一種在酵母中重組表達(dá)生產(chǎn)人胸腺肽的方法

專(zhuān)利名稱(chēng)：一種在酵母中重組表達(dá)生產(chǎn)人胸腺肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用酵母重組表達(dá)生產(chǎn)人胸腺肽的方法。
背景技術(shù)：
多肽對(duì)人體具有非常重要的不可替代的調(diào)節(jié)作用，這種作用幾乎涉及到人體的所有生理活動(dòng)。對(duì)人體的免疫系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，多肽尤其是胸腺肽或胸腺素(Thymosins)顯得更加重要和直接。胸腺肽是一種應(yīng)用較早的免疫藥物(Goldstein AL. 2007. History of thediscovery of the thymosins. Ann N YAcad Sci. 1112:1-13)。胸腺妝是由胸腺上皮細(xì)胞所分泌，含有40多種組分的一類(lèi)多肽激素混合物，由Goldstein等于1966年首次從胎牛胸腺蛋白提取液中發(fā)現(xiàn)，其水平與機(jī)體的免疫功能密切相關(guān)。根據(jù)這些多肽在等電聚焦電泳分析圖譜上的位置，可以劃分為三型。其中pl < 5的為a ；5 < pi < 7的為β ；pl > 7 的為 Y (Goldstein AL, Slater FD, White A. 1966. Preparation, assay, andpartialpurification of a thymiclymphotopoietic factor (thymosin). Proc NatAcadSci USA. 56:1010-1017)。在β型胸腺肽中，目前已經(jīng)有20多種異構(gòu)體被鑒定出來(lái)，而人體內(nèi)主要存在三種胸腺肽β4, β 10和β 15。由于近年來(lái)發(fā)現(xiàn)胸腺肽β家族成員的功能不僅僅局限于與肌動(dòng)蛋白結(jié)合，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，而且在其他多方面均有作用。同時(shí)，胸腺肽β家族新的功能也為一些疾病的診斷和治療提供了新的研究思路，從而越來(lái)越多地引起眾多研究者的注意(Goldstein AL, Hannappel E, Sosne G, Kleinman HK. 2012. Thymosinβ 4:a multi-functional regenerative peptide.Basic properties and clinicalapplications. Expert Opin Biol Ther. 12:37-51) 尤其是胸腺肽 β 4 (T β 4)在胸腺肽β家族中豐度最高，廣泛分布于各組織、器官和細(xì)胞中。已有大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明Τβ 4與免疫功能、神經(jīng)發(fā)育和肌動(dòng)蛋白功能密切(Hannappel E. Beta-Thymosins. 2007. Ann N YAcad Sci. 1112:21-37) 0Τβ 4還具促進(jìn)血管生成(Smart N，Rossdeutsch A, Riley P. 2007.Thymosin beta 4 and angiogenesis:Modes of action and therapeuticpotential.Angiogenesis. 10:229—241;Freeman KWj Bowman BR，ZetterBR. 2011. Regenerativeprotein thymosin beta-4 is a novel regulator ofpurinergic signaling.FASEBJ. 25:907-15)、修復(fù)受損的心肌(Ehrlich HP, Hazard SW 3rd. 2010. Thymosin beta4enhances repair by organizingconnective tissue and preventing the appearanceof myofibroblasts. Ann NY Acad Sci. 1194:118-24;Smart Nj Dube KNj Riley PR. 2010.Identificationof Thymosin β 4 as an effector of HandI-mediated vasculardevelopment. NatCommun. 1:46;Dube KN，Bollini S，Smart Nj Riley PR. 2012. Thymosinβ 4protein therapy for cardiac repair.Curr Pharm Des. 18:799-806;GajzerDC，Balbin Jj Chaudhry HW. 2012. Thymosin β 4 and cardiac regeneration:arewemissing a beat Stem Cell Rev. 2012 May 25. DOI: 10. 1007/sl2015-012-9378_3)、創(chuàng)傷愈合(Malinda KM et al. 1999. Thymosinbeta 4 accelerates wound healing. J InvestDermatol. 113:364-368;Bock-Marquette I,Saxena A, White MD，Dimaio JMj SrivastavaD. 2004. Thymosin β 4 activates integrin-1 inked kinase and promotes cardiaccellmigration，survival and cardiac repair. Nature. 432 (7016):466-472;PhilpDjKleinman HK. 2010. Animal studies with thymosin beta,a multifunctionaltissuerepair and regeneration peptide. Ann N Y Acad Sci. 1194:81-86)、激活毛囊干細(xì)胞引起毛發(fā)生長(zhǎng)(Philp D. et al. 2004. Thymosin beta 4increases hair growth byactivation of hair follicle stem cells. FASEBJ. 18:385-387;Philp D，St-SurinS，Cha HJ，Moon HS，Kleinman HKj ElkinM. 2007. Thymosin beta 4 induces hair growthvia stem cell migration anddifferentiation. Ann N Y Acad Sci. 1112:95-103)、細(xì)胞保護(hù)功會(huì)泛(Kumar S，Gupta S. 2011. Thymosin beta 4 prevents oxidative stressby targetingantioxidant and anti-apoptotic genes in cardiac fibroblasts.PLoS One. 6(10):e26912)、修復(fù)受損角膜(Sosne G，Qiu Pj Kurpakus-WheaterMj MatthewH. 2010. Thymosin beta4 and corneal wound healing:visions of thefuture.Ann N Y Acad Sci. 1194:190-8)、修復(fù)腦損傷(Morris DC, Chopp M，Zhang Lj Lu M，ZhangZG. 2010. Thymosin beta4 improves functionalneurological outcome in a rat modelof embolic stroke. Neuroscience. 169:674-82)、促進(jìn)牙的發(fā)育(Choi BD，Yun SH，JeongSJj Wang G，Kim HJj LimDSj Jeong MJ. 2012. Expression of thymosin β 4 in odontoblastsduringmouse tooth development. Int J Mol Med. 29:841-7)甚至抗腫瘤功能(CaersJ.et al. 2010.Thymosin β 4 has tumor suppressive effects and itsdecreasedexpression results in poor prognosis and decreased survival inmultiple myeloma.Haematologica. 