專利名稱：芋螺毒素多肽Eb1.6的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種芋螺毒素多肽Ebl. 6的制備方法。
背景技術(shù)：
芋螺屬腹足綱軟體動(dòng)物，全世界約有500余種，遍布世界各暖海區(qū)，我國有芋螺100多種，主要分布在西沙群島、海南島及臺(tái)灣海域。芋螺多肽是由芋螺毒液管和毒囊內(nèi)壁的毒腺所分泌，每種芋螺的毒液中含50-200個(gè)活性多肽，不同品種芋螺所含的活性肽各不相同，即使同種芋螺因海域不同，其毒素成分也可存在差異，理論上估計(jì)約存在5萬多種不同活性的多肽(McIntosh JM, Jones RM. Toxicon，2001，39 :1447-1451. Xa-芋螺多肽(a -CTX)屬于芋螺多肽A超家族，特異作用于肌肉型或神經(jīng)元型nAChRs。絕大多數(shù)a -芋螺多肽含12-18個(gè)氨基酸、兩對(duì)二硫鍵(CCXmCXnC，連接方式為1_3，2_4)。根據(jù)m，n的數(shù)目不同，a -芋螺多肽細(xì)分為a 3/5，a 4/3，a 4/4，a 4/6，a 4/7亞家族。目前發(fā)現(xiàn)某些a -芋 螺多肽具有鎮(zhèn)痛活性，其中a -芋螺多肽Vcl. I (GCCSDPRCNYDHPEIC0NH2)是來自維多利亞芋螺(Conus Victoriae),由16個(gè)氨基酸組成,含兩對(duì)二硫鍵(二硫鍵的排列方式為1-3,2-4)(SandalI et al. Biochemistry, 2003,42 :6904-6911.)。研究表明 Vcl. I 在神經(jīng)性疼痛動(dòng)物模型中表現(xiàn)出了較好的鎮(zhèn)痛活性并具有加速損傷神經(jīng)恢復(fù)的作用(Satkunanathanet al. Brain Res.，2005，1059 :149_158)，2006年已進(jìn)入臨床研究階段。α-芋螺多肽作用的靶點(diǎn)與傳統(tǒng)鎮(zhèn)痛藥物的靶點(diǎn)不同，且不成癮，這對(duì)開發(fā)新一代鎮(zhèn)痛藥物具有重要意義。Ebl. 6 (GCCSNPACMLKNPNLC-NH2，序列I)來自中國南海西沙群島黑星芋螺，由-芋螺毒素信號(hào)肽保守序列克隆得到，其序列與已報(bào)道的α-芋螺毒素顯著不同。前期初步研究表明，該肽對(duì)大鼠神經(jīng)病理性疼痛模型具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用(劉珠果等.·型芋螺多肽及其應(yīng)用，中國發(fā)明專利申請(qǐng)?zhí)朲L201010121879. 7)。前期合成Ebl. 6采用儀器合成，縮合劑為N，N’ - 二環(huán)己基碳二酰亞胺(DCC)/I-羥基苯并三唑(HOBt)，偶合率高。但該方法不利于手工大量合成，因?yàn)榭s合劑DCC反應(yīng)后形成不溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)的N，N’ - 二環(huán)己基脲(D⑶)，給縮合反應(yīng)及樹脂洗滌帶來不便。另外，Ebl. 6線性肽折疊成目標(biāo)物質(zhì)采用C18柱反相吸附，乙腈洗脫,成本高。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種制備芋螺多肽Ebl. 6 (GCCSNPACMLKNPNLC-NH2)的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟I)采用縮合劑DIC/HOBt合成Ebl. 6線性肽；2)折疊Ebl. 6線性肽得到多肽粗品；3)純化所述多肽粗品；即得到芋螺多肽Ebl. 6。上述方法中，采用縮合劑DIC/HOBt合成Ebl. 6線性肽包括如下步驟先用Fmoc保護(hù)氨基酸、以Rink樹脂為固相載體、DIC/HOBt為縮合劑、哌啶為脫保護(hù)劑，從C端依次偶聯(lián)合成，得到肽樹脂；再將所述肽樹脂裂解得到Ebl. 6線性肽。其中，F(xiàn)moc保護(hù)氨基酸為 Fmoc-Cys(Trt) - OH> Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-0H、Fmoc-Lys (Boc) -0H> Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn (Trt) -OH、Fmoc-Pro-OH 和 Fmoc-Ser (tBu) -OH。上述合成Ebl. 