專利名稱：：一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調(diào)控基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調(diào)控基因及其應(yīng)用，屬于基因工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：真菌分泌的纖維素酶主要有外切葡聚糖苷酶，內(nèi)切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。纖維素酶液可以用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)化，紡織和食品等行業(yè)。不同的應(yīng)用方向?qū)γ敢褐忻赶当壤笫遣煌?。在某些方面，需要較高的β-glucosidase酶酶活。例如在生物質(zhì)轉(zhuǎn)化方面,真菌分泌的纖維素酶液β-glucosidase的酶活較低，通常導(dǎo)致纖維二糖的積累，致使其反饋抑制纖維二糖水解酶和內(nèi)切酶的酶活。所以可以提高酶液中β-glucosidase所占的比例，解除纖維二糖積累，提高生物質(zhì)轉(zhuǎn)化效率。在醫(yī)藥領(lǐng)域，人參皂苷具有很好的預(yù)防和抗腫瘤的功效。β-glucosidase將人參阜苷Rbl轉(zhuǎn)化成醫(yī)藥活性更高的人參阜苷Rd和化合物K。(Lin-HuQuan,Jin-ffooMin,YanJin,ChaoWang,Yeon-JuKim,andDeok-ChunYang。EnzymaticBiotransformationofGinsenosideRbltoCompoundKbyRecombinantβ-GlucosidasefromMicrobacteriumesteraromaticumJ.Agric.FoodChem.,2012,60(14),pp3776-3781)銀杏黃酮具有廣泛的藥理作用，也是極好的天然抗氧劑，銀杏黃酮被水解成苷元后清除人體氧自由基的生物活性要明顯高于糖苷型黃酮，將銀杏黃酮苷轉(zhuǎn)變成黃酮苷元是一種有效的方法是利用β-glucosidase的水解活性。(伍毅，王洪新，馬朝陽(2009)。固定化B-葡萄糖苷酶水解糖苷型銀杏黃酮的研究。哈爾濱工程大學(xué)學(xué)報第30卷第5期；584-588)。在啤酒行業(yè)，β-glucosidase通過水解糖苷鍵增加啤酒中芳香族物質(zhì)含量，從而提高啤酒香味。(C。Iasanta,I,caro,I.Perez(2009).β-glucosidaseimmobilizationonionexchangeresinsforusingasaromaticenhancementofwines.ChemicalEngineeringTransaction，Vol.17;897_902)o然而在某些方面，內(nèi)切酶在酶液當(dāng)中占的比例應(yīng)當(dāng)較為高。如洗滌行業(yè)，內(nèi)切酶通過對棉纖維的非結(jié)晶區(qū)水解，迫使被纖維素分子封閉的污垢釋放，但同時又不降低棉纖維的牢固度，從而達到較好的洗滌效果。在此發(fā)明當(dāng)中，我們從斜臥青霉114-2數(shù)據(jù)庫和里氏木霉QM6a數(shù)據(jù)庫中分別篩選得到了一個基因，利用高效基因操作平臺，對這個基因進行了基因敲除，發(fā)現(xiàn)敲除菌株相比出發(fā)菌株，各種纖維素酶活及蛋白含量都發(fā)生改變。此發(fā)明可以根據(jù)不同的需求用于不同的行業(yè)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因及其應(yīng)用。本發(fā)明技術(shù)方案如下一種真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因，核苷酸序列如SEQIDNO.I或SEQIDNO.4所/Jnο由上述真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因編碼的真菌纖維素酶酶活調(diào)控因子，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示。上述真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因在制備特定用途纖維素酶中的應(yīng)用。上述應(yīng)用，通過構(gòu)建序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.6所示的敲除盒取代上述真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因來實現(xiàn)。