95:163-167)。目前，關(guān)于Τβ4的臨床試驗(yàn)包括壓迫性潰瘍、大皰性表皮松解癥、靜脈淤積性潰瘍、糖尿病的玻璃體切割術(shù)和急性心肌梗死，其中前四項(xiàng)已進(jìn)入II期臨床試驗(yàn)(司信喜，方宏清，陳惠鵬。2009.胸腺肽β4研究進(jìn)展。生物技術(shù)通訊。20 (4) :580-583; CrockfordDjTurjman N，Allan C，Angel J. 2010. Thymosinbeta4: structure,function,andbiological properties supporting currentand future clinical applications.Ann NY Acad Sci.1194:179—189)。胸腺肽a I (Ta I)是由28個(gè)氨基酸殘基組成的多肽(Elizondo-Rio jasMAj Chamow SM,Tuthi 11 CWj Gorenstein DGj Volk DE. 2011. NMR structure ofhumanthymosin alpha-1. Biochem Biophys Res Commun. 416:356-61), 具有多種生物學(xué)活性的免疫增強(qiáng)劑(Jiang YFj Ma ZHj Zhao PWj Pan Y，Liu YY，F(xiàn)eng JY，NiuJQ.2010. Effect of thymosin-a (I)on T-helper I cell and T-helper 2cellcytokine synthesis in patients with hepatitis B virus eantigen-positivechronic hepatitis B. J Int Med Res. 38:2053-2062)，已在臨床上廣泛應(yīng)用于治療乙肝、丙肝、癌癥和免疫缺陷等疾病(Goldstein AL，Goldstein AL. 2009. From labto bedside: emerging clinical applicationsof thymosin alpha I.Expert OpinBiol Ther.9:593-608 ；Tuthi11 Cj Rios I,McBeath R. 2010.Thymosin alpha I :pastclinical experience and futurepromise. Ann N Y Acad Sci. 1194:130-5 ；Mao HY，ShiTD. 2011. Treatment withinterferon and thymosin alpha-1 versus interferonmonotherapy for HBeAgpositive chronic hepatitis B:a meta-analysis. ZhonghuaGan Zang Bing ZaZhi. 19 (I) : 29-33)。除了通常用于提高免疫力以外，胸腺肽a I還可作為流感疫苗的聯(lián)合佐劑(Panatto D，Amicizia Dj Lai PLj Camerini Rj De RosaA,Gasparini R. 2011. Utility of thymosin alpha-1 (Zadaxin)as a co-adjuvantininfluenza vaccines:a review. J Prev Med Hyg. 52:111-115)、與其他細(xì)胞因子例如IRX-2合用具有更強(qiáng)的促進(jìn)T細(xì)胞和免疫能力(Naylor PH, HaddenJW. 2010. Preclinicalstudies with IRX-2 and thymosin alphal incombination therapy. Ann N Y AcadSci. 1194:162-8.)、甚至原胸腺肽α I (Prothymosin α I)也具有抗腫瘤能力(IoannouK，Samara P, Livaniou Ej Derhovanessian E，Tsitsilonis OE. 2012. Prothymosin alpha:aubiquitouspolypeptide with potential use in cancer diagnosis and therapy.CancerImmunol Immunother. 61 (5) :599-614.)或者在神經(jīng)退行性疾病亨廷頓病中起到治療作用(Dong Gj Callegari EAj Gloeckner CJj Ueffing Mj Wang H. 2012. Prothymosin- αinteracts with mutant huntingtin and suppresses itscytotoxicity in cellculture. J Biol Chem. 287:1279-89)。雖然胸腺肽β 4和胸腺肽α I有著廣泛的應(yīng)用前景，但由于其分子各具有43和28個(gè)氨基酸殘基，釆用傳統(tǒng)的多肽化學(xué)合成方法，成本較高，很難滿(mǎn)足市場(chǎng)化需要。例如僅以化學(xué)合成的28個(gè)氨基酸殘基的胸腺肽α I為例，意大利賽生公司的產(chǎn)品“日達(dá)仙”每支含量?jī)H為I. 6毫克，而價(jià)格卻為800元左右，一個(gè)療程為5萬(wàn)多元，價(jià)格昂貴，普通人難以承受。采用基因工程方法生產(chǎn)重組Τβ 4或T α I蛋白，可以避免從生物原材料中直接提取率低或直接化學(xué)合成成本代價(jià)高等缺點(diǎn)。T β 4和T α I對(duì)化學(xué)合成耒說(shuō)雖然分子太大，但對(duì)生物工程表達(dá)又太小，難以直接在微生物中表達(dá)。Τβ 4在細(xì)菌中融合表達(dá)已有報(bào)道。如在T β 4的N端融合5個(gè)氨基酸(HK⑶I)，可以使T β 4在大腸桿菌得到高效表達(dá)，純化后的蛋白可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化(陳妍柯，楊輝，路凡等。2002。人胸腺肽β4基因的克隆表達(dá)及活性檢測(cè)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)。34(4) :502-505), Τβ 4融合蛋白在大腸桿菌表達(dá)后經(jīng)親和層析和DTT水解，可得到C端融合5個(gè)氨基酸(LEGSS)的重組T β 4，不僅可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和分化，而且可以促進(jìn)傷口愈合(Li X，Zheng L, Peng F. etal. 2007. Re comb i nan t thymo sin beta 4 can promote full-thickness cutaneous woundhealing. Protein Expr Purif. 56:229-236)，此外，His6_T β 4 可在大腸桿菌中高效表達(dá)并具有促血管生成的生物活性(賈琪，華子春。2007。人胸腺肽β 4基因在大腸桿菌中的克隆、表達(dá)、純化及促血管生成生物活性研究，東南大學(xué)學(xué)報(bào)醫(yī)學(xué)版。26(4):298-301)。張珍利用串聯(lián)重復(fù)技術(shù)在大腸桿菌中成功表達(dá)了重組Τβ 4，經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析、疏水作用和離子交換作用層析，得到高純度的重組蛋白，不僅具有生物學(xué)活性，也為下一步功能研究奠定了基礎(chǔ)[張珍。2008。重組人胸腺素β4基因的克隆、表達(dá)、純化、鑒定及活性檢測(cè)，第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)。29(16)]。關(guān)于胸腺肽α I在細(xì)菌中表達(dá)具有更多的報(bào)道(秦桂湘，龔興國(guó)，紀(jì)靜。2005。胸腺素α I的研究進(jìn)展。細(xì)胞生物學(xué)。27,621-624 ;LiJj Liu CHj Wang FS.2010.Thymosinalpha I :biological activities, applications andgenetic engineeringproduction. Peptides. 