两个人的电影免费视频_国产精品久久久久久久久成人_97视频在线观看播放_久久这里只有精品777_亚洲熟女少妇二三区_4438x8成人网亚洲av_内谢国产内射夫妻免费视频_人妻精品久久久久中国字幕

雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法

文檔序號(hào):3544541閱讀:453來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法
雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法所屬技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及一種在雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法。
背景技術(shù)
褪黑素(melatonin,MT)是由動(dòng)物腦部的松果體細(xì)胞在暗環(huán)境下所分泌的吲哚類激素,其化學(xué)名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺。它的生理功能是由褪黑素受體(melatonin acceptor,MTR)介導(dǎo)的,松果體是生物鐘的重要組成部分,通過(guò)分泌褪黑素的節(jié)律性改變來(lái)影響許多組織、腺體的代謝功能。因此,研究褪黑素及其受體作用機(jī)制、作用靶器官等對(duì)于揭示、提高和調(diào)控動(dòng)物許多生理機(jī)能具有重要的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值。研究發(fā)現(xiàn),MTR是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)并與醫(yī)學(xué)有著重要的關(guān)系。主要存在于腸組織上。MTR與MT特異性結(jié)合,通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。MT可影響哺乳動(dòng)物次級(jí)毛囊和毛絨生長(zhǎng),能夠刺激體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物次級(jí)毛囊纖維生長(zhǎng),可調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能,同時(shí)可以誘導(dǎo)皮毛提如成熟,提聞毛續(xù)廣量。
褪黑素受體的研究,在2008年,李子海等人研究了褪黑素對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的影響就, 表明不同濃度的褪黑素對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)和毛發(fā)顏色的影響不同。2011年,陳建波等人就褪黑素受體對(duì)絨山羊絨毛生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)理作了研究,結(jié)果表明褪黑激素對(duì)絨山羊絨毛生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,褪黑激素是通過(guò)影響類胰島素生長(zhǎng)因子或催乳素的分泌間接影響絨毛生長(zhǎng);是通過(guò)調(diào)控皮膚組織中脫碘酶基因表達(dá)或者改變皮膚中催乳素受體基因可變剪接規(guī)律影響絨毛生長(zhǎng)。
在雙峰駝中,褪黑素受體具有廣泛的生物學(xué)功能,尤其對(duì)動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)周期、換毛等其它生物節(jié)律和免疫活動(dòng)等都具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此,對(duì)駱駝褪黑素受體的研究將有助于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展。發(fā)明內(nèi)容
一種雙峰駝褪黑素受體,其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示
(a) SEQ ID NO. 2 所示序列;
(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或/和疊加一個(gè)或多個(gè)氨基酸衍生得到的,且與(a)編碼蛋白質(zhì)具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
一種雙峰駝褪黑素受體編碼基因,該序列是與毛囊發(fā)育和毛色形成密切相關(guān)的基因,其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示
(a) SEQ ID NO.1 所示序列;
(b)由堿基簡(jiǎn)并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性,且與 (a)編碼相同功能蛋白質(zhì)的序列。
本發(fā)明還提供了一種雙峰駝褪黑素受體基因的克隆和測(cè)序方法,該方法包括步驟(I)組織分離(Isolation) ; (2)總 RNA 的分離(Total RNA isolation)包括①提取 RNA 的準(zhǔn)備工作組織總RNA提取組織總RNA的鑒定。(3)全長(zhǎng)cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括①引物設(shè)計(jì)及合成RT-PCR擴(kuò)增;③克隆和測(cè)序,其特征在于 PCR引物的正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4,其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’
SEQ ID NO. 4 01igo dT ;
上述從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA為將雙峰駝耳部組織放入裝有Trizol 的勻漿器管中勻漿,離心分離,吸取上清液,在15-30°C溫育5分鐘,加氯仿,劇烈震蕩,繼續(xù)在15-30°C溫育2-3分鐘,再次離心分離,吸取上清液,加異丙醇混合均勻,然后15-30°C溫育10分鐘,離心分離,所得沉淀物加75%乙醇洗滌,離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。分離提取后的總RNA用分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量和用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量。
上述反轉(zhuǎn)錄PCR按照大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
上述克隆和測(cè)序包括PCR擴(kuò)增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)、質(zhì)粒的回收、質(zhì)粒的酶切鑒定和重組質(zhì)粒的測(cè)序。
