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櫛孔扇貝TGF-βI型受體基因及其SNP位點的制作方法

文檔序號:3544787閱讀:470來源:國知局
專利名稱:櫛孔扇貝TGF-β I型受體基因及其SNP位點的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于分子遺傳標(biāo)記輔助育種技術(shù)領(lǐng)域,涉及櫛孔扇貝TGF-β I型受體基因TgfbrI的克隆,基因中與閉殼肌重量相關(guān)SNP位點的篩查分型技術(shù),及其在高產(chǎn)扇貝選育中應(yīng)用的方法。
背景技術(shù)
轉(zhuǎn)化生長因子β (transforming growth factor β , TGF- β )信號通路在細胞增殖、分化和生長等生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β配體通過結(jié)合TGF-β I型和II型受體,以及下游的胞內(nèi)信號分子,將信號傳遞到核內(nèi),調(diào)控目標(biāo)基因的表達。其中I型受體的激活被認為是TGF-β信號傳遞的重要環(huán)節(jié)。在哺乳動物中的研究表明,Tgfbrl基因與細胞的生長和增值有關(guān),該基因中的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點與許多生長性狀相關(guān)。
在海產(chǎn)八珍中,扇貝以其大而鮮美的閉殼肌(肉柱)著稱。培育高產(chǎn)扇貝新品種是扇貝養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的需要。獲得與扇貝生長性狀,特別是閉殼肌重量相關(guān)的基因及基因位點將有助于其分子育種。目前,在扇貝中獲得的與生長性狀相關(guān)的基因或基因位點較少,且尚無TGF-β信號通路受體基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆櫛孔扇貝TGF- β I型受體基因,篩查基因中與閉殼肌重相關(guān)的SNP位點,為高產(chǎn)櫛孔扇貝的選育提供SNP標(biāo)記及其應(yīng)用的技術(shù)方法。本發(fā)明一個方面提供一種櫛孔扇貝TGF-β I型受體基因,其核苷酸序列為SEQ IDNO: I。上述的TGF-β I型受體基因,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。本發(fā)明另一個方面提供櫛孔扇貝TGF-β I型受體基因的與閉殼肌重量相關(guān)的SNP位點,是序列為SEQ ID NO: I基因的1815位的堿基為C或Τ。上述的櫛孔扇貝TGF-β I型受體基因的SNP用于櫛孔扇貝的育種選育。用于檢測上述SNP的探針和引物序列信息如下探針5'- TTGTAAGGAAGTCGGATACCGAACT -3' SEQ ID NO:2 ;上游引物5'- GAGGTGTCAGACTGATTTTCAGGAG-3' SEQ ID NO:3 ;下游引物5'- ATGTCACAAAGGAAATTCATAAAGC -3' SEQ ID NO:4。本發(fā)明篩選的SNP位點為TT型的櫛孔扇貝,閉殼肌重量顯著高于CC型和CT型櫛孔扇貝,在高產(chǎn)櫛孔扇貝的選育過程中,可針對該位點,優(yōu)先選擇TT型的個體作為育種親本,以提聞選種的效率。


圖I :本發(fā)明篩選的櫛孔扇貝TGF-β I型受體基因全長cDNA序列及其編碼的氨基酸序列;
其中信號肽序列切割位點用箭頭標(biāo)出,10個保守的半胱氨酸殘基和跨膜區(qū)用陰影標(biāo)出,GS區(qū)用下劃線標(biāo)出,ATP結(jié)合區(qū)用陰影和下劃線標(biāo)出,L45 loop用黑框標(biāo)出,內(nèi)含子位置用黑三角標(biāo)出,終止密碼子用星號表示,加尾信號用陰影和黑框標(biāo)出。SNP位點c.1815 C>T用粗斜體表示。
具體實施例方式本發(fā)明采用同源克隆和cDNA末端快速擴增(RACE)技術(shù),從櫛孔扇貝中克隆得到了 TGF-β超家族I型受體基因cDNA全長序列。該序列全長1908 bp, ORF長度為1575bp,編碼524個氨基酸,預(yù)測蛋白分子量59.27 KD,等電點為7. 77 ;5’ UTR長度為15 bp,5’ UTR長度為318 bp。在其編碼蛋白N末端有一段30個氨基酸殘基組成的信號肽序列,在第142-164位氨基酸處有一段跨膜區(qū)。胞外區(qū)有10個保守的半胱氨酸殘基,其中3個在跨膜區(qū)附近形成典型的CCX5Cf結(jié)構(gòu)。