31:2151-8 ；Li W，Song Lj Wu S，Xue X，ZhangLj HeLj Han W，Wang Qj Ling Rj Zhang W，Yan Zj Zhang Y. 2011. Expression, purificationand characterization of a novel soluble human thymosinalphal concatemerexhibited a stronger stimulation on mice lymphocytesproliferation andhigher anti-tumor activity. Int J Biol Sci. 7(5):618-28 ；Zhang HY，Chen PFj XuJM，Dai QMj Xu F，Han QWj Wang JJj JinHY. 2011. Separation and purification ofEscherichia coli-expressed humanthymosin-a I using affinity chromatography andhigh-performance liquidchromatography. Protein Expr Purif. 77:140-5)o但細(xì)菌表達(dá)往往存在復(fù)性問(wèn)題，使得融合蛋白的酶切較難，另外細(xì)菌屬于胞內(nèi)表達(dá)，分離純化工藝復(fù)雜，因而在工業(yè)上成本很高，大規(guī)模生產(chǎn)受到限制。而畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有非常優(yōu)良的性能(劉忠淵，張富春，毛新芳，王蕓。2004。利用畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的研究。生物技術(shù)。14 :56-59 ;馬興元，譚建華，朱平，孫曼霽。2003。巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)及其在外源蛋白生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)與應(yīng)用前景。中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)。23 :98-102 ;Gao DM, Zhang XL, Zhang J, Cao JC and Wang FS. 2008.Expression of thymosin a 1-thymopentin fusionpeptide in Pichia pastoris and itscharacterization. Arch Pharm Res 31 :1471-1476)。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)全長(zhǎng)具有609個(gè)氛基酸殘基,但N-端最初24個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽(signal peptide)或前導(dǎo)肽(propeptide)。其成熟人血清白蛋白是從第25位天門(mén)冬氨酸(D)開(kāi)始至最后第609位亮氨酸(L)，因此成熟人血清白蛋白由585個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為66. 5kDa，是血漿的主要成分(GenBank :NM_000477 ；Uniprot:P02768)。以下人血清白蛋白均指成熟，不含信號(hào)肽或前導(dǎo)肽，具有585個(gè)氨基酸殘基的蛋白。因人血清百蛋白在體內(nèi)外非常穩(wěn)定，沒(méi)有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，因而是一種理想的生物活性蛋白載體(郭美錦，莊英萍等。2002?；蚬こ叹鶳ichiapastoris高密度發(fā)酵表達(dá)重組人血清白蛋白。華東理工大學(xué)學(xué)報(bào)。33(1) :88_92)。雖然已經(jīng)有眾多關(guān)于融合人血清白蛋白生產(chǎn)目的蛋白尤其胸腺肽αI的報(bào)道(趙洪亮，薛沖，熊向華，張偉，楊秉芬，劉志敏。2005。人血清白蛋白-睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子突變體融合蛋白基因在畢赤酵母中的表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物的純化和活性鑒定。生物工程學(xué)報(bào)。21:254-258 ;黃雯，李兆育，金禮吉，安利佳。2002。人胸腺素α I基因在畢赤酵母的融合表達(dá)。遺傳(北京)。24 :679-783 ；Yang YF. et al. 2005. Construction, expressionandcharacterization of human interferon alpha2b-(G4S)n-thymosin alphalfusionproteins in Pichia pastoris. World J Gastroenterol. 11，2597-602 ;Chen JH, ZhangXG, Jiang YT, Yan LY, Tang L, Yin YW, Cheng DS, Chen J, Wang M. 2010. Bioactivityand pharmacokinetics of two human serumaIbumin-thymosin alphal-fusionproteins,rHSA—Talphal andrHSA—L—Talphal, expressed in recombinant Pichiapastoris. Cancer Immuno I Immunother. 59:1335-45.),但它們大多是融合整個(gè)血清白蛋白質(zhì)分子。由于目的多肽短小，相對(duì)量就很少，人胸腺肽α I只占整個(gè)融合蛋白的4.6%，從而使表達(dá)量很低。使用蛋白質(zhì)內(nèi)含肽(intein)介導(dǎo)切割技術(shù)無(wú)疑具有極大的優(yōu)勢(shì)(WuWY, Miller KD,Coolbaugh M, Wood Dff. 2011. Intein-mediated one-steppurificationof Escherichia coli secreted human antibodyfragments.Protein Expr
6Purif. 76:221-228),但I(xiàn)ntein技術(shù)具有嚴(yán)密的專(zhuān)利技術(shù)保護(hù)，同時(shí)使用細(xì)菌還需要破碎細(xì)菌細(xì)胞壁，產(chǎn)生熱源等等問(wèn)題。例如，Li報(bào)道使用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了 Thymosin a 1-thymopentin (Τ α 1-ΤΡ5)融合蛋白。他們的方法是把此融合蛋白結(jié)合到幾丁質(zhì)結(jié)合肽，通過(guò)幾丁質(zhì)柱子進(jìn)行純化，然后再由二硫蘇糖醇進(jìn)行自身切割，生產(chǎn) T α 1-ΤΡ5 融合蛋白(Li J, Zheng L, Li P, Wang F. 2012. Intein-mediatedexpression,purification,and characterization of thymosin a 1-thymopentinfusionpeptide in Escherichia coli.Protein Expr Purif. 84(I):1-8)。雖然已有把人胸腺肽β4或者α I融合到整個(gè)人白蛋白分子的報(bào)道，但無(wú)論是酵母，細(xì)菌，還是其他表達(dá)系統(tǒng)中，還未見(jiàn)通過(guò)融合氨基端部分人血清白蛋白生產(chǎn)胸腺肽β4和α I的報(bào)道。我們的方法是通過(guò)將胸腺肽β 4，α I或其他多肽與氨基端部分白蛋白融合，并在酵母中高表達(dá)，通過(guò)簡(jiǎn)單的酶切工藝，可純化獲得大量廉價(jià)的胸腺肽。因此利用基因工程技術(shù)進(jìn)行此類(lèi)藥物的研究與生產(chǎn)具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明的目的是提供一種可用于制備人胸腺肽的重組人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白及編碼該融合蛋白的融合基因，以及一種可以大規(guī)模，低成本生產(chǎn)人胸腺肽的方法。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種可用于制備人胸腺肽的重組人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白及編碼該融合蛋白的融合基因。