有益效果本發(fā)明所述的真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因及其調(diào)控因子可用于調(diào)控真菌中纖維素酶的酶活，通過敲除盒取代該真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因后，相比原初發(fā)菌株，纖維素酶活可改變20%左右，從而可以滿足各行業(yè)對不同纖維素酶酶活的需求。圖I是實施例I制得的敲除盒的電泳圖；其中1、實施例I中斜臥青霉當(dāng)中構(gòu)建的敲除盒，2、IKbMarker；圖2是實施例I得到的轉(zhuǎn)化子驗證示意圖。圖3是實施例I得到的轉(zhuǎn)化子PCR驗證圖。其中M2kbPlusMarker,I:利用pEl和pE9驗證轉(zhuǎn)化子I,2:利用pEl和pER驗證轉(zhuǎn)化子1，3:利用pEl和pE9驗證轉(zhuǎn)化子2，4:利用pEl和pER驗證轉(zhuǎn)化子2；圖4是實施例I得到的轉(zhuǎn)化子Southernblotting驗證圖。圖5是實施例I轉(zhuǎn)化子與出發(fā)株胞外發(fā)酵液中β-葡萄糖苷酶比活力圖。圖6是實施例I轉(zhuǎn)化子與出發(fā)株胞外發(fā)酵液中外切酶酶比活力圖。圖7是實施例I轉(zhuǎn)化子與出發(fā)株胞外發(fā)酵液中內(nèi)切酶酶比活力圖。圖8是實施例2制得的敲除盒的電泳圖；其中1、木霉當(dāng)中構(gòu)建的敲除盒，2、lKbMarker；圖9是實施例2得到的轉(zhuǎn)化子驗證示意圖。圖10是實施例2得到的轉(zhuǎn)化子PCR驗證圖。其中M2kbPlusMarker,I:利用tEl和tE9驗證轉(zhuǎn)化子1,2:利用tEl和tER驗證轉(zhuǎn)化子I;3:利用tEl和tE9驗證轉(zhuǎn)化子2，4:利用tEl和tER驗證轉(zhuǎn)化子2；圖11是實施例2得到的轉(zhuǎn)化子Southernblotting驗證圖。圖12是實施例2轉(zhuǎn)化子與出發(fā)株胞外發(fā)酵液中β_葡萄糖苷酶比活力圖。圖13是實施例2轉(zhuǎn)化子與出發(fā)株胞外發(fā)酵液中外切酶比活力圖。圖14是實施例2轉(zhuǎn)化子與出發(fā)株胞外發(fā)酵液中內(nèi)切酶比活力圖。圖15是實施例2轉(zhuǎn)化子與出發(fā)株胞外發(fā)酵液中濾紙酶活比活力圖。具體實施例方式下面結(jié)合說明書附圖及實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于此。培養(yǎng)基麩皮培養(yǎng)基組分如下，均為重量百分比10wt%麩皮浸出液，2wt%瓊脂，余量水?；九囵B(yǎng)基組分如下，每升組分如下葡萄糖20g，(NH4)SO45g，KH2PO415g，MgSO4O.6g，CaCl20.6g，F(xiàn)eSO4·7H200.005g,MnSO4·H2O0.0016g,ZnSO4·7H200.0014g,CoCl20.002g，胰蛋白胨IOg,pH5.5。下層培養(yǎng)基組分如下，每升組分如下葡糖糖20g,KH2PO415g,Sorbitol182.Ig,瓊脂糖10g,O.2μg/ml的抗硫胺素，1.5%瓊脂糖。上層培養(yǎng)基組分如下，每升組分如下葡萄糖20g，(NH4)SO45g，KH2PO415g，MgSO4O.6g，CaCl20.6g，F(xiàn)eSO4·7H200.005g,MnSO4·H2O0.0016g,ZnSO4·7H200.0014g,CoCl20.002g,胰蛋白胨IOg,Sorbitoll82.lg,0.2μg/ml的抗硫胺素，I.5%瓊脂糖。選擇培養(yǎng)基組分如下，每升組分如下葡萄糖20g，(NH4)SO45g，KH2PO415g，MgSO40.6g，CaCl20.6g，F(xiàn)eSO4·7H200.005g,MnSO4·H2O0.0016g,ZnSO4·7H200.0014g,CoCl20.002g，胰蛋白胨10g，0.2μg/ml的抗硫胺素，I.5%瓊脂糖。生理鹽水組分如下，均為重量百分比0.9wt%NaCl,0.5wt%吐溫80。抽提緩沖液組分如下，組分如下200mMTris-HCl,250mmol/LNaCl,25mmol/LEDTA，2%十二烷基硫酸鈉，pH8.5。菌株斜臥青霉，菌種保藏編號=CGMCC5302，購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。