專利名稱:雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法
雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法所屬技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域,特別是涉及一種在雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法。
背景技術(shù):
褪黑素(melatonin,MT)是由動(dòng)物腦部的松果體細(xì)胞在暗環(huán)境下所分泌的吲哚類激素,其化學(xué)名稱為N-乙酰-5-甲氧基色胺。它的生理功能是由褪黑素受體(melatonin acceptor,MTR)介導(dǎo)的,松果體是生物鐘的重要組成部分,通過(guò)分泌褪黑素的節(jié)律性改變來(lái)影響許多組織、腺體的代謝功能。因此,研究褪黑素及其受體作用機(jī)制、作用靶器官等對(duì)于揭示、提高和調(diào)控動(dòng)物許多生理機(jī)能具有重要的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值。研究發(fā)現(xiàn),MTR是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)并與醫(yī)學(xué)有著重要的關(guān)系。主要存在于腸組織上。MTR與MT特異性結(jié)合,通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。MT可影響哺乳動(dòng)物次級(jí)毛囊和毛絨生長(zhǎng),能夠刺激體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物次級(jí)毛囊纖維生長(zhǎng),可調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)發(fā)育和功能,同時(shí)可以誘導(dǎo)皮毛提如成熟,提聞毛續(xù)廣量。
褪黑素受體的研究,在2008年,李子海等人研究了褪黑素對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)的影響就, 表明不同濃度的褪黑素對(duì)毛發(fā)生長(zhǎng)和毛發(fā)顏色的影響不同。2011年,陳建波等人就褪黑素受體對(duì)絨山羊絨毛生長(zhǎng)的影響及其作用機(jī)理作了研究,結(jié)果表明褪黑激素對(duì)絨山羊絨毛生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用,褪黑激素是通過(guò)影響類胰島素生長(zhǎng)因子或催乳素的分泌間接影響絨毛生長(zhǎng);是通過(guò)調(diào)控皮膚組織中脫碘酶基因表達(dá)或者改變皮膚中催乳素受體基因可變剪接規(guī)律影響絨毛生長(zhǎng)。
在雙峰駝中,褪黑素受體具有廣泛的生物學(xué)功能,尤其對(duì)動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)周期、換毛等其它生物節(jié)律和免疫活動(dòng)等都具有重要的調(diào)節(jié)作用。因此,對(duì)駱駝褪黑素受體的研究將有助于細(xì)胞生物學(xué)和醫(yī)學(xué)的發(fā)展。發(fā)明內(nèi)容
一種雙峰駝褪黑素受體,其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示
(a) SEQ ID NO. 2 所示序列;
(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或/和疊加一個(gè)或多個(gè)氨基酸衍生得到的,且與(a)編碼蛋白質(zhì)具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
一種雙峰駝褪黑素受體編碼基因,該序列是與毛囊發(fā)育和毛色形成密切相關(guān)的基因,其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示
(a) SEQ ID NO.1 所示序列;
(b)由堿基簡(jiǎn)并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性,且與 (a)編碼相同功能蛋白質(zhì)的序列。
本發(fā)明還提供了一種雙峰駝褪黑素受體基因的克隆和測(cè)序方法,該方法包括步驟(I)組織分離(Isolation) ; (2)總 RNA 的分離(Total RNA isolation)包括①提取 RNA 的準(zhǔn)備工作組織總RNA提取組織總RNA的鑒定。(3)全長(zhǎng)cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括①引物設(shè)計(jì)及合成RT-PCR擴(kuò)增;③克隆和測(cè)序,其特征在于 PCR引物的正向引物為SEQ ID NO. 3和反向引物為SEQ ID NO. 4,其序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’
SEQ ID NO. 4 01igo dT ;
上述從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA為將雙峰駝耳部組織放入裝有Trizol 的勻漿器管中勻漿,離心分離,吸取上清液,在15-30°C溫育5分鐘,加氯仿,劇烈震蕩,繼續(xù)在15-30°C溫育2-3分鐘,再次離心分離,吸取上清液,加異丙醇混合均勻,然后15-30°C溫育10分鐘,離心分離,所得沉淀物加75%乙醇洗滌,離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。分離提取后的總RNA用分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量和用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量。
上述反轉(zhuǎn)錄PCR按照大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
上述克隆和測(cè)序包括PCR擴(kuò)增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)、質(zhì)粒的回收、質(zhì)粒的酶切鑒定和重組質(zhì)粒的測(cè)序。