胞內(nèi)主要是絲氨酸/蘇氨酸激酶區(qū),保守性較高,包括I型受體的典型結(jié)構(gòu)GS區(qū),第229-250位氨基酸處的ATP結(jié)合位區(qū),第283-291位氨基酸處決定受體-Smad結(jié)合特異性的L45 loop (ADNKDGTW)?!?br> 櫛孔扇貝Tgfbrl基因中與閉殼肌重相關(guān)SNP位點的篩查分析及其輔助高產(chǎn)櫛孔扇貝選育的方法通過分析獲得的Tgfbrl基因cDNA序列,篩查到I個SNP位點,命名為c. 1815C>T。運用高分辨率熔解曲線技術(shù)(High resolution melting, HRM)在柿孔扇貝一個自然群體中檢測位點多態(tài)性,結(jié)果表明,在所測群體中,該SNP位點呈二態(tài)(圖I)。One-way ANOVA和post-hoc檢驗顯示,c. 18150T位點與櫛孔扇貝閉殼肌重顯著相關(guān),TT型個體的閉殼肌重顯著高于CC和CT型個體(P〈0. 05)(表I)。利用位點c. 18150T的分型技術(shù),可對櫛孔扇貝育種候選群體進行基因分型,結(jié)合其它與生長性狀相關(guān)位點的分型信息,優(yōu)先選擇位點c. 18150T為TT型的個體用于高產(chǎn)扇貝選育的親本。下面通過實施例對本發(fā)明做進一步說明。實施例I.克隆得到櫛孔扇貝TGF-β超家族I型受體基因Tgfbrl,具有SEQ ID NO. I所示的序列。本發(fā)明中的櫛孔扇貝Tgfbrl基因cDNA序列克隆包括下列步驟a)櫛孔扇貝閉殼肌總RNA的提取;b)cDNA第一鏈的合成;c)目的基因cDNA片段的獲得;d)櫛孔扇貝5,RACE和3,RACE文庫構(gòu)建;e)目的基因全長cDNA序列的犾得;f)目的基因的生物信息學(xué)分析。具體操作如下a)柿孔扇貝總RNA的提取按照Trizol方法從柿孔扇貝閉殼肌中提取總RNA。b) cDNA第一鏈的合成以2 μ g總RNA為模板,分別加入I μ I 20 μ M Oligod(T) 18, RNase & DNase-free H2O補足至13 μ I,混勻離心。70°C保溫10 min,立即置于冰上,以打開 RNA 二級結(jié)構(gòu)。依次加入5 μ I 5XM-MLV Buffer, 5 μ I dNTP (2. 5mM),I μ IRNasin (40U/ μ I), I μ I M-MLV (200U/μ I);混勻離心后,42°C,90 min。94°C,5 min, VX滅活反轉(zhuǎn)錄酶。分裝后-20°C保存。c)同源克隆獲得目的基因的cDNA片段根據(jù)已報道的太平洋牡蠣、海膽、斑馬魚、虹鱒、非洲爪蟾、原雞、小鼠和人類等物種的TGF-β I型受體基因cDNA及氨基酸序列,選擇保守性高的區(qū)域設(shè)計簡并引物d)TGFBRl-fl: 5' -GAYAAYAARGAYAAYGGIACITGG-3';e)TGFBRl-rl: 5' - GGIGCCATRTAICKYTTIGTIC-3'。而后以cDNA第一鏈為模版,進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物用I. 2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,用膠回收試劑盒(上海生工)進行PCR產(chǎn)物純化,再與pMD18-T載體(大連寶生物工程有限公司)連接,參照《分子克隆第三版》(黃培堂譯,科學(xué)出版社,2002年)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci。菌落PCR檢測后,挑取陽性克隆進行測序,將測序結(jié)果與GenBank蛋白數(shù)據(jù)庫中已知序列作 blastx 同源性分析(http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast/)。 f)櫛孔扇貝 5’ RACE和 3’ RACE 文庫構(gòu)建利用 Clontech 公司 SMART RACE cDNAAmplification Kit 構(gòu)建 5' RACE 和 3' RACE 文庫。g)目的基因全長cDNA序列的獲得根據(jù)(C)得到的Tgfbrl基因cDNA片段序列,用PrimerPremier 5. O分別設(shè)計目的基因RACE引物,3,' RACE 引物5' -TCAACCGTACTGTGGTCAGCATCTCCG-3'5' RACE 引物5' -CCAATGATCTCCATGTGGAGGTGGGCG-3'。分另Ij利用3’ RACE引物和5’ RACE引物與接頭引物NUP(5’ - AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT - 3’ )進行 3’ 末端和 5’ 末端的擴增。PCR 產(chǎn)物用 I. 2% 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測,用膠回收試劑盒(上海生工)進行PCR產(chǎn)物純化,再與pMDlS-Τ載體(大連寶生物工程有限公司)連接,參照《分子克隆第三版》(黃培堂譯,科學(xué)出版社,2002年)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。菌落PCR檢測后,對5’ RACE和3’ RACE,各挑取3個陽性克隆進行測序,將5’ RACE和3’ RACE測序獲得的序列兩端拼接后得到cDNA全長序列,見SEQ ID NO. I。3’和5’末端擴增,利用50 μ 反應(yīng)體系