里氏木霉QM9414菌株，菌種保藏編號ATCC26921，購自美國菌種保藏中心。PME2892質(zhì)粒采用如下論文中記載的方法制備TakafumiKUB0DERA,NobuoYAMASHITA,AkiraNISHIMURA.2000.Pyrithiamineresistancegene(ptrA)ofAspergillusoryzae:cloning,characterizationandapplicationasadominantselectablemarkerfortransformation.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry.Vol.64(2000)No.7P1416-1421)實施例I真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因敲除盒的獲得(I)將斜臥青霉菌株在麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)三天，然后用生理鹽水將孢子洗脫下來，按照IXlO8比例接入基本培養(yǎng)基中，200rpm，30°C生長兩天，4000rpm離心，收集菌體，收集于I.5ml離心管中；(2)向離心管中加入500μI抽提緩沖液和0.Ig石英砂，漩渦劇烈振蕩lmin，使菌體分散于抽提緩沖液中，650C，放置20min;加入500μI苯酚/氯仿(混合比例I:I)，漩渦劇烈振蕩30s,12000rpm室溫離心IOmin,收集上清；將上清液轉(zhuǎn)至另一無菌的I.5ml離心管中，加入0.I倍體積的3MNaAc溶液(pH4.8)和O.6倍體積異丙醇，顛倒混勻，-20°C放置15min;12000rpm，4°C，lOmin，棄上清，力口濃度為O.Iμg/μIRNAase的ddH20200μ1，37。。，靜置Ih;加入200μI苯酚/氯仿(混合比例I:1)抽提一次，12000rpm,IOmin;上清轉(zhuǎn)移至另一I.5ml離心管中，加0.I倍體積3MNaAc(ρΗ4·8)和O.6倍體積異丙醇，_20°C放置20min,12000rpm,4°C,IOmin,收集沉淀；力口700μI70%乙醇(￥八)，洗滌一次(12000印111，21^11);待乙醇揮發(fā)完全，用5(^1ddH20溶解斜臥青霉基因組DNA，制得斜臥青霉基因組DNA；(3)以其斜臥青霉基因組DNA為模板，利用引物上游引物pEI:CGCCCAAGAATTGGCCAAGGAACGTGGTCTCGACGCAAAG，和下游引物pE2CCAATGGGATCCCGTAATCAATTGCCCTTTGCCCGGCAAAAAGTATAC,進行PCR擴增，PCR條件為-MV2min；94°C2min，65°C30s,72。。2.5min，30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存，制得片段I。(4)以斜臥青霉基因組DNA為模板,利用引物上游引物pE3CAAGAGCGGCTCATCGTCACCCCATTGCGAAACGACTTACAATAATAC,和下游引物pE4GATCATCATCTCCTCACAGACTCACACAGAGACATTTCATGTGCGATG,進行PCR擴增，PCR條件為-MV2min；94°C2min，65°C30s,72。。2.5min，30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存，制得片段2。(5)以pME2892質(zhì)粒作為模板，利用引物上游引物pE5AGTCGGTATGAATGTCACTGGGCAATTGATTACGGGATC,和下游引物pE6GCGGCTCATCGTCACCCCATA,PCR擴增硫胺嘧啶基因，PCR條件為94°C2min；94°C2min，55°C30s,72°C2.5min,30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存，制得片段3。(6)將上述PCR擴增的三個片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，大約在2000bp。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收三個片段；將片段I、片段2、片段3按照I:1:3的摩爾比例混合，采用的PCR條件為94°C2min；94°C2min，58°C10min，72°C3min,12個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存。