上述PCR擴(kuò)增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進(jìn)行。
上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。
上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化為將感受態(tài)細(xì)胞加入到回收片段同T載體的連接產(chǎn)物中,冰浴 30分鐘,然后在42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘,立即置入冰浴中2分鐘,加液體LB培養(yǎng)基,37°C 復(fù)活50分鐘,后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上,37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
上述轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)為挑選轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落,放入到加有PCR反應(yīng)液的EP管中晃動(dòng),使單菌落充當(dāng)模板;用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物同 Marker 一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,鑒別T載體上是否含有目的片段;若得到目的片段,可挑取在LB平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落,放入含有的青霉素鈉LB液體培養(yǎng)基中,37°C過(guò)夜搖菌培養(yǎng),用于質(zhì)?;厥铡?br> 上述質(zhì)粒的回收用上海華舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒實(shí)現(xiàn)。
上述質(zhì)粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定,選擇內(nèi)切酶Bam H I和Hin d III。
本發(fā)明在提供了雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列和蛋白編碼序列基礎(chǔ)上;將人、鼠、牛等不同物種褪黑素受體基因的CDS序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較;對(duì)包括雙峰駝在內(nèi)的8個(gè)物種的八個(gè)褪黑素受體基因的CDS序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明中的雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列是通過(guò)以雙峰駝耳部組織中總 RNA為模板,參考人、鼠、牛等物種的褪黑素受體基因的同源序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO.1。將雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見(jiàn) SEQ ID NO. 2。
在SEQ ID NO.1中,RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1140bp,電泳結(jié)果見(jiàn)附圖1,其中19-21位為起始密碼子ATG,1105-1107位為終止密碼子TAA,19-1107位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(OTS)。 在SEQ ID NO.1,雙峰駝褪黑素受體基因編碼362個(gè)氨基酸。雙峰駝與褐家鼠(AAG18471.1) 的褪黑素受體核酸序列具有94%的相似性。雙峰駝和人、鼠、牛等動(dòng)物用Clustal X中對(duì)齊的褪黑素受體基因編碼氨基酸序列同源性比較結(jié)果見(jiàn)附圖2。
對(duì)包括SEQ ID NO.1在內(nèi)的8個(gè)物種的八條褪黑素受體基因的⑶S序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙峰駝褪黑素受體同褐家鼠的進(jìn)化距離最近,間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
本發(fā)明所得到的褪黑素受體蛋白的基因序列和該蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)可用于研究其在黑素合成的下游途徑中的重要作用,為闡明雙峰駝絨毛生長(zhǎng)機(jī)理和未來(lái)產(chǎn)生人為控制絨毛產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)和依據(jù),并能夠?yàn)槠渌溉閯?dòng)物的絨毛生長(zhǎng)機(jī)理研究奠定一定的生物學(xué)基礎(chǔ)。


圖1為雙峰駝褪黑素受體基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖2為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)所用褪黑素受體氨基酸同源性比較;
圖3為不同物種褪黑素受體氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
具體實(shí)施方式
下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明,但不用來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1:雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列的克隆
1、組織分離(Isolation)
從內(nèi)蒙古阿拉善盟雙峰駝,快速采得樣品,將耳部組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70°C保存,拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
2、總 RNA 的分離(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的準(zhǔn)備工作
玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過(guò)夜,用自來(lái)水反復(fù)沖洗,再用蒸餾水沖洗2遍, 180°C烘烤4小時(shí)。
勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘,再用0.1 %的DEPC水沖洗。由于未滅活的DEPC對(duì)PCR反應(yīng)有影響,可用0. 5%的SDS處理。
Tip頭、EP管用0.1 %的DEPC水浸泡過(guò)夜,高壓滅菌使DEPC失活。
雙蒸水和溶液用DEPC處理,即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液,室溫放置過(guò)夜, 高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