S5(T)-RACE-Ready cDNA2.5μ1I Οχ Advantage 2 PCR buffer5.0μ1
IOmMdNTPMixΙ.ΟμΙ
IOxUPM5,0μ1
2μΜ S5(B5)RACE 引物5,0μ1
50X Advantage 2 Polymerase Mix LOpl PCR-GradeWater30·5μ1擴增所用PCR反應(yīng)程序94 °C預(yù)變性5min ;94°C變性30sec,72°C 3min,5個循環(huán);94°C變性 30sec,70°C退火 30sec,72°C延伸 3min,5 個循環(huán);94°C變性 30sec,65°C退火30sec, 72°C延伸 3min, 28 個循環(huán);72°C延伸 IOmin0
h)目的基因的生物信息學(xué)分析在NCBI 數(shù)據(jù)庫中對該序列進行 BLASTx (http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)比對。應(yīng)用ProtParam工具對SQR物理和化學(xué)參數(shù)進行預(yù)測,包括蛋白質(zhì)的相對分子量、理論 PI 值等(WWW. expasy. ch/too I s/protparam. html)。通過互聯(lián)網(wǎng)在線服務(wù)器 http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/,對TGF-β超家族I型受體蛋白序列進行了信號肽的預(yù)測。運用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/)軟件預(yù)測該蛋白的功能域° 運用 Phyre 2. O (http://www.imperial.ac.uk/phyre2/)和 Swiss-Pdb Viewer 4. 04(http://spdbv. vital-it. ch/)分析絲氨酸 / 蘇氨酸激酶區(qū)。運用 ClustalW2 和 GeneDoc(http: //www. nrbsc. org/gfx/genedoc/index, html)多序列比對工具與其他物種 TGF- β超家族I型受體蛋白序列進行比對,分析該蛋白功能區(qū)域。分析結(jié)果如圖I所示。實施例2本發(fā)明中的櫛孔扇貝Tgfbrl基因中閉殼肌重量相關(guān)SNP位點的篩查分析及其在高產(chǎn)櫛孔扇貝選育中應(yīng)用的方法,包括下列步驟 a)櫛孔扇貝Tgfbrl基因SNP位點篩查;b)柿孔扇貝基因組DNA提??;c)位點c. 18150T分型用引物和探針設(shè)計;d) SNP c. 1815C>T 分型;e)c. 18150T基因型與閉殼肌重的相關(guān)性分析;f) SNP c. 18150輔助高產(chǎn)櫛孔扇貝選育的方法。具體操作如下a)櫛孔扇貝Tgfbrl基因SNP位點篩查分析5' RACE和3' RACE不同克隆的測序結(jié)果,查找候選SNP位點。b)櫛孔扇貝DNA的提取取閉殼肌約O. I g,加入500 μ I STE裂解緩沖液,剪碎,依次加入50 μ I 10% SDS,5 μ I蛋白酶K (20 mg/ml),56°C裂解約3 h,至裂解液澄清。加入同體積飽和酚(250 μ I),氯仿/異戊醇(24:1) (250 μ I),輕輕晃動20 min,12000rpm離心10 min。取上清,重復(fù)上述步驟,直至水相與有機相之間無蛋白質(zhì)層。取上清,力口入同體積氯仿/異戍醇,輕晃20 min, 12000 rpm離心10 min。取上清,加入1/10體積3M NaAc (pH 5.2)和2倍體積冷無水乙醇,搖勻后_20°C靜置20 min, 12500 rpm離心20min。將核酸沉淀于管底。棄上清,70%乙醇洗滌沉淀。收集沉淀,空氣中干燥至乙醇全部揮發(fā)。加入20 μ I TE (含RNase Α)溶解DNA,37°C靜置約30 min后,4°C保存。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品,紫外分光光度計檢測濃度及純度。c)位點c. 18150T分型用引物和探針的設(shè)計根據(jù)SNP位點c. 18150T附近的基因序列,設(shè)計HRM分型用引物和探針。標(biāo)準(zhǔn)如下1)探針長度為19-35 bp ;只包含I個候選SNP位點,位點居于探針中間,不含缺失位點;退火溫度為58°C- 60°C;不含簡單重復(fù)序列及回文序列。2)引物長度19-26bp ;引物序列中不包含候選SNP位點及缺失位點;擴增產(chǎn)物長度70-130 bp ;GC含量30%-70%。探針TGFBRlpbl序列為5' - TTGTAAGGAAGTCGGATACCGAACT -3/ (SEQ ID NO:3);弓丨物序列為上游引物TGFBRlsfl5' - GAGGTGTCAGACTGATTTTCAGGAG-3';