(7)取出1μ1，稀釋10倍做為模板，利用引物上游引物ρΕ7GCCAGCCGCAGGACTGGAAC,和下游引物ρΕ8GACCGAGAGCGAACATGAGTACTG，PCR擴增條件94°C2min；94°C2min，57°C10min，72°C6min，30個循環(huán)；72°C，lOmin，制得敲除盒，序列如SEQIDNO.3所示，命名為pE，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，約6000bp,如圖I所示。轉(zhuǎn)化斜臥青霉菌株(I)將斜臥青霉菌株在麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)三天，利用生理鹽水，洗脫下孢子，在麩皮麩皮培養(yǎng)基上蓋一玻璃紙，并在其上面加入100μI孢子懸液，涂布均勻，30°c培養(yǎng)約15h，制得帶有萌發(fā)孢子的玻璃紙。(2)加O.Ig裂解酶(購自sigma公司，商品名稱sigma#L_1412)到20ml溶液I(I.2M山梨醇，O.IMKH2PO4)中，輕輕搖均；吸取23ml酶液到無菌培養(yǎng)皿中，加一層帶有萌發(fā)孢子的玻璃紙，再加23ml酶液，依次疊放10層。放置培養(yǎng)皿于30°C培養(yǎng)箱中。酶解約90min后，用鑷子(無菌)挑取玻璃紙，用移液槍吸取溶液沖掉玻璃紙上殘留的菌絲體，用玻璃棉漏斗過濾原生質(zhì)體懸液到置于冰上的50ml離心管中,然后用數(shù)毫升溶液I沖洗玻璃棉，然后2000rpm，4°C離心lOmin，去除上清液并用4ml溶液2(1M山梨醇，50mmol/LCaCl2,10mmol/LTrisHCl)重懸原生質(zhì)體,2000rpm,4°C離心IOmin,去除上清液,用O.5I.Oml溶液2(4°C)重懸原生質(zhì)體，放置原生質(zhì)體在冰上，制得原生質(zhì)體懸液。(3)將轉(zhuǎn)化體系(200μI原生質(zhì)體懸液，10μI純化ρΕ，50μI聚乙二醇分子量(5000-7000))在冰上放置20min，后加2mlPEG(室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，加入4ml溶液2，混勻；吸取O.2Iml到4ml預(yù)保溫的上層培養(yǎng)基中，輕輕混勻，倒在下鋪有下層培養(yǎng)基的平板上，等培養(yǎng)基凝固后，置30°C培養(yǎng)。在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)34d后，用接種針挑取轉(zhuǎn)化子到選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)生孢。(4)傳兩代后(培養(yǎng)3天)，將孢子轉(zhuǎn)入基本培養(yǎng)基中，提取染色體進行驗證，利用引物上游引物pERGAGGGCATACGATGGAAGTCATGGAATACTTTTGGCTGGAC,和下游引物pEI:CGCCCAAGAATTGGCCAAGGAACGTGGTCTCGACGCAAAG，進行PCR擴增，PCR條件為94°C2min；94°C2min,55°C30s,72°C6min，30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存。用lwt%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有一條2000bp的條帶，如圖2所/Jnο利用引物上游引物pE9:GGTTAGATATTCGTTTTGCCGAATAGAAT，和下游引物pEI:CGCCCAAGAATTGGCCAAGGAACGTGGTCTCGACGCAAAGA，采用PCR條件為940C2min；94°C2min,55°C30s,72°C6min,30cycle；72°C，10min，4°C保存。用lwt%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)2000bp的條帶，如圖2所示。southern驗證轉(zhuǎn)化子(I)以提取的斜臥青霉基因組DNA為模版，利用引物上游引物pEtl:TGGAACAGACTTTATGCTGTTTGAG，和下游引物pEt2GAAAGGTTTGCCCTTGAGACC,采用PCR條件為94°C2min；94°C2min，55°C30s,72°Clmin，30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一條1050bp條帶，制得探針模板；(2)取16μI的探針模板(IOng3ug),沸水浴中煮沸IOmin,迅速插入冰中，制得變性模板；將DIG-HighPrime(購自Roche公司)充分混勻，取4μI加入上述變性模板中，混勻后離心，37°C，孵育20h，65°C水浴lOmin，終止反應(yīng)。