝縮宮素合格品注入預(yù)處理好的色譜柱，梯度洗脫，收集目的肽；將脫鹽后的卡貝縮宮素目的肽濃縮至120-150mg/ml，低溫冷凍干燥得到凍干粉。產(chǎn)品純度為99. 7%，收率為75. 1%。脫鹽色譜條件色譜柱陽離子交換樹脂普爾樹脂D201，柱子直徑和長(zhǎng)度50mmX 400mm;流動(dòng)相A相0· 1%的醋酸水溶液，流動(dòng)相B相乙醇；洗脫梯度以乙醇濃度計(jì)，30-70%，時(shí)間為70min;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;上樣量4. 5-5. Ogo實(shí)施例3
I、預(yù)處理將待純化卡貝縮宮素配制成濃度為200-300mg/ml的水 溶液，經(jīng)孔徑為O. 45um的微孔濾膜過濾，收集濾液。反相色譜柱預(yù)處理使用60%的乙腈水溶液沖洗色譜柱6min，再用5%的乙腈水溶液洗6min。離子交換色譜柱預(yù)處理濃度為2mol/L的NaOH水溶液再生6min，再用純水洗至中性。2、分離純化取濾液，注入處理好的色譜柱進(jìn)行分離純化，對(duì)目的洗脫
液劃分峰為前、合格品、峰后共三段收集，峰前部分純度90%-99. 5%，合格品部分純度大于99. 5%，峰后部分純度90%-99. 5% ;分別將峰前、峰后部分洗脫液分離純化，色譜條件與原始樣品的分離純化相同。合并合格品，備用。分離純化色譜條件色譜柱以反相C18為固定相的色譜柱，柱子規(guī)格為50mmX 250mm ;流動(dòng)相A相10mmol/L的庚燒磺酸鈉,磷酸調(diào)pH至7. O ,流動(dòng)相B相乙腈，流速為80ml/min ;梯度以乙腈濃度計(jì)，26%-36%，時(shí)間為40min ;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;上樣量 l_1.2g
3、脫鹽、干燥將經(jīng)分離純化后卡貝縮宮素合格品注入預(yù)處理好的色譜柱，梯度洗脫，收集目的肽；將脫鹽后的卡貝縮宮素目的肽濃縮至120-150mg/ml，低溫冷凍干燥得到凍干粉。產(chǎn)品純度為99. 7%，收率為71. 6%。脫鹽色譜條件色譜柱陽離子交換樹脂普爾樹脂D301，柱子直徑和長(zhǎng)度50mmX 400mm;流動(dòng)相A相0· 1%的醋酸水溶液，流動(dòng)相B相乙醇；洗脫梯度以乙醇濃度計(jì)，30-70%，時(shí)間為70min;檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm ;上樣量4. 5-5. Ogo 綜上，反相離子對(duì)液相色譜法分離純化合成卡貝縮宮素，產(chǎn)品純度高，收率高，適合合成多肽的分離純化。以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種卡貝縮宮素的純化方法，包括以下步驟 ①、采用反相離子對(duì)液相色譜法分離純化卡貝縮宮素粗肽以反相色譜填料為固定相，一定濃度的離子對(duì)試劑水溶液為流動(dòng)相A相，甲醇或乙腈或乙醇為流動(dòng)相B相，純化后得到純度為99. 5%以上的精肽、采用離子交換色譜法脫除精肽中離子對(duì)試劑及其它鹽將精肽溶液調(diào)至合適PH，使得卡貝縮宮素結(jié)合在離子交換樹脂上，用純水沖洗除去無機(jī)鹽和大部分離子對(duì)試劑，再使用一定比例的乙醇水溶液梯度洗脫，將離子對(duì)試劑和卡貝縮宮素分開，得到無鹽卡貝縮宮素乙醇水溶液。
2.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于所述反相色譜填料包括C18、C8、C4，但不僅限于 C18、C8、C4。
3.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于所述離子對(duì)試劑包括R-SO3Na或R-SO4Na,其中R選自甲基、乙基、丙基、丁基、戍基、己基、庚基、羊基、壬基、癸基、十一燒基、十_■燒基、十二燒基、十四燒基、十五燒基、十TK燒基。
4.如權(quán)利要求I或3所述方法，其特征在于離子對(duì)試劑水溶液濃度為0.002-0. 100mol/L，流動(dòng)相 A 相 pH 值為 I. 5-8. O。
5.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于離子交換樹脂包括陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。
6.如權(quán)利要求I或5所述方法，其特征在于當(dāng)采用陽離子交換樹脂時(shí)，精肽溶液pH值調(diào)至I. 0-3. 5 ;當(dāng)采用陰離子交換樹脂時(shí)，精肽溶液pH值調(diào)至5. 0-10. O。
7.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于精肽溶液上離子交換柱后，采用梯度洗脫的方法，洗脫相A相為醋酸水溶液，鹽酸水溶液，三氟醋酸水溶液，磷酸水溶液，洗脫相B相為甲醇，乙醇。
8.如權(quán)利要求I所述方法，其特征在于收取卡貝縮宮素目的峰，得到卡貝縮宮素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種合成卡貝縮宮素的純化方法，該方法包括了反相離子對(duì)液相色譜純化合成粗肽，通過離子交換樹脂將離子對(duì)試劑脫除，最終得到純度為99.5%的卡貝縮宮素精肽。反相離子對(duì)液相色譜的運(yùn)用，大大提高了純化收率和產(chǎn)品純度。
文檔編號(hào)C07K1/20GK102977192SQ20121051890
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月6日
發(fā)明者陳阿娜 申請(qǐng)人:安徽工程大學(xué)