6線性肽方法中，摸索選用了縮合劑苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)/HOBt/異丙基二乙胺(DIEA)，發(fā)現(xiàn)儀器與手工合成目標(biāo)肽均較雜，產(chǎn)率低。最后采用縮合劑DIC/H0BT，儀器合成與手工合成的效率均很高。上述合成Ebl. 6線性肽方法中，步驟I)中，所述Rink樹脂和每一個(gè)所述Fmoc保護(hù)氨基酸的摩爾比為1:4。上述方法中，折疊Ebl. 6線性肽按照包括如下步驟的方法進(jìn)行(a)將Ebl. 6線性肽在濃度為O. 1-0. 3M、pH值為8. 0-8. 4的緩沖液中折疊；所述緩沖液為碳酸氫銨緩沖液或醋酸銨緩沖液或Tris緩沖液；
(b)將經(jīng)步驟(a)得到的折疊產(chǎn)物經(jīng)AmberliteXAD16大孔吸附樹脂吸附后,用無水乙醇浸洗，收集浸洗產(chǎn)物，即得到多肽粗品。上述方法中，所述純化所述多肽粗品按照包括如下步驟的方法進(jìn)行將所述多肽粗品用C18反相HPLC柱純化，得到芋螺多肽Ebl. 6。上述步驟(a)中的緩沖液具體為濃度為O. 25M NH4Ac緩沖液、濃度為O. 2MNH4HC03緩沖液、濃度為O. IM NH4HCO3緩沖液或濃度為O. IM Tris-HCl緩沖液，pH值均為8. 0 8. 4。由于Ebl. 6線性肽含有4個(gè)半胱氨酸，分子內(nèi)折疊形成兩對(duì)二硫鍵的產(chǎn)物才具有活性，因此對(duì)折疊線性肽所需的緩沖溶液進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Ebl. 6在NH4HC03、NH4Ac或Tris緩沖體系緩沖液(ρΗ=8. (Γ8. 4)形成一個(gè)主要產(chǎn)物峰，而考慮到規(guī)模生產(chǎn)成本，且NH4HCO3折疊液價(jià)廉易得。因此，在本發(fā)明的實(shí)施例中采用的緩沖液為濃度為O. IM順4!10)3緩沖液，pH值具體為8.0。上述折疊時(shí)間為18h。在步驟(b)中，在所述收集浸洗產(chǎn)物步驟后，還包括如下步驟將所述浸洗產(chǎn)物旋蒸濃縮去除乙醇、凍干，得到多肽粗品。由于Ebl. 6線性肽溶解度低，給折疊后多肽的回收、純化帶來不便。文獻(xiàn)中多對(duì)二硫鍵多肽的折疊產(chǎn)物富集一般采用C18反相吸附，乙腈或甲醇洗脫，溶劑消耗量大，成本高(K. Sandra, et al. Anal. Bioanal. Chem.，2006，385:671-677)，因此，在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用AmberliteXAD16大孔吸附樹脂對(duì)Ebl. 6折疊產(chǎn)物進(jìn)行吸附，乙醇浸洗，浸洗液濃縮后可直接用C18柱純化；乙醇洗滌后的樹脂用水洗滌再生。此方法可實(shí)現(xiàn)緩沖體系及樹脂的反復(fù)循環(huán)使用，回收率較高，降低了成本。AmberliteXAD16大孔吸附樹脂也可以用其他離子交換大孔吸附樹脂替換。由上述的方法制備得到的芋螺多肽Ebl. 6也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明合成多肽Ebl. 6的過程中，首先采用縮合劑DIC/H0BT提高了手工合成線性肽的效率；再選取PH值為8. O、濃度為0. IM NH4HCO3緩沖液作為折疊緩沖液，不僅價(jià)廉易得，而且折疊率高；再將折疊得到的產(chǎn)物經(jīng)過AmberliteXAD 16大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附、乙醇浸洗，浸洗液濃縮后可直接用于后續(xù)的C18柱純化，同時(shí)乙醇洗滌后的樹脂用水洗滌再生，此步驟可實(shí)現(xiàn)緩沖體系及樹脂的反復(fù)循環(huán)使用，回收率較高，降低了成本；最后通過純化得到大量合成多肽。該多肽Ebl. 6的二硫鍵配對(duì)方式正確，且具有高的鎮(zhèn)痛活性。
圖I為不同縮合劑對(duì)Ebl. 6線性肽合成效率的影響圖2為折疊緩沖液對(duì)Ebl. 6線性肽折疊的影響圖3為Eb I· 6裂解后的HPLC分析4為Ebl.6折疊后的HPLC分析5為Ebl. 6反相高效液相色譜純化后HPLC分析6為Eb I· 6兩步折疊法測(cè)二硫鍵的HPLC分析7為靜脈注射不同劑量的Ebl. 6后2小時(shí)的鎮(zhèn)痛效果
圖8為靜脈注射不同劑量的Ebl. 6后4小時(shí)的鎮(zhèn)痛效果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例多肽Ebl. 6的氨基酸序列為序列表中的序列1，且C端酰胺化，