上述PCR擴(kuò)增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進(jìn)行。
上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。
上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化為將感受態(tài)細(xì)胞加入到回收片段同T載體的連接產(chǎn)物中,冰浴 30分鐘,然后在42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘,立即置入冰浴中2分鐘,加液體LB培養(yǎng)基,37°C 復(fù)活50分鐘,后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上,37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
上述轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)為挑選轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落,放入到加有PCR反應(yīng)液的EP管中晃動(dòng),使單菌落充當(dāng)模板;用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物同 Marker 一起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,鑒別T載體上是否含有目的片段;若得到目的片段,可挑取在LB平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落,放入含有的青霉素鈉LB液體培養(yǎng)基中,37°C過(guò)夜搖菌培養(yǎng),用于質(zhì)?;厥铡?br>
上述質(zhì)粒的回收用上海華舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒實(shí)現(xiàn)。
上述質(zhì)粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定,選擇內(nèi)切酶Bam H I和Hin d III。
本發(fā)明在提供了雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列和蛋白編碼序列基礎(chǔ)上;將人、鼠、牛等不同物種褪黑素受體基因的CDS序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較;對(duì)包括雙峰駝在內(nèi)的8個(gè)物種的八個(gè)褪黑素受體基因的CDS序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明中的雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列是通過(guò)以雙峰駝耳部組織中總 RNA為模板,參考人、鼠、牛等物種的褪黑素受體基因的同源序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO.1。將雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見(jiàn) SEQ ID NO. 2。
在SEQ ID NO.1中,RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為1140bp,電泳結(jié)果見(jiàn)附圖1,其中19-21位為起始密碼子ATG,1105-1107位為終止密碼子TAA,19-1107位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域(OTS)。 在SEQ ID NO.1,雙峰駝褪黑素受體基因編碼362個(gè)氨基酸。雙峰駝與褐家鼠(AAG18471.1) 的褪黑素受體核酸序列具有94%的相似性。雙峰駝和人、鼠、牛等動(dòng)物用Clustal X中對(duì)齊的褪黑素受體基因編碼氨基酸序列同源性比較結(jié)果見(jiàn)附圖2。
對(duì)包括SEQ ID NO.1在內(nèi)的8個(gè)物種的八條褪黑素受體基因的⑶S序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙峰駝褪黑素受體同褐家鼠的進(jìn)化距離最近,間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
本發(fā)明所得到的褪黑素受體蛋白的基因序列和該蛋白結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)可用于研究其在黑素合成的下游途徑中的重要作用,為闡明雙峰駝絨毛生長(zhǎng)機(jī)理和未來(lái)產(chǎn)生人為控制絨毛產(chǎn)量提供理論基礎(chǔ)和依據(jù),并能夠?yàn)槠渌溉閯?dòng)物的絨毛生長(zhǎng)機(jī)理研究奠定一定的生物學(xué)基礎(chǔ)。
圖1為雙峰駝褪黑素受體基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖2為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)所用褪黑素受體氨基酸同源性比較;
圖3為不同物種褪黑素受體氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。
具體實(shí)施方式
下面實(shí)施例用于對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明,但不用來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1:雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列的克隆
1、組織分離(Isolation)
從內(nèi)蒙古阿拉善盟雙峰駝,快速采得樣品,將耳部組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70°C保存,拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
2、總 RNA 的分離(Total RNA isolation)