用和HindIII內(nèi)切酶(購自Fermentas公司)和SalI內(nèi)切酶(購自Fermentas公司)酶切基因組DNA，酶切反應(yīng)體系為60μIlOX酶切緩沖液，3U內(nèi)切酶/μgDNA，30μg基因組DNA，無菌ddH20補足至600μI；37°C酶切過夜，65°C加熱，IOmin終止酶切反應(yīng)。(3)將酶切后的基因組DNA用氯仿/異戊醇(混合比例1:1)抽提一次，無水乙醇_20°C沉淀過夜，70%乙醇洗滌2次，三蒸水重溶，體積控制在20μI左右；O.8wt%瓊脂糖凝膠電泳分離，緩沖液為IXTBE，電泳電壓40v，按照需要待指示劑溴酚藍遷移至合適位置時停止電泳；然后將凝膠經(jīng)變性液(O.5MNaoH,I.5MNacl)處理20min,重復(fù)一次，再用去離子水漂洗兩次，將凝膠浸泡于中和液(O.5MTris-Hcl(pH7.5)，3MNacl)中和20min，并重復(fù)一次。將DNA從膠中轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，轉(zhuǎn)移時間14小時，然后用2*SSC漂洗膜，121烘干半小時。(4)將烘干后的尼龍膜放入雜交杯中，加入雜交液3mL到雜交杯中，68°C預(yù)雜交2h。預(yù)雜交結(jié)束后，棄預(yù)雜交液，加入含探針雜交液。雜交溫度45度，雜交過夜。50mL洗滌液I(5ml20*SSC，44.5mL水，O.5ml10%十二烷基硫酸鈉。)洗膜5minX2次，然后用50mL洗滌液II(I.25ml20*SSC，47.25ml水+0.5ml10%SDS。)洗膜于雜交爐中，68°C洗15minX2次，然后加入馬來酸緩沖液10ml，室溫洗滌5分鐘。加入20ml的I*封堵液(18ml馬來酸緩沖液，2mll0*封堵緩沖液)，室溫放置30min。加入稀釋10000倍的抗體20ml(1.6ml10*抗體溶液，14.4ml馬來酸緩沖液，I.6ul抗體)室溫放置30min。加入80ml洗液(80ml馬來酸緩沖液+240ulTween20)室溫放置15min，重復(fù)一次。加入16ml檢測液室溫放置5min。加入IOml底物顯色液(IOml檢測液+200ulBCIP)，黑暗放置3小時。然后膜于無菌水中沖洗，晾干后掃描，見圖4.轉(zhuǎn)化子及出發(fā)菌株發(fā)酵液中，蛋白濃度，濾紙酶活，內(nèi)切酶酶活，ΑΤΡ，β_葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活測定將轉(zhuǎn)化子、出發(fā)菌株，在麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，洗脫下孢子，按照IX107的孢子量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基(麩皮2wt%，(NH4)SO45g/l,KH2PO415g/l，MgSO4O.6g/l,CaCl20.6g/l,微晶纖維素2wt%,水余量),200rpm,30°C,從第三天起每天取樣2ml,將剩余發(fā)酵液，12000rpm離心，IOmin,取出上清液,利用Lowery測定蛋白濃度，以pNPG和pNPC為底物測定β_葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活。選用DNS法測定內(nèi)切酶酶活，將各種酶活換算成比活力。分析本申請成功將SEQIDNO.I中的核苷酸序列利用SEQIDNO.3中核苷酸序列取代，經(jīng)PCR和Southernblotting驗證正確,在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上,敲除株相對出發(fā)株，β-葡萄糖苷酶比活力最最低降低28%，外切酶比活力最低下降30%，內(nèi)切酶比活力基本不變。實施例2真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因敲除盒的獲得(I)將里氏木霉QM9414菌株在麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)三天，然后用生理鹽水將孢子洗脫下來，按照IXio8比例接入基本培養(yǎng)基中，200rpm,30°C生長兩天，4000rpm離心，收集菌體，收集于I.5ml離心管中；(2)向離心管中加入500μI抽提緩沖液和O.Ig石英砂，漩渦劇烈振蕩lmin，使菌體分散于抽提緩沖液中，650C，放置20min;加入500μI苯酚/氯仿(混合比例I:I)，漩渦劇烈振蕩30s,12000rpm室溫離心IOmin,收集上清；將上清液轉(zhuǎn)至另一無菌的I.5ml離心管中，加入O.I倍體積的3MNaAc溶液(pH4.8)和O.6倍體積異丙醇，顛倒混勻，-20°C放置15min;12000rpm，4°C，lOmin，棄上清，力口濃度為O.Iμg/μIRNAase的ddH20200μ1，37。。