所述融合基因具有形如A-X-C結(jié)構(gòu)的基因序列，其中A部分為編碼人血清白蛋白N-端1-150 1-372位氨基酸的核苷酸序列，X為編碼包含腸激酶或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切位點(diǎn)的連接肽的核苷酸序列，C為人胸腺肽基因。所述融合基因中，A部分截取人血清白蛋白N-端部分氨基酸序列為融合蛋白的一部分，考慮到表達(dá)的效率和產(chǎn)量，截取人血清白蛋白N-端的1-150 1-372位氨基酸序列是比較合適的，更優(yōu)選截取人血清白蛋白N-端的1-181 1-300位氨基酸序列，最優(yōu)選的是截取人血清白蛋白N-端結(jié)構(gòu)域I以及之后連接肽的1-186氨基酸序列為融合蛋白的一部分。所述融合基因中，C部分的人胸腺肽基因可為人胸腺肽α、β或Y型基因，優(yōu)選人胸腺肽β 4基因或人胸腺肽αI基因。所述融合基因可通過(guò)載體連接轉(zhuǎn)化宿主菌表達(dá)得到重組人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白。本發(fā)明構(gòu)建的融合基因，優(yōu)選具有如SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列，其中人胸腺肽密碼子經(jīng)過(guò)畢赤酵母偏愛(ài)性?xún)?yōu)化，其編碼人白蛋白-胸腺肽β 4融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No. 16所示；或者具有如SEQ ID No. 17所示的核苷酸序列,其編碼人白蛋白-胸腺肽α I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No. 18所示。本發(fā)明的另一目的提供一種可以大規(guī)模，低成本生產(chǎn)人胸腺肽的方法，所述方法包括如下的步驟(I)、在保持各自基因密碼子閱讀框架不變的前提下，在編碼人血清白蛋白部分基因序列和人胸腺肽基因的兩側(cè)引入限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，然后通過(guò)酶切操作形成具有如下結(jié)構(gòu)的融合基因序列A-X-C，其中A部分為編碼人血清白蛋白N-端1-150 1-372位氨基酸的核苷酸序列，X為編碼包含腸激酶或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切位點(diǎn)的連接肽的核苷酸序列，C為人胸腺肽基因；(2)、將上述的A-X-C融合基因序列連接到表達(dá)載體，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入酵母菌中，經(jīng)篩選得到重組基因工程菌；(3)、高密度發(fā)酵重組酵母菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性的人血清白蛋白-胸腺肽融合蛋白，加入腸激酶或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切，經(jīng)分離純化獲得重組人胸腺肽。本發(fā)明所述的方法適合用于表達(dá)各種類(lèi)型的人胸腺肽，所述C部分的人胸腺肽基因可為人胸腺肽α、β或Y型基因，優(yōu)選人胸腺肽β4基因或人胸腺肽α I基因。成熟人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是由585個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(序列表中SEQ ID No. 2),分子量約為66. 5kDa。因人血清白蛋白在體內(nèi)外非常穩(wěn)定，沒(méi)有酶學(xué)和免疫學(xué)活性，因而是一種理想的生物活性蛋白載體。本發(fā)明截取人血清白蛋白N-端部分氨基酸序列為融合蛋白的一部分，考慮到表達(dá)的效率和產(chǎn)量，截取人血清白蛋白N-端的1-150 1-372位氨基酸序列是比較合適的，更優(yōu)選截取人血清白蛋白N-端的1-181 1-300位氨基酸序列，最優(yōu)選的是截取人血清白蛋白N-端結(jié)構(gòu)域I以及之后連接肽的1-186氨基酸序列為融合蛋白的一部分。人血清白蛋白部分基因和人胸腺肽基因序列可以通過(guò)PCR方法克隆，也可通過(guò)化學(xué)合成。編碼人血清白蛋白部分基因序列的多核苷酸和編碼人胸腺肽基因的融合，在保持各自閱讀框架不變的前提下，可以用本領(lǐng)域周知的各種方法，如通過(guò)PCR的方法，在編碼序列的兩側(cè)引入限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，通過(guò)酶切產(chǎn)生粘性末端，然后通過(guò)DNA連接酶連接，從而獲得編碼融合蛋白的基因。如果需要可在本發(fā)明的編碼融合蛋白基因的兩側(cè)引入多聚核苷酸，引入的多聚核苷酸可有限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。構(gòu)建人血清白蛋白部分基因序列時(shí)，可按照GenBank人血清白蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，在基因序列兩端引入限制性酶切位點(diǎn)，優(yōu)選分別引入XhoI和PstI的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。引物委托上海生工生物公司合成。純化后的PCR產(chǎn)物待酶切備用。在構(gòu)建人胸腺肽基因時(shí)，可在基因的5’端先引入蛋白酶切位點(diǎn)，然后在基因兩側(cè)引入限制性酶切位點(diǎn)。上述基因結(jié)構(gòu)可通過(guò)人工合成，也可通過(guò)PCR方法構(gòu)建。優(yōu)選的可構(gòu)建如B-X-C-D結(jié)構(gòu)的基因序列，其中B和D為限制性酶切位點(diǎn)，X為編碼包含腸激酶(EK)或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切位點(diǎn)的連接肽的核苷酸序列，C為人胸腺肽基因。Β/D可優(yōu)選為Pstl/Xbal酶切位點(diǎn)。通過(guò)酶切連接可以將上述的兩個(gè)基因拼接為融合基因，連接白蛋白和胸腺肽β4基因的是限制性?xún)?nèi)切酶PstI位點(diǎn)序列(產(chǎn)生的氨基酸L-Q)。因而，一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，融合基因中A部分為編碼白蛋白結(jié)構(gòu)域I及之后5個(gè)氨基酸連接肽的共186個(gè)氨基酸的基因序列，X部分為編碼LQDDDDK氨基酸序列的多核苷酸，C部分為胸腺肽β4基因。另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，融合基因中A部分為編碼白蛋白結(jié)構(gòu)域I及之后連接肽的186個(gè)氨基酸序列的基因序列，X部分為編碼LQENLYFQ氨基酸序列的多核苷酸，C部分為人胸腺肽α I基因。本發(fā)明構(gòu)建的融合基因，優(yōu)選具有如SEQ ID No. 15所示的核苷酸序列，其中人胸腺肽密碼子經(jīng)過(guò)畢赤酵母偏愛(ài)性?xún)?yōu)化，其編碼人白蛋白-胸腺肽β 4融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No. 16所示；或者具有如SEQ ID No. 17所示的核苷酸序列，其編碼人白蛋白-胸腺肽α I融合蛋白，氨基酸序列如SEQ ID No. 18所示。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在構(gòu)建表達(dá)人胸腺肽β 4的基因工程菌時(shí)，可根據(jù)全球公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中記載序列號(hào)為ΝΜ_000477的成熟人血清白蛋白基因(序列表中SEQ ID No. I)，設(shè)計(jì)2個(gè)引物，經(jīng)PCR方法從人cDNA文庫(kù)擴(kuò)增獲得具有186個(gè)氨基酸序列的部分人血清白蛋白基因。人胸腺肽β 4基因全長(zhǎng)根據(jù)GenBank序列號(hào)NP_066932記載為編碼44個(gè)氨基酸殘基，但成熟的人胸腺肽β 4由于第一個(gè)蛋氨酸已經(jīng)去掉，因此只有43個(gè)氨基酸殘基(Unipix)t:P62328)。成熟人胸腺肽β4 DNA片段通過(guò)化學(xué)方法合成(序列表中SEQ ID No. 5)。