下游引物TGFBRlsrl :5' - ATGTCACAAAGGAAATTCATAAAGC -3/。d) SNP位點c. 18150T分型以櫛孔扇貝一個自然群體的196只個體的基因組DNA為模板,利用引物TGFBRlsfl和TGFBRlsrl進行PCR擴增,反應(yīng)體系如下10 XBufferI μ 1,2. 5 mM dNTP O. 8 μ 1,2. 5 mM MgCl2,0. 6 μ I, TGFBRlsfl (10 μ Μ) O. I μ I,TGFBRlsrl (10 μ Μ) O. 5 μ I, Taq 酶(5U/μ I) O. I μ 1,模板 O. 5 μ I, LC Green 飽和熒光染料O. 7 μ ,加H2O補足至10 μ I。擴增反應(yīng)在Biometra T -Gradient PCR系統(tǒng)上完成,反應(yīng)條件如下94°C 4 min ;94°C 40 s,63°C 40 s,60次循環(huán);72°C 5 min。向每份PCR產(chǎn)物中加入3μ L對應(yīng)探針TGFBRlpbl (10 μΜ),95 變性10 min。取10 μ I變性產(chǎn)物轉(zhuǎn)入96孔BLK/WHT板中(Bio-Rad),加入15 μ I礦物油,2000 rpm離心I min。Light-Scanner中進行分型檢測,以O(shè). 1°C /s的速率從40°C升溫至95°C,持續(xù)采集熒光信號。用LightScanner Call IT v2. O軟件分析溶解曲線。記錄個體的基因型熔解曲線單峰溫度高者為與探針序列相同純合型,熔解曲線雙峰者為雜合型,熔解曲線單峰溫度低者為突變純合型。e) c. 1815CXT基因型與閉殼肌重的相關(guān)性分析用電子天平測量該群體每個個體的閉殼肌重量。利用One-way ANOVA和post-hoc檢驗,分析位點c. 1815CXT不同基因型櫛孔扇貝閉殼肌重均值的差異,檢驗SNP c. 1815CXT與櫛孔扇貝閉殼肌重的相關(guān)性,結(jié)果如下表所示表I: c. 1815 C>T位點不同基因型櫛孔扇貝閉殼肌重量
權(quán)利要求
1.一種櫛孔扇貝TGF-β I型受體基因,其核苷酸序列為SEQ ID NO: I。
2.權(quán)利要求I所述的TGF-βI型受體基因,其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
3.一種與櫛孔扇貝閉殼肌重量相關(guān)的SNP位點,其特征在于,所述的SNP位點為權(quán)利要求I所述的TGF-β I型受體基因的1815位,其堿基為C或Τ。
4.權(quán)利要求3所述的SNP位點用于櫛孔扇貝的育種選育。
5.用于檢測權(quán)利要求3所述的SNP的探針和引物,其序列信息如下 探針序列為SEQ ID NO:3 ; 上游引物序列為SEQ ID NO:4 ; 下游引物序列為SEQ ID NO:5。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子遺傳標(biāo)記技術(shù)中櫛孔扇貝TGF-β超家族I型受體基因Tgfbr1的克隆,基因中與閉殼肌重量相關(guān)SNP位點的篩查分型技術(shù),及其在高產(chǎn)扇貝選育中應(yīng)用的方法。利用同源克隆的策略獲得櫛孔扇貝Tgfbr1基因的全長cDNA序列;通過blastn比對發(fā)現(xiàn)一個單核苷酸多態(tài)性SNP位點,針對該位點設(shè)計引物和探針,采用高分辨率熔解曲線技術(shù)在一個櫛孔扇貝自然群體中進行SNP分型,并測量每個體的閉殼肌重。統(tǒng)計分析顯示位點c.1815C>T與櫛孔扇貝閉殼肌重顯著相關(guān),TT型個體的閉殼肌重顯著高于CC 和CT型個體。在高產(chǎn)櫛孔扇貝的選擇育種過程中,可對櫛孔扇貝育種候選群體進行位點c.1815C>T分型,結(jié)合其它與生長性狀相關(guān)位點的分型信息,優(yōu)先選擇位點c.1815C>T為TT型的個體作為育種親本。
文檔編號C07K14/71GK102899330SQ20121043986
公開日2013年1月30日 申請日期2012年11月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月6日
發(fā)明者包振民, 胡曉麗, 張玲玲, 王師, 郭慧慧, 張月月 申請人:中國海洋大學(xué)
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