，靜置Ih;加入200μI苯酚/氯仿(混合比例I:1)抽提一次，12000rpm,IOmin;上清轉(zhuǎn)移至另一I.5ml離心管中，加O.I倍體積3MNaAc(ρΗ4·8)和O.6倍體積異丙醇，_20°C放置20min,12000rpm,4°C,lOmin,收集沉淀；力口700μI70%乙醇(￥八)，洗滌一次(12000印111，21^11);待乙醇揮發(fā)完全，用5(^1ddH20溶解里氏木霉QM9414基因組DNA，制得里氏木霉QM9414基因組DNA；(3)以里氏木霉QM9414為模板，利用引物上游引物tElGGTAGATGTGCCAGGGGTCTACAGCGTTCTGGTACACGCC,和下游引物tE2TGATGGATGATTGTACCCCAGCTGCGCGTGTGGTTGTGCAGGTCG,進行PCR擴增，PCR條件為-MV2min；94°C2min,65°C30s,72。。2.5min，30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存，制得片段I。(4)以里氏木霉QM9414基因組DNA為模板，利用引物上游引物tE3:CCGAGAGGGTAGTAATGAGGGAGACGCTCGAACACAGCTGGTGAT，和下游引物tE4CTGACCTCTGCTTCGCTGGCCCCCTTAAAGGTGCCC,進行PCR擴增，PCR條件為-MV2min；94°C2min，65°C30s,72。。2.5min，30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存，制得片段2。(5)以里氏木霉QM9414基因組作為模板，利用引物上游引物tE5CGCAGCTGGGGTACAATC,和下游引物tE6CGTCTCCCTCATTACTACCCTC,PCR擴增，PCR條件為94°C2min；94°C2min,55°C30s,72°C2.5min，30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存，制得片段3。(6)將上述PCR擴增的三個片段用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，大約在2000bp。利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收三個片段；將片段I、片段2、片段3按照I:1:3的摩爾比例混合，采用的PCR條件為94°C2min；94°C2min，58°C10min，72°C3min,12個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存。(7)取出Iμ1，稀釋10倍做為模板，利用引物上游引物tE7TGAGTTCAGTGAAGGGGGAGGGAGTTTA,和下游引物tE8AGATGCTGTTGATGGCATCCTGAGCGGC,PCR擴增條件94°C2min；94°C2min，57°C10min，72°C6min，30個循環(huán)；72°C，lOmin，制得敲除盒，序列如SEQIDNO.3所示，命名為pE，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小，約6000bp,如圖I所示。轉(zhuǎn)化里氏木霉QM9414菌株(I)將里氏木霉QM9414菌株在麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)三天，利用生理鹽水，洗脫下孢子，在麩皮麩皮培養(yǎng)基上蓋一玻璃紙，并在其上面加入100μI孢子懸液，涂布均勻，30°c培養(yǎng)約15h，制得帶有萌發(fā)孢子的玻璃紙。(2)加O.Ig裂解酶(購自sigma公司，商品名稱sigma#L_1412)到20ml溶液I(1.2M山梨醇，O.IMKH2PO4)中，輕輕搖均；吸取23ml酶液到無菌培養(yǎng)皿中，加一層帶有萌發(fā)孢子的玻璃紙，再加23ml酶液，依次疊放10層。放置培養(yǎng)皿于30°C培養(yǎng)箱中。酶解約90min后，用鑷子(無菌)挑取玻璃紙，用移液槍吸取溶液沖掉玻璃紙上殘留的菌絲體，用玻璃棉漏斗過濾原生質(zhì)體懸液到置于冰上的50ml離心管中,然后用數(shù)毫升溶液I沖洗玻璃棉，然后2000rpm，4°C離心lOmin，去除上清液并用4ml溶液2(1M山梨醇，50mmol/LCaCl2,10mmol/LTrisHCl)重懸原生質(zhì)體,2000rpm,4°C離心IOmin,去除上清液,用O.5I.Oml溶液2(4°C)重懸原生質(zhì)體，放置原生質(zhì)體在冰上，制得原生質(zhì)體懸液。