連接白蛋白和胸腺肽β 4基因的限制性?xún)?nèi)切酶PstI和經(jīng)密碼子優(yōu)化的腸激酶切位點(diǎn)(序列表中SEQ IDNo. 3)在化學(xué)合成時(shí)與人胸腺肽β 4基因融合在一起合成(序列表中SEQ ID No. 7)。兩個(gè)DNA片段(I.部分白蛋白基因；2. PstI-腸激酶切位點(diǎn)-人胸腺肽β4基因)通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切，將兩者克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒中。其整個(gè)融合基因包含186氨基酸殘基的人血清白蛋白基因，限制性?xún)?nèi)切酶PstI，腸激酶酶切位點(diǎn)，人胸腺肽β 4基因和終止的堿基序列。將融合基因克隆至表達(dá)載體pPICZ α，序列正確表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌野生型畢赤酵母Χ33，通過(guò)博萊霉素篩選而得到基因工程菌。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，在構(gòu)建表達(dá)人胸腺肽α I的基因工程菌時(shí)，可根據(jù)全球公共序列數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank中記載序列號(hào)為ΝΜ_000477的成熟人血清白蛋白基因(序列表中SEQ ID No. I)，設(shè)計(jì)2個(gè)引物，經(jīng)PCR方法從人cDNA文庫(kù)擴(kuò)增獲得具有186個(gè)氨基酸序列的部分人血清白蛋白基因。人胸腺肽α I基因根據(jù)GenBank中序列號(hào)ΝΜ_001099285. I記載全長(zhǎng)為111個(gè)氨基酸殘基，但其成熟，具有功能的為28個(gè)氨基酸殘基(序列表中SEQ IDNo. 11)。該人胸腺肽α I基因片段通過(guò)化學(xué)方法合成獲得。連接白蛋白和胸腺肽α I基因的限制性?xún)?nèi)切酶PstI和經(jīng)密碼子優(yōu)化的煙草蝕紋病毒(Tev)蛋白酶切位點(diǎn)(序列表中SEQID No. 9)，在化學(xué)合成時(shí)與經(jīng)密碼子優(yōu)化的人胸腺肽α I基因融合在一起合成(序列表中SEQ ID No. 13)。兩個(gè)DNA片段(I.部分白蛋白基因；2. PstI-Tev蛋白酶切位點(diǎn)-人胸腺肽αI基因)通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切，將兩者克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒中。其整個(gè)融合基因包含186氨基酸殘基的人血清白蛋白基因，限制性?xún)?nèi)切酶PstI，Tev蛋白酶切位點(diǎn)，人胸腺肽α I基因和終止的堿基序列。將融合基因克隆至表達(dá)載體pPICZ-α-Α，序列正確表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌野生型畢赤酵母Χ33，通過(guò)博萊霉素篩選而得到基因工程菌。構(gòu)建好融合基因后，可用本領(lǐng)域公知的方法將含編碼融合蛋白序列的核酸克隆到各種表達(dá)載體中去。所用標(biāo)準(zhǔn)的分子克隆過(guò)程見(jiàn)J.薩姆布魯克等(J.薩姆布魯克等，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版，科學(xué)出版社，1995.)的敘述。許多表達(dá)載體和其對(duì)應(yīng)的宿主可以從公司購(gòu)得，如酵母表達(dá)載體 pPICZ-a -A, pHIL-D2, pPIC9, PHIL-S1 (Invitrogen Corp. SanDiego. California. USA),動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體 pSVK3、pMSG (Amersham Pharmacia BiotechInc. USA)等。優(yōu)選的方法是將編碼本發(fā)明中的融合蛋白或多肽的核酸克隆至酵母表達(dá)載體pPICZ-α -A，該質(zhì)粒為酵母整合型質(zhì)粒，帶有醇氧化酶操縱子(AOXl) 5’序列和3’序列，用于方便編碼基因整合至酵母染色體，和控制編碼基因的表達(dá)。這些質(zhì)粒及對(duì)應(yīng)的宿主菌等可以從 Invitrogen Corp. San Diego. California. USA 構(gòu)得，優(yōu)選的啟動(dòng)子為 AOXl。載體可經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染至原核生物或真核生物宿主。轉(zhuǎn)化所需核酸至宿主細(xì)胞中去可用通常的方法，如電穿孔，制備感受態(tài)的原生質(zhì)球等。成功轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，即含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的細(xì)胞，可通過(guò)人們熟知的技術(shù)加以鑒定，如細(xì)胞經(jīng)收集并裂解，提取DNA，然后
9PCR方法鑒定?；蛘?，細(xì)胞培養(yǎng)上清中或細(xì)胞破碎液中的蛋白可用抗HSA或抗人胸腺肽的抗體檢測(cè)。表達(dá)融合蛋白的宿主可以是酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、動(dòng)物、植物等，優(yōu)選為酵母菌，如釀酒酵母、畢赤酵母、念珠菌屬酵母、漢遜酵母、克魯維亞酵母、孢圓母屬酵母或裂殖酵母等，更優(yōu)選為畢赤酵母。融合蛋白或多肽可以存在于宿主細(xì)胞內(nèi)，也可以是從宿主中分泌出來(lái)，優(yōu)選的，是從宿主中分泌出來(lái)。分泌所用的信號(hào)肽，優(yōu)選的是天然的人血清白蛋白的信號(hào)肽，或酵母MFa信號(hào)肽，或這兩種信號(hào)肽的類(lèi)似物。更優(yōu)選的用酵母MFa信號(hào)肽，用該信號(hào)肽時(shí)融合蛋白表達(dá)水平較高。融合蛋白或多肽也可以不用信號(hào)肽，而在酵母中以胞內(nèi)可溶形式表達(dá)。編碼融合蛋白的核酸，可以插入至宿主染色體，或以游離質(zhì)粒形式存在?？梢酝ㄟ^(guò)培養(yǎng)含有本發(fā)明DNA構(gòu)建體的宿主，如重組酵母、重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞、重組細(xì)菌、轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物等，生產(chǎn)本發(fā)明的融合蛋白。具體的培養(yǎng)方法，可以用搖瓶或生物反應(yīng)器等，生產(chǎn)時(shí)優(yōu)選的為生物反應(yīng)器。培養(yǎng)基應(yīng)能提供菌體(或細(xì)胞)生長(zhǎng)和產(chǎn)物表達(dá)所需的物質(zhì)，應(yīng)包含氮源、碳源、PH緩沖成分等，培養(yǎng)基配方一般應(yīng)根據(jù)不同培養(yǎng)對(duì)象，通過(guò)試驗(yàn)獲得。培養(yǎng)可分兩個(gè)階段，第一階段主要用于菌體(或細(xì)胞)的生長(zhǎng)，第二階段主要用于合成產(chǎn)物。將構(gòu)建完成的基因工程菌進(jìn)行液體培養(yǎng)和發(fā)酵，通過(guò)甲醇誘導(dǎo)，表達(dá)大量細(xì)胞外的可溶性人白蛋白-胸腺肽β4或者人白蛋白-胸腺肽αI融合蛋白。發(fā)酵產(chǎn)生的白蛋白-胸腺肽β 4融合蛋白經(jīng)鹽析，腸激酶酶解，層析純化而獲得重組人胸腺肽β4。發(fā)酵產(chǎn)生的白蛋白-胸腺肽α I融合蛋白經(jīng)鹽析，Tev蛋白酶酶解，層析純化而獲得重組人胸腺肽al?？梢杂酶鞣N蛋白分離的方法分離純化蛋白，如鹽析、沉淀、超濾、液相層析等技術(shù)及這些技術(shù)的組合。其中液相層析可以用凝膠排阻、親和、離子交換、疏水、反相等層析技術(shù)。分別利用人胸腺肽β4和人胸腺肽α I可以刺激小鼠脾細(xì)胞生長(zhǎng)的原理，分別檢測(cè)純化得到的人胸腺肽β 4和人胸腺肽α 1，證明重組胸腺肽β4和α I具有生物活性。本發(fā)明的經(jīng)腸激酶切割純化的胸腺肽β 4純品和經(jīng)煙草蝕紋病毒Tev蛋白酶切割純化的胸腺肽α I純品可以作為注射制劑，應(yīng)用于急性心肌梗死和增強(qiáng)免疫功能及其它各種適應(yīng)癥的治療。本發(fā)明所述的胸腺肽生產(chǎn)方法具有可保證產(chǎn)品質(zhì)量一致性，不受原料來(lái)源限制，且成本很低，表達(dá)量高，可以大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。例如人胸腺肽α I的融合蛋白產(chǎn)量I. 51g/L,人胸腺肽α I純品可達(dá)85mg/L;而人胸腺肽β 4的融合蛋白產(chǎn)量I. 63g/L,人胸腺妝α I純品可達(dá)116mg/L,相比于現(xiàn)有技術(shù)的生廣技術(shù)有很大的提聞。