(2)組織總RNA提取
取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有 Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL,USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000rpm離心10分鐘。吸取上清液,15_30°C溫育5分鐘。 加0. 2ml氯仿,蓋上蓋子,用手劇烈震蕩15秒。15-30°C溫育2-3分鐘。4°C 12000rpm離心 15分鐘。吸取上清液,加0. 8ml異丙醇,混合均勻。15-30°C溫育10分鐘,4°C 12000rpm離心 10分鐘,離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清,加Iml 75%乙醇洗滌RNA,4°C 7500rpm 離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝,_70°C保存。
(3)組織總RNA的鑒定
通過(guò)分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量并且用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質(zhì)量,具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4_5小時(shí),再用DEPC處理過(guò)的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入I X TBE待用。瓊脂糖凝膠用IXTBE配制。在IOul上樣緩沖液 (2XTBE,13%菲可,O. 1%溴酚蘭,7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA,65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2-3分鐘。點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
3、全長(zhǎng) cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
(I)引物設(shè)計(jì)及合成
根據(jù)GenBanK發(fā)表的綿羊(ACF74448.1)、褐家鼠(AAG18471.1)等物種的褪黑素受體基因mRNA序列ORF側(cè)翼同源序列,設(shè)計(jì)如下引物用于以雙峰駝褪黑素受體cDNA為模版的PCR擴(kuò)增,以獲得雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列。引物用Primer Premier5. O自行設(shè)計(jì),由上海桑尼生物科技有限公司合成,該引物對(duì)的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:3(正向)和SEQ ID NO :4(反向),序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’
SEQ ID Ν0·4(反向)01igo dT
(2) RT-PCR 擴(kuò)增
按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成10ul2XBca 1st Buffer,4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixture,0. 5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20,總體系為 20ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65°C I 分鐘,30°C 5 分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫),65°C 25分鐘,98°C 5分鐘,5°C 5分鐘。PCR擴(kuò)增條件 97°C變性5分鐘;95°C 30秒一55V 30秒一72V I分鐘,如此進(jìn)行30次循環(huán);72°C延伸10 分鐘,4 °C保存。
(3)克隆和測(cè)序
PCR擴(kuò)增片段的回收。片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,操作過(guò)程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊,放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg瓊脂糖加入 300ulSl液的比例加SI液,50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱,IOOOOrpm離心I分鐘,倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液,IOOOOrpm離心15秒,倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液,靜置I分鐘后,IOOOOrpm離心15秒,倒掉管中液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中,在吸附膜中央加入30ulTl液,靜置I 分鐘后,IOOOOrpm離心I分鐘,EP管中液體即為回收的DNA。
回收片段同T載體的連接。連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒,操作過(guò)程如下在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液pMD18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul,DNA20-40ng, Solution I 5ul,加dH20至10ul。將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過(guò)夜也可以),產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。從_70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞,冰浴助溶。IOOul感受態(tài)細(xì)胞加入IOul連接產(chǎn)物,冰浴30分鐘。42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘,立即置入冰浴中2分鐘。加 400ul液體LB培養(yǎng)基,37°C復(fù)活50分鐘。取IOOul鋪于LB平板上,平板含0.1 % (V/V)的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)。用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落,用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板,是指引物、DNA聚合酶、dNTP、緩沖液及水加上剛才的單菌落就成了 PCR反應(yīng)體系)的EP管中晃動(dòng),使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物同Marker —起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,鑒別T載體上是否含有目的片段。