gccsnpacmlknpnlc-nh2 )。下述實(shí)施例中HPLC分析如無特殊說明，分析條件均如下KromasiI C18柱(4. 6mmX 250mm,北京分析儀器廠)，洗脫梯度0 Imin, 5 10%B ； I 25min, 10 50%B ；25 28min, 50 95%B ；A 為含 O. 1%TFA 的 H2O, B 為含 O. 1%TFA 的乙腈(ACNV1^OI lml/min。DIC化學(xué)名稱為N，N’ -異丙基碳二酰亞胺。實(shí)施例I、芋螺多肽Ebl. 6的規(guī)模制備一、芋螺多肽Ebl. 6規(guī)模制備的條件摸索I、不同縮合劑對(duì)Ebl. 6線性肽手工固相合成效率的影響Ebl. 6線性肽的前期合成采用儀器合成，在433A多肽合成儀(ABI美國應(yīng)用系統(tǒng)生物公司儀器)上進(jìn)行，使用Fmoc保護(hù)的氨基酸(上海吉爾生化有限公司)和取代率為
O.60mmol/g的Rink樹脂，縮合劑為DCC/HOBt。反應(yīng)體系中，樹脂與氨基酸的摩爾比為1: 5，每次合成O. Immol肽樹脂，偶合率高(圖1_A)。但該方法不利于手工大量合成，因?yàn)榭s合劑DCC反應(yīng)后形成不溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷(DCM)的N，N’ -二環(huán)己基脲(DCU )，給縮合反應(yīng)及樹脂洗滌帶來不便。因此進(jìn)一步摸索適于手工固相合成的縮合劑Ebl. 6線性肽合成的過程如下米用Fmoc 保護(hù)氨基酸(Fmoc-Cys (Trt) - OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH)、取代率為0. 60mmol/g的Rink樹脂、哌唳脫保護(hù)，縮合劑分別采用HBTU/HOBt/DIEA和DIC/HOBt ;樹脂與氨基酸的摩爾比為1:4，每次合成IOmmol。上述線性肽合成方法與后面實(shí)驗(yàn)二中步驟I的線性Ebl. 6線性肽的合成基本相同，不同的是合成量lOmmol，且采用的縮合劑分別為HBTU/HOBt/DIEA和DIC/HOBt，HPLC分析。結(jié)果縮合劑采用HBTU/HOBt/DIEA合成的目標(biāo)肽非常雜，目標(biāo)峰附近出現(xiàn)了兩個(gè)很大的雜峰(結(jié)果與圖IB無顯著差異)；縮合劑采用DIC/HOBt合成的目標(biāo)肽，目標(biāo)峰附近只有很小的雜質(zhì)峰(圖1D)。采用DIC/HOBt為縮合劑合成肽樹脂的粗產(chǎn)率為94. 6%，裂解后線性肽的粗產(chǎn)率為107. 8%，粗產(chǎn)率大于100%原因是粗肽中含有水、TFA、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)引起，線性肽純度約為63. 6%。為了排除手工合成與儀器合成可能差別采用DIC/HOBt、HBTU/HOBt/DIEA縮合劑進(jìn)行試驗(yàn)儀器合成，結(jié)果如圖IB和IC所示，IB為HBTU/HOBt/DIEA，IC為DIC/HOBt ;看出HBTU/HOBt/DIEA的效果仍很差，排除了手工合成與儀器合成可能差別。因此，采用縮合劑DIC/HOBt，儀器合成(圖1C)與手工合成(圖ID) (IOmmol)線性肽的效率均很高，目標(biāo)峰附近只有較少的雜質(zhì)峰，因此可以采用縮合劑DIC/HOBt手工合成得到的線性肽Ebl. 6。2、折疊緩沖液對(duì)Ebl. 6線性肽折疊的影響在pH=8. O 的 O. 25M NH4Ac、O. 2M NH4HCO3'O. IM NH4HCO3'O. IM Tris-HCl 緩 沖體系，分別加入線性肽Ebl. 6至肽濃度為O. 2mg/mL,室溫(25°C )攪拌18h進(jìn)行氧化折疊，HPLC分析。結(jié)果如圖2所示，為不同折疊緩沖液對(duì)Ebl. 6線性肽折疊的影響，A、B、C、D分別為在 ρΗ=8· O 的 0. 25Μ NH4Ac、0. 2M NH4HC03、0. IM NH4HCO3>0. IM Tris. HCl 緩沖體系中折疊的HPLC分析圖，發(fā)現(xiàn)Ebl. 6線性肽在上述緩沖體系中折疊效率均高。結(jié)合規(guī)模折疊時(shí)成本考慮，選用比較廉價(jià)易得的0. IM NH4HCOdt為緩沖體系。上述pH=8. O的0. IM NH4HCO3緩沖體系按照如下方法制備在20mL去離子水中加入0. 