圖IA為pPICZ a -HSA-T β 4的構(gòu)建過(guò)程；圖IB為pPICZ a -HSA-T α I的構(gòu)建過(guò)圖2為重組人胸腺肽β 4表達(dá)蛋白凝膠電泳結(jié)果；圖2中BSA為I μ g牛血清白蛋白；M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，單位為千道爾頓；1，2，3和4為工程菌株在未經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，誘導(dǎo)一天，兩天和三天后的表達(dá)量。圖3為重組人胸腺肽β 4純化工藝流程圖。圖4為重組人胸腺肽α I純化工藝流程圖。
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具體實(shí)施例方式實(shí)施例I:重組人胸腺肽β 4的生產(chǎn)步驟一、氨基端部分人血清白蛋白質(zhì)(N-HSA)基因的設(shè)計(jì)與生物合成按照GenBank中序列號(hào)記載為ΝΜ_000477或者Uniprot序列號(hào)記載為P02768(SEQID No. I)的人血清白蛋白基因，設(shè)計(jì)2個(gè)引物，上下分別引入XhoI和PstI的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，此DNA片段含有Xhol，PstI酶切位點(diǎn)和編碼氨基端人血清白蛋白186個(gè)氨基酸殘基。上游引物序列5’ -GATCAGTCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGC-3 ’ ;下游引物序列5’-GCAGTCACTGCAGCCGAAGTTCATCGAGCTTTGGC-3’ ；引物委托上海生工生物公司合成。PCR的方法是50 μ I體系中加入5 μ I 10XPfu緩沖液(含 MgS04)，40 μ I 水，I μ I (lOOng/ μ I)cDNA 文庫(kù)，上下游引物各 I μ I (5 μ mol/L)，I μ I dNTP (IOmM each)，I μ I PfuDNAPolymerase。所有試劑均從上海生工訂購(gòu)。用Bio-Rad公司的PCR儀擴(kuò)增DNA, PCR條件為94°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，循環(huán)35次。反應(yīng)結(jié)束后，將4管反應(yīng)產(chǎn)物合并成I管至I. 5mM離心管中，用EZ-lOSpin Column PCR ProductPurification Kit試劑盒(上海生工生物公司)進(jìn)行回收純化。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)XhoI和PstI雙酶切，再用UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物公司)進(jìn)行回收。步驟二、人胸腺肽β 4基因的設(shè)計(jì)與化學(xué)合成按照GenBank序列號(hào)ΝΡ_066932記載或者Uniprot序列號(hào)Ρ62328記載的人胸腺肽β 4氨基酸序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性，設(shè)計(jì)SEQ ID No. 5中的DNA序列；此外，設(shè)計(jì)內(nèi)切酶PstI序列和腸激酶切位點(diǎn)的連接肽DNA和氨基酸序列如(SEQ ID No. 3和SEQ IDNo. 4)。委托上海生工生物公司化學(xué)合成連接肽和人胸腺肽β 4 DNA如SEQ ID No. 7 (SEQID No. 3和No. 5連接后的序列)。化學(xué)合成的SEQ ID No. 7包括PstI DNA酶切位點(diǎn)，腸激酶切位點(diǎn)，人胸腺肽β 4基因，終止堿基序列。DNA片段的兩端引入PstI和XbaI的酶切位點(diǎn)并已經(jīng)克隆至PUC57質(zhì)粒上(上海生工生物公司)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆，提取含有胸腺肽β 4序列的pUC57質(zhì)粒，在37°C用PstI和XbaI雙酶切，凝膠回收此由化學(xué)合成的DNA片段。步驟三、酵母表達(dá)載體pPICZ-a -A酶切、回收在O. 5ml離心管中加入2μ g酵母表達(dá)載體pPICZ-a _A( Invitrogen公司)、3· O μ I限制性?xún)?nèi)切酶Xhol、3. Ομ I限制性?xún)?nèi)切酶XbaIUO μ I限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液，加去離子水至100 μ 1，混合均勻，將混合物放入37°C水浴鍋中，反應(yīng)5小時(shí)，取出備用。用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的酵母表達(dá)載體pPICZ-a-A進(jìn)行回收純化，將回收純化后的酵切酵母表達(dá)載體？ 102-04，存儲(chǔ)于-201條件下，備用；步驟四、氨基端部分人血清白蛋白質(zhì)(N-HSA)基因，人胸腺肽β 4基因和酵母表達(dá)載體pPICZ- a -A的連接N-HSA-連接肽-胸腺肽β4融合蛋白的構(gòu)建。為了使表達(dá)的融合蛋白能分泌到酵母胞外，選擇pPICZ- a -A作為載體，在該載體克隆位點(diǎn)的XhoI和Xbal，插入融合蛋白的基因。將步驟一(XhoI/PstI雙酶切)，步驟二(Pstl/Xbal雙酶切)得到的DNA片段產(chǎn)物與步驟三pPICZ a A (Xhol/Xbal雙酶切)質(zhì)粒通過(guò)T4DNA聯(lián)酶催化進(jìn)行連接，其連接后的DNA和氛基酸序列如SEQ ID No. 15和No. 16所不。連接體系的配制在O. 5ml離心管中加入O. I μ g酶切酵母表達(dá)載體pPICZ- α -A、
O.Iyg酶切N-HSA DNA片段、O. I μ g酶切人胸腺肽β 4片段、l.Oyl T4DNA連接酶緩沖液(10倍)、1. 0μ 1Τ4 DNA連接酶混合均勻，后將O. 5ml離心管放在16°C條件下，放置12小時(shí)，形成混合物備用。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌DH5ci。重組質(zhì)粒的構(gòu)建過(guò)程如圖IA所示。步驟五畢赤酵母工程菌的構(gòu)建和發(fā)酵將步驟四篩選的重組質(zhì)粒委托上海生工生物公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)線(xiàn)性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X_33 (Invitrogen公司)。經(jīng)過(guò)100，500，1000 μ g/ml博萊霉素的篩選，SDS-PAGE凝膠電泳分析篩選出表達(dá)量最高的菌株。接種入5mlYPD培養(yǎng)基(酵母提取液10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)中，30°C，250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，按1%接菌量取O. 5ml上述培養(yǎng)的菌液接入50ml/500ml三角燒瓶的BMGY培養(yǎng)基中(酵母提取液10g/L,胰蛋白胨20g/L, pH 6. O的O. IM磷酸鈉緩沖液，I. 34%YNB, 4xl0_5%生物素，甘油10g/L)，30°C，250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)30小時(shí)，離心上述均液，收集均體，一并轉(zhuǎn)入50ml/500ml三角燒瓶的BMMY培養(yǎng)基中(酵母提取液10g/L，胰蛋白胨20g/L，pH 6. O的