若得到目的片段,可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落, 放入40ml LB液體培養(yǎng)基中,先在液體中加入O.1 % (V/V)的青霉素鈉(100mg/ml),37°C過(guò)夜搖菌培養(yǎng),用于質(zhì)?;厥铡?br> 質(zhì)粒的回收。質(zhì)粒回收用上海華舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒,操作步驟如下將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1. 5mlEP管中,4000rpm離心,倒掉液體獲細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀不夠時(shí)可再加一次菌液離心。在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液,振蕩懸浮。加入250ulP2液,溫和搖勻,室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液,溫和搖勻。離心10分鐘,將上清液小心移入吸附柱,離心15秒,倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl,離心15秒,倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl,靜置I分鐘,離心15秒,倒掉液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中,在吸附膜中央加入25-30ulTl液,靜置I分鐘后,離心I分鐘.EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。
質(zhì)粒的酶切鑒定。為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒,采用雙酶切法鑒定.本研究具體操作如下根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖,選擇內(nèi)切酶Bam H I和 Hin d II1.保證目的片段中無(wú)這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系Bam H I lul,Hin d III lul, IOXK Buffer 2ul,DNA 彡 lul,加 dH20 至 20ul。30°C反應(yīng) 3 小時(shí)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
重組質(zhì)粒的測(cè)序。取20ul重組質(zhì)粒于EP管中,封口膜密封,交生物技術(shù)公司測(cè)序。
實(shí)施例2 :雙峰駝褪黑素受體基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建
1、雙峰駝褪黑素受體基因編碼序列同源性比較
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等七種動(dòng)物的褪黑素受體基因編碼蛋白序列, 將其同克隆測(cè)序獲得的本發(fā)明獲得的SEQ ID NO.1序列一起,在分子生物學(xué)軟件MEGA4上進(jìn)行序列同源性比較(見(jiàn)附圖2)。比較結(jié)果顯示SEQ ID NO. 2序列與褐家鼠的褪黑素受體氨基酸序列同源性為94. 00%。
2、褪黑素受體基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等七種物種的7條褪黑素受體基因的編碼蛋白序列,加上本發(fā)明獲得的SEQ ID NO. 2序列,利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù) (見(jiàn)附圖3)。結(jié)果顯示雙峰駝褪黑素受體基因同褐家鼠的親緣關(guān)系最近;間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
序列表
<110>內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120〉雙峰駝褪黑素受體的蛋白編碼序列
<160>4
<170>PatentIn version3. 3
<210>1
<211>1140
<212>DNA
〈213〉阿拉善盟雙峰駝
<400>權(quán)利要求
1.一種雙峰駝褪黑素受體,其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO. 2 所示序列;(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或/和疊加一個(gè)或多個(gè)氨基酸衍生得到的,且與(a)編碼蛋白質(zhì)具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
2.一種雙峰駝褪黑素受體編碼基因,其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO.1 所示序列;(b)由堿基簡(jiǎn)并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性,且與(a)編碼相同功能蛋白質(zhì)的序列。
3.—種雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,該方法包括如下步驟(1)從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA;(2)根據(jù)人、鼠及牛不同物種的褪黑素受體基因的同源序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR,其中引物的正向引物為 SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’反向引物為 SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ;(3)克隆和測(cè)序。
4.按照權(quán)利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA為將雙峰駝耳部組織放入裝有Trizol的勻漿器管中勻漿,離心分離,吸取上清液,在15-30°C溫育5分鐘,加氯仿,劇烈震蕩,繼續(xù)在15-30°C溫育2_3分鐘,再次離心分離,吸取上清液,加異丙醇混合均勻,然后15-30°C溫育10分鐘,離心分離,所得沉淀物加75%乙醇洗滌,離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。
5.按照權(quán)利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于分離提取后的總RNA用分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量和用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量。