(I)提取RNA的準(zhǔn)備工作
玻璃制品用0.1M的NaOH浸泡過(guò)夜,用自來(lái)水反復(fù)沖洗,再用蒸餾水沖洗2遍, 180°C烘烤4小時(shí)。
勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20-30分鐘,再用0.1 %的DEPC水沖洗。由于未滅活的DEPC對(duì)PCR反應(yīng)有影響,可用0. 5%的SDS處理。
Tip頭、EP管用0.1 %的DEPC水浸泡過(guò)夜,高壓滅菌使DEPC失活。
雙蒸水和溶液用DEPC處理,即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液,室溫放置過(guò)夜, 高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
(2)組織總RNA提取
取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有 Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL,USA)的勻漿器管中勻漿。4°C 12000rpm離心10分鐘。吸取上清液,15_30°C溫育5分鐘。 加0. 2ml氯仿,蓋上蓋子,用手劇烈震蕩15秒。15-30°C溫育2-3分鐘。4°C 12000rpm離心 15分鐘。吸取上清液,加0. 8ml異丙醇,混合均勻。15-30°C溫育10分鐘,4°C 12000rpm離心 10分鐘,離心管底部白色沉淀即為RNA。倒掉上清,加Iml 75%乙醇洗滌RNA,4°C 7500rpm 離心10分鐘。自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝,_70°C保存。
(3)組織總RNA的鑒定
通過(guò)分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量并且用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質(zhì)量,具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4_5小時(shí),再用DEPC處理過(guò)的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入I X TBE待用。瓊脂糖凝膠用IXTBE配制。在IOul上樣緩沖液 (2XTBE,13%菲可,O. 1%溴酚蘭,7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA,65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2-3分鐘。點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
3、全長(zhǎng) cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)
(I)引物設(shè)計(jì)及合成
根據(jù)GenBanK發(fā)表的綿羊(ACF74448.1)、褐家鼠(AAG18471.1)等物種的褪黑素受體基因mRNA序列ORF側(cè)翼同源序列,設(shè)計(jì)如下引物用于以雙峰駝褪黑素受體cDNA為模版的PCR擴(kuò)增,以獲得雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列。引物用Primer Premier5. O自行設(shè)計(jì),由上海桑尼生物科技有限公司合成,該引物對(duì)的核苷酸序列分別為SEQ ID N0:3(正向)和SEQ ID NO :4(反向),序列信息如下
SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’
SEQ ID Ν0·4(反向)01igo dT
(2) RT-PCR 擴(kuò)增
按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成10ul2XBca 1st Buffer,4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixture,0. 5ul Rnase Inhibitor(40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul),Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20,總體系為 20ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65°C I 分鐘,30°C 5 分鐘(15分鐘-30分鐘內(nèi)勻速升溫),65°C 25分鐘,98°C 5分鐘,5°C 5分鐘。PCR擴(kuò)增條件 97°C變性5分鐘;95°C 30秒一55V 30秒一72V I分鐘,如此進(jìn)行30次循環(huán);72°C延伸10 分鐘,4 °C保存。
(3)克隆和測(cè)序
PCR擴(kuò)增片段的回收。片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行,操作過(guò)程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊,放入1. 5mlEP管中。按每IOOmg瓊脂糖加入 300ulSl液的比例加SI液,50°C水浴10分鐘。將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱,IOOOOrpm離心I分鐘,倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液,IOOOOrpm離心15秒,倒掉管中液體。在吸附柱中加入500ul Wl液,靜置I分鐘后,IOOOOrpm離心15秒,倒掉管中液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中,在吸附膜中央加入30ulTl液,靜置I 分鐘后,IOOOOrpm離心I分鐘,EP管中液體即為回收的DNA。