O.IM磷酸鈉緩沖液，I. 34%ΥΝΒ, 4χ10_5%生物素)，加入O. 5%甲醇，30°C，250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，每24小時(shí)，補(bǔ)加0. 5%甲醇一次，誘導(dǎo)表達(dá)直至5天。經(jīng)離心收集上清，得發(fā)酵液。SDS-PAGE電泳分析顯示工程菌所產(chǎn)的最高融合蛋白，約占總分泌蛋白的85%(圖2)。白蛋白-胸腺肽β 4經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)三天后在發(fā)酵液中的總量為I. 63克/升。步驟六融合蛋白的純化和酶切收集發(fā)酵液，加入85%飽和度的硫酸銨，4°C，6小時(shí)后離心，沉淀。使用G-25脫鹽，收集融合蛋白主峰，稀釋溶解于含ImM CaCl2的20mM磷酸緩沖液，加入腸激酶(融合蛋白摩爾數(shù)腸激酶摩爾數(shù)=100:1)酶解。酶切后的胸腺肽β 4經(jīng)凝膠層析柱分離獲得(圖3)。純化后的胸腺肽β 4經(jīng)SDS-PAGE電泳分析為均一條帶，純度超過(guò)92%。根據(jù)胸腺肽β 4(43個(gè)氨基酸殘基)在整個(gè)融合蛋白比例，胸腺肽β 4的理論值是18. 2%，我們獲得的純胸腺肽β 4為116毫克/升發(fā)酵液(理論值為300毫克)，得率為38. 7%。步驟七重組胸腺肽β 4的生物活性檢測(cè)從小鼠單個(gè)脾細(xì)胞懸液中分離淋巴細(xì)胞，用含100mL/L胎牛血清的RPMI 1640調(diào)整細(xì)胞濃度，加入ConA使其終濃度為2. 5mg/L,按每孔4xl05細(xì)胞加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37°C孵箱培養(yǎng)6小時(shí)后，加入經(jīng)酶切純化的重組T β 4，和T β 4化學(xué)合成品(作對(duì)照)，終濃度分別為1，5，10 μ Μ,繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞的增殖和分化。結(jié)果表明與對(duì)照比，重組胸腺肽β 4的活性是93.6%，與化學(xué)合成的相似。實(shí)施例2:重組人胸腺肽α I的生產(chǎn)步驟一、氨基端部分人血清白蛋白質(zhì)(N-HSA)基因的設(shè)計(jì)與生物合成按照GenBank中序列號(hào)記載為ΝΜ_000477或者Uniprot序列號(hào)記載為P02768(SEQID No. I)的人血清白蛋白基因，設(shè)計(jì)2個(gè)引物，上下分別引入XhoI和PstI的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，此DNA片段含有Xhol，PstI酶切位點(diǎn)和編碼氨基端人血清白蛋白186個(gè)氨基酸 殘基。
上游引物序列5’-GATCAGTCTCGAGAAAAGAGATGCACACAAGAGTGAGGTTGC-3’ ;下游引物序列5’-GCAGTCACTGCAGCCGAAGTTCATCGAGCTTTGGC-3’ ；引物委托上海生工生物公司合成。PCR的方法是50 μ I體系中加入5 μ I 10XPfu緩沖液(含 MgS04)，40y I 水，1μ I (lOOng/μ l)cDNA 文庫(kù)，上下游引物各 I μ I (5 μ mol/L), I U I dNTP (IOmM each)，I μ I Pfu DNA Polymerase。所有試劑均從上海生工訂購(gòu)。用Bio-Rad公司的PCR儀擴(kuò)增DNA, PCR條件為94°C預(yù)變性2分鐘，94°C變性30秒，56°C退火30秒，72°C延伸I分鐘，循環(huán)35次。反應(yīng)結(jié)束后，將4管反應(yīng)產(chǎn)物合并成I管至I. 5mM離心管中，用EZ-10 Spin Column PCRProduct Purification Kit試劑盒(上海生工生物公司)進(jìn)行回收純化。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)XhoI和PstI雙酶切，再用UNIQ-IO柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物公司)進(jìn)行回收。步驟二、人胸腺肽α I基因的設(shè)計(jì)與化學(xué)合成人胸腺肽α I基因根據(jù)GenBank中記載序列號(hào)為ΝΜ_001099285. I，通過(guò)化學(xué)方法合成獲得(序列表中SEQ ID No. 11)。限制性?xún)?nèi)切酶PstI和經(jīng)密碼子優(yōu)化的煙草蝕紋病毒(Tev)蛋白酶切位點(diǎn)(序列表中SEQ ID No. 9)，在化學(xué)合成時(shí)與人胸腺肽α I基因融合在一起合成(序列表中SEQ ID No. 13)。兩個(gè)DNA片段(I. N-HSA; 2. PstI-Tev蛋白酶切位點(diǎn)-人胸腺肽αI基因)通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶酶切，將兩者克隆至酵母表達(dá)質(zhì)粒中。其整個(gè)融合基因包含186氨基酸殘基的人血清白蛋白基因，限制性?xún)?nèi)切酶PstI，Tev蛋白酶切位點(diǎn)，人胸腺肽αI基因，終止密碼子序列。步驟三、酵母表達(dá)載體pPICZ-a -A酶切、回收在O. 5!111離心管中加入2 4 g酵母表達(dá)載體pPICZ-a _A( Invitrogen公司)、3· O μ I限制性?xún)?nèi)切酶Xhol、3. Ομ I限制性?xún)?nèi)切酶Xbal、10 μ I限制性?xún)?nèi)切酶緩沖液，加去離子水至100 μ 1，混合均勻，將混合物放入37°C水浴鍋中，反應(yīng)5小時(shí)，取出備用。用DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切后的酵母表達(dá)載體pPICZ-a-A進(jìn)行回收、純化，將回收、純化后的酵切酵母表達(dá)載體pPICZ-α-Α，存儲(chǔ)于_20°C條件下，備用；步驟四、氨基端部分人血清白蛋白質(zhì)(N-HSA)基因，人胸腺肽α I基因和酵母表達(dá)載體pPICZ- a -A的連接氨基端部分人血清白蛋白-連接肽-胸腺肽α I融合蛋白的構(gòu)建。為了使表達(dá)的融合蛋白能分泌到酵母胞外，選擇PPICZ-α-Α作為載體，在該載體的克隆位點(diǎn)XhoI和XbaI,插入融合蛋白的基因。將步驟一(XhoI/PstI雙酶切)，步驟二(Pstl/Xbal雙酶切)得到的DNA片段產(chǎn)物與步驟三pPICZ- a -A (Xhol/Xbal雙酶切)得到的質(zhì)粒通過(guò)T4 DNA聯(lián)酶催化連接(圖1B)。其連接后的DNA和氨基酸序列如SEQ ID No. 17和No. 18所示。連接體系的配制在0. 5ml離心管中加入0. I μ g酶切酵母表達(dá)載體pPICZ- α -A、
0.Iyg酶切N-HSA基因、0. Iyg酶切人胸腺肽α I基因、I. 0μ I Τ4 DNA連接酶緩沖液(10倍)、1.0μ I Τ4 DNA連接酶混合均勻，后將0.5ml離心管放在16°C條件下，放置12小時(shí)，形成混合物備用。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的大腸桿菌DH5ci，篩選重組質(zhì)粒。步驟五畢赤酵母工程菌的構(gòu)建和發(fā)酵將步驟四獲得的重組質(zhì)粒委托上海生工生物公司測(cè)序，測(cè)序正確的質(zhì)粒經(jīng)線(xiàn)性化后，電轉(zhuǎn)入畢赤酵母X-33。經(jīng)過(guò)100，500，1000 μ g/ml博萊霉素的篩選的篩選，SDS-PAGE凝膠電泳分析篩選出表達(dá)量最高的菌株。接種入5ml YH)培養(yǎng)基(酵母提取液10g/L，胰蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L)中，30°C，250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，按1%接菌量取O. 