6.按照權(quán)利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述反轉(zhuǎn)錄PCR按照大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
7.按照權(quán)利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述克隆和測(cè)序包括PCR擴(kuò)增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)、質(zhì)粒的回收、質(zhì)粒的酶切鑒定和重組質(zhì)粒的測(cè)序。
8.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述PCR擴(kuò)增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進(jìn)行。
9.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。
10.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化為將感受態(tài)細(xì)胞加入到回收片段同T載體的連接產(chǎn)物中,冰浴30分鐘,然后在42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘,立即置入冰浴中2分鐘,加液體LB培養(yǎng)基,37°C復(fù)活50分鐘,后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上,37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
11.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)為挑選轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落,放入到加有PCR反應(yīng)液的EP管中晃動(dòng),使單菌落充當(dāng)模板;用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物同Marker —起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,鑒別T載體上是否含有目的片段;若得到目的片段,可挑取在LB平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落,放入含有的青霉素鈉LB液體培養(yǎng)基中,37°C過(guò)夜搖菌培養(yǎng),用于質(zhì)粒回收。
12.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述質(zhì)粒的回收用上海華舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒實(shí)現(xiàn)。
13.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述質(zhì)粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定,選擇內(nèi)切酶Bam H I和Hin d III。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法,本發(fā)明中的雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列是通過(guò)以雙峰駝組織中總RNA為模板,參考人、鼠、牛等物種的褪黑素受體基因的同源序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO.1。將雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見(jiàn)SEQ ID NO.2。本發(fā)明通過(guò)對(duì)包括SEQ ID NO.1在內(nèi)的8個(gè)物種的八條褪黑素受體基因的CDS序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙峰駝褪黑素受體同褐家鼠的進(jìn)化距離最近,間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
文檔編號(hào)C07K14/72GK102993295SQ201210371328
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者張文彬, 哈斯蘇榮 申請(qǐng)人:張文彬
網(wǎng)友詢問(wèn)留言 已有0條留言
  • 還沒(méi)有人留言評(píng)論。精彩留言會(huì)獲得點(diǎn)贊!
1
国产1区2区3区精品| 五月开心婷婷网| 18禁观看日本| 啦啦啦在线免费观看视频4| 日韩有码中文字幕| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 十分钟在线观看高清视频www| 高清毛片免费观看视频网站 | 91成人精品电影| 少妇 在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产男女内射视频| 久久久久久久久久久久大奶| a级片在线免费高清观看视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 热re99久久国产66热| 亚洲情色 制服丝袜| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 精品视频人人做人人爽| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜福利视频精品| 欧美一级毛片孕妇| 成人手机av| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 午夜福利乱码中文字幕| 久久久久久人人人人人| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| av国产精品久久久久影院| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成+人综合+亚洲专区| 大片电影免费在线观看免费| 大香蕉久久成人网| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产xxxxx性猛交| 97人妻天天添夜夜摸| 人人澡人人妻人| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 宅男免费午夜| 国产在线观看jvid| 国产日韩欧美视频二区| 99国产精品99久久久久| 久久久精品94久久精品| 国产麻豆69| 国产av一区二区精品久久| 美女福利国产在线| 免费不卡黄色视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲精品美女久久av网站| 欧美精品高潮呻吟av久久| 久久久精品区二区三区| 午夜福利影视在线免费观看| 精品一区二区三区av网在线观看 | 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲人成伊人成综合网2020| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲一码二码三码区别大吗| 天堂动漫精品| 亚洲国产看品久久| 亚洲专区中文字幕在线| 757午夜福利合集在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 人妻久久中文字幕网| 午夜老司机福利片| av福利片在线| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美在线黄色| 自线自在国产av| 热99国产精品久久久久久7| 窝窝影院91人妻| 2018国产大陆天天弄谢| 欧美一级毛片孕妇| 99热国产这里只有精品6| 亚洲黑人精品在线| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产福利在线免费观看视频| 天天操日日干夜夜撸| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲av美国av| 两个人免费观看高清视频| av在线播放免费不卡| 12—13女人毛片做爰片一| 欧美亚洲日本最大视频资源| 精品亚洲成国产av| 国产日韩欧美在线精品| 日本精品一区二区三区蜜桃| 亚洲美女黄片视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 757午夜福利合集在线观看| 女性被躁到高潮视频| 美女福利国产在线| 视频区图区小说| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产精品98久久久久久宅男小说| 亚洲五月色婷婷综合| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 久久久久久久久免费视频了| 午夜久久久在线观看| 高清av免费在线| 一区二区av电影网| 久久九九热精品免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产有黄有色有爽视频| 久久中文字幕一级| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美黑人欧美精品刺激| 18禁国产床啪视频网站| 国产av又大| 一级,二级,三级黄色视频| 男女之事视频高清在线观看| 俄罗斯特黄特色一大片| 国产午夜精品久久久久久| 人妻一区二区av| 日本欧美视频一区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 12—13女人毛片做爰片一| 纯流量卡能插随身wifi吗| 国产精品久久久久久精品古装| 美女国产高潮福利片在线看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 色播在线永久视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 日本av手机在线免费观看| 天堂8中文在线网| 91老司机精品| 制服人妻中文乱码| av一本久久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美另类亚洲清纯唯美| 成人三级做爰电影| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产97色在线日韩免费| 十分钟在线观看高清视频www| 桃花免费在线播放| 国产成人免费观看mmmm| 性少妇av在线| 十分钟在线观看高清视频www| 国产成人欧美在线观看 | 久久亚洲真实| 交换朋友夫妻互换小说| 久久亚洲真实| 中国美女看黄片| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲av国产av综合av卡| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 黄片大片在线免费观看| 91国产中文字幕| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美日韩视频精品一区| 国产黄频视频在线观看| 后天国语完整版免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产色视频综合| 成人黄色视频免费在线看| 免费观看a级毛片全部| 香蕉国产在线看| 最黄视频免费看| 一进一出抽搐动态| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产成人啪精品午夜网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲avbb在线观看| 狂野欧美激情性xxxx| 成年女人毛片免费观看观看9 | 大型av网站在线播放| 天堂中文最新版在线下载| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 老司机影院毛片| 亚洲性夜色夜夜综合| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 男女之事视频高清在线观看| 欧美在线一区亚洲| 中文欧美无线码| av福利片在线| 国产区一区二久久| 午夜激情久久久久久久| 国产高清videossex| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 欧美午夜高清在线| 午夜福利免费观看在线| 久久中文字幕一级| 精品福利永久在线观看| 麻豆av在线久日| tocl精华| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲国产欧美网| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 另类精品久久| 新久久久久国产一级毛片| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 少妇被粗大的猛进出69影院| 老汉色av国产亚洲站长工具| 夜夜爽天天搞| 久久久久国内视频| 成年人黄色毛片网站| 另类亚洲欧美激情| 国产精品国产av在线观看| 露出奶头的视频| 亚洲av日韩在线播放| 69av精品久久久久久 | 真人做人爱边吃奶动态| 超碰成人久久| 超碰97精品在线观看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜福利欧美成人| 黄片小视频在线播放| 一个人免费在线观看的高清视频| 午夜福利在线免费观看网站| 丝袜美腿诱惑在线| 热99久久久久精品小说推荐| 热99久久久久精品小说推荐| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 蜜桃在线观看..