(3)將轉(zhuǎn)化體系(200μI原生質(zhì)體懸液，10μI純化tE，50μI聚乙二醇(分子量5000-7000)在冰上放置20min，后加2mlPEG(室溫)，輕輕混勻，20°C放置5min，加入4ml溶液2，混勻；吸取O.2Iml到4ml預(yù)保溫的上層培養(yǎng)基中，輕輕混勻，倒在下鋪有下層培養(yǎng)基的平板上，等培養(yǎng)基凝固后，置30°C培養(yǎng)。在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)34d后，用接種針挑取轉(zhuǎn)化子到選擇培養(yǎng)基，培養(yǎng)生孢。(4)傳兩代后(培養(yǎng)3天)，將孢子轉(zhuǎn)入基本培養(yǎng)基中，提取染色體進行驗證，利用引物上游引物tERTCATCGACTGGGCGCACATTG,和下游引物tElGGTAGATGTGCCAGGGGTCTACAGCGTTCTGGTACACGCC,進行PCR擴增，PCR條件為-MV2min；94°C2min,55°C30s，72°C6min，30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存。用lwt%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)有一條2000bp的條帶，如圖2所/Jnο利用引物上游引物tE9:AGTCTCTTAGGATCCCTTG，和下游引物tEl:GGTAGATGTGCCAGGGGTCTACAGCGTTCTGGTACACGCC，采用PCR條件為94°C2min；94°C2min,55°C30s,72°C6min,30cycle；72°C,10min，4°C保存。用lwt%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)沒有2000bp的條帶，如圖2所示。southern驗證轉(zhuǎn)化子(I)以提取的里氏木霉QM9414基因組DNA為模版，利用引物上游引物pEtl:TGGAACAGACTTTATGCTGTTTGAG，和下游引物pEt2GAAAGGTTTGCCCTTGAGACC,采用PCR條件為94°C2min；94°C2min，55°C30s,72°Clmin,30個循環(huán)；72°C，10min，4°C保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測電泳結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有一條1050bp條帶，制得探針模板；(2)取16μI的探針模板(IOng3ug),沸水浴中煮沸IOmin,迅速插入冰中，制得變性模板；將DIG-HighPrime(購自Roche公司)充分混勻，取4μI加入上述變性模板中，混勻后離心，37°C，孵育20h，65°C水浴lOmin，終止反應(yīng)。用和HindIII內(nèi)切酶(購自Fermentas公司)和SalI內(nèi)切酶(購自Fermentas公司)酶切基因組DNA，酶切反應(yīng)體系為60μIlOX酶切緩沖液，3U內(nèi)切酶/μgDNA，30μg基因組DNA，無菌ddH20補足至600μI；37°C酶切過夜，65°C加熱，IOmin終止酶切反應(yīng)。(3)將酶切后的基因組DNA用氯仿/異戊醇(混合比例1:1)抽提一次，無水乙醇_20°C沉淀過夜，70%乙醇洗滌2次，三蒸水重溶，體積控制在20μI左右；O.8wt%瓊脂糖凝膠電泳分離，緩沖液為IXTBE，電泳電壓40v，按照需要待指示劑溴酚藍遷移至合適位置時停止電泳；然后將凝膠經(jīng)變性液(O.5MNaoH,I.5MNacl)處理20min,重復(fù)一次，再用去離子水漂洗兩次，將凝膠浸泡于中和液(O.5MTris-Hcl(pH7.5)，3MNacI)中和20min，并重復(fù)一次。將DNA從膠中轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，轉(zhuǎn)移時間14小時，然后用2*SSC漂洗膜，121烘干半小時。(4)將烘干后的尼龍膜放入雜交杯中，加入雜交液3mL到雜交杯中，68°C預(yù)雜交2h。預(yù)雜交結(jié)束后，棄預(yù)雜交液，加入含探針雜交液。雜交溫度45度，雜交過夜。50mL洗滌液I(5ml20*SSC，44.5mL水，O.5ml10%十二烷基硫酸鈉。)