回收片段同T載體的連接。連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒,操作過(guò)程如下在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液pMD18-T Vector (50ng/ul) 0. 5ul,DNA20-40ng, Solution I 5ul,加dH20至10ul。將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過(guò)夜也可以),產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。從_70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞,冰浴助溶。IOOul感受態(tài)細(xì)胞加入IOul連接產(chǎn)物,冰浴30分鐘。42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘,立即置入冰浴中2分鐘。加 400ul液體LB培養(yǎng)基,37°C復(fù)活50分鐘。取IOOul鋪于LB平板上,平板含0.1 % (V/V)的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml)。37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)。用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落,用滅菌的牙簽蘸取單菌落。將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板,是指引物、DNA聚合酶、dNTP、緩沖液及水加上剛才的單菌落就成了 PCR反應(yīng)體系)的EP管中晃動(dòng),使單菌落充當(dāng)模板。用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物同Marker —起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,鑒別T載體上是否含有目的片段。若得到目的片段,可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落, 放入40ml LB液體培養(yǎng)基中,先在液體中加入O.1 % (V/V)的青霉素鈉(100mg/ml),37°C過(guò)夜搖菌培養(yǎng),用于質(zhì)?;厥铡?br>
質(zhì)粒的回收。質(zhì)粒回收用上海華舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒,操作步驟如下將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1. 5mlEP管中,4000rpm離心,倒掉液體獲細(xì)菌沉淀。細(xì)菌沉淀不夠時(shí)可再加一次菌液離心。在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液,振蕩懸浮。加入250ulP2液,溫和搖勻,室溫靜置4分鐘。加入350ulP3液,溫和搖勻。離心10分鐘,將上清液小心移入吸附柱,離心15秒,倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl,離心15秒,倒掉液體。在吸附柱中加入500ulWl,靜置I分鐘,離心15秒,倒掉液體。離心I分鐘。將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中,在吸附膜中央加入25-30ulTl液,靜置I分鐘后,離心I分鐘.EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。
質(zhì)粒的酶切鑒定。為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒,采用雙酶切法鑒定.本研究具體操作如下根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖,選擇內(nèi)切酶Bam H I和 Hin d II1.保證目的片段中無(wú)這兩種酶的切點(diǎn)。組成如下酶切反應(yīng)體系Bam H I lul,Hin d III lul, IOXK Buffer 2ul,DNA 彡 lul,加 dH20 至 20ul。30°C反應(yīng) 3 小時(shí)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
重組質(zhì)粒的測(cè)序。取20ul重組質(zhì)粒于EP管中,封口膜密封,交生物技術(shù)公司測(cè)序。
實(shí)施例2 :雙峰駝褪黑素受體基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建
1、雙峰駝褪黑素受體基因編碼序列同源性比較
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等七種動(dòng)物的褪黑素受體基因編碼蛋白序列, 將其同克隆測(cè)序獲得的本發(fā)明獲得的SEQ ID NO.1序列一起,在分子生物學(xué)軟件MEGA4上進(jìn)行序列同源性比較(見(jiàn)附圖2)。比較結(jié)果顯示SEQ ID NO. 2序列與褐家鼠的褪黑素受體氨基酸序列同源性為94. 00%。
2、褪黑素受體基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)構(gòu)建
在GenBank上搜索并獲得人、鼠、牛等七種物種的7條褪黑素受體基因的編碼蛋白序列,加上本發(fā)明獲得的SEQ ID NO. 2序列,利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù) (見(jiàn)附圖3)。結(jié)果顯示雙峰駝褪黑素受體基因同褐家鼠的親緣關(guān)系最近;間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
序列表
<110>內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
〈120〉雙峰駝褪黑素受體的蛋白編碼序列
<160>4
<170>PatentIn version3. 3
<210>1
<211>1140
<212>DNA
〈213〉阿拉善盟雙峰駝
<400>權(quán)利要求
1.一種雙峰駝褪黑素受體,其氨基酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO. 2 所示序列;(b)在(a)限定的氨基酸序列中經(jīng)過(guò)取代、缺失或/和疊加一個(gè)或多個(gè)氨基酸衍生得到的,且與(a)編碼蛋白質(zhì)具有相同功能的保守性變異多肽、活性片段或活性衍生物的氨基酸序列。