| 性高湖久久久久久久久免费观看| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲人成电影免费在线| 精品欧美一区二区三区在线| 国产高清国产精品国产三级| 午夜福利视频精品| 亚洲专区国产一区二区| 久久久久久久大尺度免费视频| 无遮挡黄片免费观看| 久久毛片免费看一区二区三区| av有码第一页| 超色免费av| 国产麻豆69| 男女高潮啪啪啪动态图| 日日夜夜操网爽| 不卡av一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 国产又爽黄色视频| 久久久欧美国产精品| 午夜福利免费观看在线| 人成视频在线观看免费观看| 国产黄频视频在线观看| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产亚洲一区二区精品| 97在线人人人人妻| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人精品无人区| 交换朋友夫妻互换小说| 亚洲人成电影免费在线| 精品久久久久久电影网| 久久ye,这里只有精品| 精品国产国语对白av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 欧美+亚洲+日韩+国产| av欧美777| 成人免费观看视频高清| 亚洲天堂av无毛| 欧美大码av| 一本大道久久a久久精品| 麻豆成人av在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 国产午夜精品久久久久久| 满18在线观看网站| 女警被强在线播放| 成人18禁在线播放| 91精品国产国语对白视频| 欧美性长视频在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 国产伦理片在线播放av一区| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产欧美日韩综合在线一区二区| www.熟女人妻精品国产| netflix在线观看网站| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 波多野结衣av一区二区av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产av新网站| 91大片在线观看| 国产精品熟女久久久久浪| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲av日韩在线播放| 热99re8久久精品国产| 91老司机精品| 黄色视频在线播放观看不卡| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 国产区一区二久久| 国精品久久久久久国模美| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 丝袜喷水一区| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久香蕉激情| 最近最新中文字幕大全电影3 | 搡老岳熟女国产| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲天堂av无毛| av一本久久久久| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 日韩免费av在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 99热国产这里只有精品6| 黄色丝袜av网址大全| 欧美人与性动交α欧美软件| 午夜两性在线视频| 精品一品国产午夜福利视频| 91av网站免费观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产成人av激情在线播放| 国产亚洲一区二区精品| 在线观看免费视频网站a站| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲国产av影院在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 999精品在线视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 嫁个100分男人电影在线观看| av网站在线播放免费| 欧美人与性动交α欧美软件| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 人妻一区二区av| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 国产亚洲精品一区二区www | 妹子高潮喷水视频| 久久毛片免费看一区二区三区| 麻豆av在线久日| 国产亚洲欧美精品永久| 精品久久久精品久久久| 亚洲伊人色综图| 久久久国产精品麻豆| 在线观看免费午夜福利视频| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 日韩视频在线欧美| 国产亚洲精品久久久久5区| 国产97色在线日韩免费| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲 国产 在线| 国产精品.久久久| 国产国语露脸激情在线看| 黄色毛片三级朝国网站| 丝袜在线中文字幕| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲天堂av无毛| 久久ye,这里只有精品| 亚洲五月色婷婷综合| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品 国内视频| 国产精品 欧美亚洲| 欧美成人午夜精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 黄频高清免费视频| av又黄又爽大尺度在线免费看| 欧美性长视频在线观看| 搡老岳熟女国产| av网站免费在线观看视频| 亚洲avbb在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 一级片免费观看大全| 欧美中文综合在线视频| 精品福利观看| 黄片小视频在线播放| 久久九九热精品免费| 91精品国产国语对白视频| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 午夜福利免费观看在线| 操出白浆在线播放| 色综合婷婷激情| 亚洲少妇的诱惑av| 欧美在线一区亚洲| 美女扒开内裤让男人捅视频| av免费在线观看网站| 18禁国产床啪视频网站| 国产精品成人在线| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产片内射在线| 妹子高潮喷水视频| 黄色视频不卡| 精品熟女少妇八av免费久了| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜免费成人在线视频| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 婷婷丁香在线五月| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩精品免费视频一区二区三区| av网站免费在线观看视频| 国产高清国产精品国产三级| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久水蜜桃国产精品网| 人人妻人人澡人人看| 欧美乱码精品一区二区三区| 波多野结衣av一区二区av| 交换朋友夫妻互换小说| 久久ye,这里只有精品| 国产一区二区三区视频了| 国产三级黄色录像| 亚洲免费av在线视频| 美女国产高潮福利片在线看| 一进一出好大好爽视频| 久久香蕉激情| 高清欧美精品videossex| av欧美777| 久久午夜亚洲精品久久| 大片免费播放器 马上看| 天天影视国产精品| 中国美女看黄片| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲美女黄片视频| 