5ml上述培養(yǎng)的菌液接入50ml/500ml三角燒瓶的BMGY培養(yǎng)基中(酵母提取液IOg/L,胰蛋白胨20g/L, pH 6. O的O. IM磷酸鈉緩沖液，I. 34%ΥΝΒ, 4χ10_5%生物素，甘油IOg/L)，30°C，250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)30小時(shí)，離心上述均液，收集均體，一并轉(zhuǎn)入50ml/500ml三角燒瓶的BMMY培養(yǎng)基中(酵母提取液10g/L，胰蛋白胨20g/L，pH 6. O的O. IM磷酸鈉緩沖液，I. 34%ΥΝΒ, 4χ10_5%生物素)，加入O. 5%甲醇，30°C，250轉(zhuǎn)/分鐘振蕩培養(yǎng)，每24小時(shí)，補(bǔ)加O. 5%甲醇一次，誘導(dǎo)表達(dá)直至5天。經(jīng)離心收集上清，得發(fā)酵液。SDS-PAGE電泳分析顯示工程菌株產(chǎn)生最高融合蛋白，約占總分泌蛋白的80%。白蛋白-人胸腺肽al經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)三天后在發(fā)酵液中的總量為I. 51克/升。步驟六融合蛋白的純化和酶切收集發(fā)酵液，加入85%飽和度的硫酸銨，4°C，6小時(shí)后離心，沉淀。使用G-25脫鹽，收集融合蛋白主峰，稀釋溶解于I倍Tev蛋白酶的緩沖液(50mM Tris-HCl,pH8. O, O. 5mM EDTA, ImM DTT)。將Tev蛋白酶加入至融合蛋白(200ug融合蛋白100U Tev蛋白酶)，體積為I. 5ml, 30° C，3小時(shí)酶解。酶切后的人胸腺肽α I經(jīng)高效液相色譜層析柱分離獲得(圖4)。根據(jù)人胸腺肽α I (28氨基酸殘基)在整個(gè)融合蛋白比例，人胸腺肽α I的理論值是12. 6%,我們獲得的純胸腺肽人胸腺肽α I為85毫克/升發(fā)酵液(理論值為190毫克)，得率為44. 7%。步驟七重組人胸腺肽α I生物活性檢測(cè)活性測(cè)試主要按照小鼠脾臟細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)[苗紅，郭葆玉，張冉，張莉。2003.重組胸腺肽的表達(dá)，純化和生物學(xué)活性。中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)。19 (5) :636-639]。取小鼠脾臟，用無(wú)菌注射器芯將脾臟擠壓過(guò)200目的鋼絲網(wǎng)，得到單個(gè)細(xì)胞。用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液配成5xl06個(gè)細(xì)胞/ml，將細(xì)胞懸液以200ul/孔鋪96孔扳，加入ConA使其終濃度為2. 5mg/L,加入經(jīng)酶切純化的重組胸腺肽α 1，化學(xué)合成品(陽(yáng)性對(duì)照)，終濃度分別為O. 1，I. O μ Μ,繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，MTT法測(cè)定淋巴細(xì)胞的增殖和分化。復(fù)3孔，37° C，5%C02溫箱中培養(yǎng)72小時(shí)，MTT法測(cè)定。與對(duì)照(無(wú)胸腺肽)相比，重組胸腺肽α I在O. I和I. O μ濃度對(duì)小鼠脾細(xì)胞具有顯著促進(jìn)生長(zhǎng)作用(ρ〈0. 01)，其活性與化學(xué)合成的相似。
權(quán)利要求
1.一種編碼人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白的融合基因，所述融合基因具有形如A-X-C結(jié)構(gòu)的基因序列，其中A部分為編碼成熟人血清白蛋白N-端1-150 1-372位氨基酸的核苷酸序列，X為編碼包含腸激酶或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切位點(diǎn)的連接肽的核苷酸序列，C為人胸腺肽基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合基因，其特征在于所述融合基因中，A部分為編碼成熟人血清白蛋白N-端1-150 1-372位氨基酸的核苷酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的融合基因，其特征在于所述融合基因具有如SEQIDNo. 15或SEQ ID No. 17所示的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的融合基因編碼的人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的人血清白蛋白-人胸腺肽融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有如SEQ ID No. 16或SEQ ID No. 18所示的氨基酸序列。
6.攜帶有如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述基因序列的載體。
7.—種生產(chǎn)人胸腺肽的方法，所述方法包括如下步驟(1)、在保持各自基因密碼子閱讀框架不變的前提下，在編碼人血清白蛋白部分基因序列和人胸腺肽基因的兩側(cè)引入限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)，然后通過(guò)酶切操作形成具有如下結(jié)構(gòu)的融合基因序列A-X-C，其中A部分為編碼成熟人血清白蛋白N-端1-150 1-372位氨基酸的核苷酸序列，X為編碼包含腸激酶或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切位點(diǎn)的連接肽的核苷酸序列，C為人胸腺肽基因；(2)、將上述的A-X-C融合基因序列連接到表達(dá)載體，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入酵母菌中，經(jīng)篩選得到重組基因工程菌；(3 )、高密度發(fā)酵重組酵母菌，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性的人血清白蛋白-胸腺肽融合蛋白，加入腸激酶或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切，經(jīng)分離純化獲得重組人胸腺肽。
8.根據(jù)權(quán)利要求7述的方法，其特征在于所述方法步驟(I)中，融合基因C部分的人胸腺肽基因?yàn)槿诵叵匐摩?、β或Y型基因。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法步驟(I)中，在人胸腺肽基因兩側(cè)引入限制性酶切位點(diǎn)，構(gòu)建如B-X-C-D結(jié)構(gòu)的基因序列，其中B和D為限制性酶切位點(diǎn)，X為編碼包含腸激酶(EK)或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切位點(diǎn)的連接肽的核苷酸序列，C為人胸腺肽基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述方法步驟(2)中，所述的載體選自酵母表達(dá)載體pPICZ- a -A、PHIL-D2, pPIC9或PHIL-S1，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pSVK3或pMSG。
全文摘要
本發(fā)明提供一種可以大規(guī)模，低成本生產(chǎn)人胸腺肽的方法，所述方法通過(guò)酶切操作形成具有如下結(jié)構(gòu)的融合基因序列A-X-C，其中A部分為編碼成熟人血清白蛋白N-端1-150～1-372位氨基酸的核苷酸序列，X為編碼包含腸激酶或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切位點(diǎn)的連接肽的核苷酸序列，C為人胸腺肽基因。將融合基因序列連接到表達(dá)載體，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入酵母菌中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶性的人血清白蛋白-胸腺肽融合蛋白，通過(guò)加入腸激酶或煙草蝕紋病毒(TEV)蛋白酶切，經(jīng)分離純化獲得重組人胸腺肽。本發(fā)明所述的胸腺肽生產(chǎn)方法具有可保證產(chǎn)品質(zhì)量一致性，不受原料來(lái)源限制，且成本很低，表達(dá)量高，可以大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102925470SQ20121045700
公開(kāi)日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月13日
發(fā)明者徐建華 申請(qǐng)人:紹興華泰生物科技有限公司