2.一種雙峰駝褪黑素受體編碼基因,其核苷酸序列如下述(a)或(b)所示(a)SEQ ID NO.1 所示序列;(b)由堿基簡(jiǎn)并或/和替代衍生的與(a)所述核苷酸序列90%以上同源性,且與(a)編碼相同功能蛋白質(zhì)的序列。
3.—種雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,該方法包括如下步驟(1)從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA;(2)根據(jù)人、鼠及牛不同物種的褪黑素受體基因的同源序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR,其中引物的正向引物為 SEQ ID NO. 3 :5’ -ATGTGGGAATTTGGGACCAGT-3’反向引物為 SEQ ID NO. 4 =Oligo dT ;(3)克隆和測(cè)序。
4.按照權(quán)利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于從雙峰駝耳部組織中分離提取總RNA為將雙峰駝耳部組織放入裝有Trizol的勻漿器管中勻漿,離心分離,吸取上清液,在15-30°C溫育5分鐘,加氯仿,劇烈震蕩,繼續(xù)在15-30°C溫育2_3分鐘,再次離心分離,吸取上清液,加異丙醇混合均勻,然后15-30°C溫育10分鐘,離心分離,所得沉淀物加75%乙醇洗滌,離心分離后自然干燥或真空干燥得到總RNA。
5.按照權(quán)利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于分離提取后的總RNA用分光光度計(jì)測(cè)定RNA含量和用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量。
6.按照權(quán)利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述反轉(zhuǎn)錄PCR按照大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
7.按照權(quán)利要求3所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述克隆和測(cè)序包括PCR擴(kuò)增片段的回收、回收片段同T載體的連接、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)、質(zhì)粒的回收、質(zhì)粒的酶切鑒定和重組質(zhì)粒的測(cè)序。
8.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述PCR擴(kuò)增片段的回收按照上海華舜小量膠回收試劑盒的要求進(jìn)行。
9.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述回收片段同T載體的連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒。
10.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化為將感受態(tài)細(xì)胞加入到回收片段同T載體的連接產(chǎn)物中,冰浴30分鐘,然后在42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘,立即置入冰浴中2分鐘,加液體LB培養(yǎng)基,37°C復(fù)活50分鐘,后涂布于含有氨芐青霉的LB平板上,37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
11.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)為挑選轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落,放入到加有PCR反應(yīng)液的EP管中晃動(dòng),使單菌落充當(dāng)模板;用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物同Marker —起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,鑒別T載體上是否含有目的片段;若得到目的片段,可挑取在LB平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落,放入含有的青霉素鈉LB液體培養(yǎng)基中,37°C過(guò)夜搖菌培養(yǎng),用于質(zhì)粒回收。
12.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述質(zhì)粒的回收用上海華舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒實(shí)現(xiàn)。
13.按照權(quán)利要求7所述的雙峰駝褪黑素受體編碼基因的獲取方法,其特征在于上述質(zhì)粒的酶切鑒定采用雙酶切法鑒定,選擇內(nèi)切酶Bam H I和Hin d III。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在雙峰駝褪黑素受體、編碼基因及其獲取方法,本發(fā)明中的雙峰駝褪黑素受體基因的cDNA序列是通過(guò)以雙峰駝組織中總RNA為模板,參考人、鼠、牛等物種的褪黑素受體基因的同源序列設(shè)計(jì)引物,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列見(jiàn)SEQ ID NO.1。將雙峰駝褪黑素受體基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見(jiàn)SEQ ID NO.2。本發(fā)明通過(guò)對(duì)包括SEQ ID NO.1在內(nèi)的8個(gè)物種的八條褪黑素受體基因的CDS序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙峰駝褪黑素受體同褐家鼠的進(jìn)化距離最近,間接證明了所得到的序列確為雙峰駝褪黑素受體基因。
文檔編號(hào)C07K14/72GK102993295SQ201210371328
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者張文彬, 哈斯蘇榮 申請(qǐng)人:張文彬