一级,二级,三级黄色视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 欧美+亚洲+日韩+国产| 老鸭窝网址在线观看| 99国产精品一区二区三区| 五月开心婷婷网| 美女扒开内裤让男人捅视频| 亚洲成人免费av在线播放| 69精品国产乱码久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 大型av网站在线播放| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品国产乱码久久久久久男人| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 一级毛片电影观看| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 少妇的丰满在线观看| 精品亚洲成国产av| 天天操日日干夜夜撸| 91老司机精品| 女人久久www免费人成看片| 制服人妻中文乱码| 在线观看一区二区三区激情| 国产区一区二久久| av天堂在线播放| 最黄视频免费看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 欧美精品一区二区大全| 中文字幕精品免费在线观看视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 黄色视频不卡| 中文字幕最新亚洲高清| 91成人精品电影| 最黄视频免费看| 三上悠亚av全集在线观看| 久久免费观看电影| 欧美精品亚洲一区二区| 夜夜爽天天搞| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产亚洲精品一区二区www | 久久久久久免费高清国产稀缺| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品av久久久久免费| 高清在线国产一区| 韩国精品一区二区三区| 一级片免费观看大全| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲av美国av| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲中文字幕日韩| 黄色视频,在线免费观看| 丰满迷人的少妇在线观看| videos熟女内射| 青草久久国产| 老司机在亚洲福利影院| 日本黄色日本黄色录像| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 欧美亚洲日本最大视频资源| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久人妻av系列| 一个人免费看片子| 久久99一区二区三区| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 三级毛片av免费| 国产精品久久久久久精品电影小说| 视频区欧美日本亚洲| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 在线观看免费日韩欧美大片| 欧美日韩精品网址| 成在线人永久免费视频| 国产精品一区二区免费欧美| 久久狼人影院| 性少妇av在线| 三上悠亚av全集在线观看| 1024视频免费在线观看| 99国产精品99久久久久| 久久精品国产亚洲av香蕉五月 | 一级片免费观看大全| 色播在线永久视频| 亚洲精品一二三| 国产亚洲欧美精品永久| 自线自在国产av| 嫁个100分男人电影在线观看| www日本在线高清视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 高清av免费在线| 国产野战对白在线观看| 日韩有码中文字幕| 国产精品亚洲一级av第二区| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产精品久久久久久精品电影小说| 90打野战视频偷拍视频| 色视频在线一区二区三区| 久热这里只有精品99| 老司机午夜福利在线观看视频 | 在线永久观看黄色视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 婷婷成人精品国产| 高清黄色对白视频在线免费看| 99久久99久久久精品蜜桃| www.999成人在线观看| 大码成人一级视频| www.自偷自拍.com| 欧美成狂野欧美在线观看| 欧美成人午夜精品| 夜夜爽天天搞| 超碰成人久久| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 黄片播放在线免费| 久久天堂一区二区三区四区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产又爽黄色视频| 女人精品久久久久毛片| 自线自在国产av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久久久久免费高清国产稀缺| a级毛片在线看网站| 久久久久网色| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲午夜理论影院| 人妻一区二区av| 亚洲国产av影院在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 久久九九热精品免费| 国产精品亚洲一级av第二区| 夜夜爽天天搞| 美女国产高潮福利片在线看| 男女之事视频高清在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 大陆偷拍与自拍| 欧美乱码精品一区二区三区| 国产精品一区二区在线观看99| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲,欧美精品.| av一本久久久久| av视频免费观看在线观看| √禁漫天堂资源中文www| 美女午夜性视频免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| av不卡在线播放| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 精品国产国语对白av| 一个人免费在线观看的高清视频| 丝袜美足系列| 午夜福利在线免费观看网站| netflix在线观看网站| 俄罗斯特黄特色一大片| 欧美乱码精品一区二区三区| 大陆偷拍与自拍| av电影中文网址| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 麻豆成人av在线观看| 黄片大片在线免费观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 91国产中文字幕| 欧美精品一区二区大全| 国产亚洲一区二区精品| 免费在线观看黄色视频的| 丁香欧美五月| 久久影院123| 午夜福利免费观看在线| 超碰成人久久| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久久久视频综合| kizo精华| 午夜福利视频精品| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美久久黑人一区二区| videosex国产| 手机成人av网站| 日本av免费视频播放| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲欧洲日产国产| 欧美日本中文国产一区发布| 又黄又粗又硬又大视频| 国产成人影院久久av| 老熟女久久久|