洗膜5minX2次，然后用50mL洗滌液II(I.25ml20*SSC，47.25ml水+0.5ml10%SDS。)洗膜于雜交爐中，68°C洗15minX2次，然后加入馬來酸緩沖液10ml，室溫洗滌5分鐘。加入20ml的I*封堵液(18ml馬來酸緩沖液，2mll0*封堵緩沖液)，室溫放置30min。加入稀釋10000倍的抗體20ml(1.6ml10*抗體溶液，14.4ml馬來酸緩沖液，I.6ul抗體)室溫放置30min。加入80ml洗液(80ml馬來酸緩沖液+240ulTween20)室溫放置15min，重復(fù)一次。加入16ml檢測液室溫放置5min。加入IOml底物顯色液(IOml檢測液+200ulBCIP)，黑暗放置3小時。然后膜于無菌水中沖洗，晾干后掃描，見圖4.轉(zhuǎn)化子及出發(fā)菌株發(fā)酵液中，蛋白濃度，濾紙酶活，內(nèi)切酶酶活，ΑΤΡ，β_葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活測定將轉(zhuǎn)化子、出發(fā)菌株，在麩皮培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天后，洗脫下孢子，按照IXIO7的孢子量接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基(麩皮2wt%，(NH4)SO45g/l,KH2PO415g/l，MgSO4O.6g/l,CaCl20.6g/l,微晶纖維素2wt%,水余量),200rpm,30°C,從第三天起每天取樣2ml,將剩余發(fā)酵液，12000rpm離心，IOmin,取出上清液,利用Lowery測定蛋白濃度，以pNPG和pNPC為底物測定β-葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活。選用DNS法測定內(nèi)切酶酶活，以whatman濾紙為底物測定濾紙酶活。將各種酶活換算成酶的比活力，結(jié)果見圖12，13，14，15.分析本申請成功將SEQIDNO.4中的核苷酸序列利用SEQIDNO.6中核苷酸序列取代，經(jīng)PCR和Southernblotting驗證正確,在產(chǎn)酶培養(yǎng)基上,敲除株相對出發(fā)株，β-葡萄糖苷酶比活力最高提高50%，外切酶比活力最低下降30%，內(nèi)切酶比活力最低下降17%，濾紙酶活比活力下降47%。權(quán)利要求1.一種真菌纖維素酶酶系組成/特性調(diào)控基因，核苷酸序列如SEQIDNO.I或SEQIDNO.4所示。2.權(quán)利要求I所述真菌纖維素酶酶系組成/特性調(diào)控基因編碼的真菌纖維素酶酶活調(diào)控因子，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示。3.權(quán)利要求I所述真菌纖維素酶酶系組成/特性調(diào)控基因在制備特定用途纖維素酶中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，通過構(gòu)建序列如SEQIDNO.3或SEQIDNO.6所示的敲除盒取代上述真菌纖維素酶酶系組成/特性調(diào)控基因來實現(xiàn)。全文摘要本發(fā)明涉及一種真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因及其應(yīng)用，核苷酸序列如SEQIDNO.1或SEQIDNO.4所示；本發(fā)明還涉及真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因編碼的真菌纖維素酶酶活調(diào)控因子，氨基酸序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.5所示；以及真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因在制備特定酶活纖維素酶中的應(yīng)用。本發(fā)明所述真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因及其調(diào)控因子可用于調(diào)控真菌中纖維素酶的酶活，通過敲除盒取代該真菌纖維素酶酶活調(diào)控基因后，相比原初發(fā)菌株，纖維素酶比活力可改變20%左右，從而可以滿足各行業(yè)對不同纖維素酶酶活的需求。文檔編號C07K14/37GK102925463SQ20121044585公開日2013年2月13日申請日期2012年11月8日優(yōu)先權(quán)日2012年11月8日發(fā)明者方詡,王方忠,王明鈺,侯少莉,劉奎美,韓麗娟申請人:山東大學(xué)