16g碳酸氫銨攪拌溶解，再用鹽酸調(diào)節(jié)pH=8. O即得20mL pH=8. O的0. IM NH4HCO3緩沖體系。二、芋螺多肽Ebl. 6的規(guī)模制備I、Ebl. 6線性肽的合成米用Fmoc 保護(hù)氨基酸(Fmoc-Cys (Trt) - OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys (Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Asn (Trt) -0H> Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser (tBu)-OH)、縮合劑DIC/HOBt、Rink樹脂、哌啶脫保護(hù)，自C端起依次偶聯(lián)合成，樹脂與每一個(gè)Fmoc保護(hù)氨基酸的摩爾比為1:4 ;具體合成方法以40mmol Ebl. 6線性肽手工固相合成步驟為例描述如下I)肽樹脂合成40mmol (66. 67g)取代率為O. 60mmol/g的Rink樹脂加入I升固相反應(yīng)腔，用250mL左右的二氯甲烷(DCM)浸泡3h ;用20%哌啶/DMF分別脫保護(hù)兩次(10min、30min)；依次用200mL的DMF、甲醇(MeOH)、DCM、DMF、DCM、DMF (3次)洗滌5min ;然后加入活化的Fmoc-Cys (Trt) -OH (160mmol,93. 712g)(溶于 300ml NMP，加入 DIC (108mmol,26. 28mL,
I.05eq)/H0Bt (176mmol，23. 7812g，I. I eq)，在冰浴下活化 lh)，振蕩(220r/min) 6h ;茚三酮檢測(cè)陰性后，用約200mL的DMF，DCM, DMF, DCM, DMF (2次)洗滌5min，即完成了第一個(gè)氨基酸Cys的連接。然后按上述方法及多肽序列依次連接剩余氨基酸，縮合時(shí)間24小時(shí)，縮合后均進(jìn)行茚三酮檢測(cè)，若樹脂呈藍(lán)色，需進(jìn)行封閉操作。封閉液為乙酸酐(20mmol，30.25mL，8. 0eq)/340mmol DIEA(320mmol，58. 2mL,8. 5eq)/NMP (約250mL)，25°C振蕩lh，洗滌順序同上。最后一個(gè)氨基酸Gly連接完畢后，用20% 哌啶 /DMF 脫除 Fmoc 基兩次(10min、30min)，再用 250ml 的 DMF，MeOH, DCM, DMF，DCM,DMF, DCM (3次)依次洗滌，抽干。晾干后得肽樹脂199. 3g，粗產(chǎn)率為94. 6%，合成量為40mmol。
2)肽樹脂的裂解199. 3g 肽樹脂的裂解加入 99. 7mL I, 2_ 乙二硫醇(EDT)/39. 8mL H20,39. 8mL 三異丙基硅烷(TIS) /1773. 8mL三氟乙酸(TFA)裂解3h，減壓蒸除TFA等裂解液，加入冷卻的無水乙醚約5L攪拌，靜置Ih后，抽濾，無水乙醚洗滌三次，晾干，得線性多肽Ebl. 6粗品72g。裂解后線性多肽Ebl. 6粗品的HPLC分析，結(jié)果如圖3所示，得到線性多肽Ebl. 6粗品。2、規(guī)模氧化折疊I)氧化折疊40L不銹鋼桶中加入36L O. IM NH4HCO3緩沖液(pH=8)，機(jī)械攪拌下加入8克由I得到的線性多肽Ebl. 6粗品，折疊(攪拌)18小時(shí)，折疊產(chǎn)物(折疊液)HPLC分析。結(jié)果如圖4所示，可看到為一主要目標(biāo)峰。 2)折疊產(chǎn)物富集向折疊產(chǎn)物中加入400克AmberliteXAD16大孔吸附樹脂(北京慧德昌科技有限責(zé)任公司)，吸附3h，濾出樹脂，先用蒸餾水洗滌3次，然后用O. 5升無水乙醇浸洗3次，合并浸洗液，旋蒸濃縮并凍干，得到目標(biāo)多肽Ebl. 6粗品。目標(biāo)多肽Ebl. 6粗品的回收率為82. 3%，取部分多肽Ebl. 6凍干進(jìn)行規(guī)模純化。3、產(chǎn)品純化工藝將上述2得到的目標(biāo)多肽Ebl. 6選用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱(Kromasil C18,100 Α IOym (5CmX40Cm))，江蘇漢邦科技有限公司)進(jìn)行反相液相色譜純化，上樣量350mgEbl. 6粗品，將其溶于IOOml 5%乙腈水溶液，離心后上樣。上樣速度5ml/min。流速30ml/min。A 為含 O. 1%TFA 的 H2O, B 為含 O. 1%TFA 的 ACN0 洗脫梯度=Time 為 0 70min、B% 為29Γ46%、檢測(cè)波長214nm，收集目標(biāo)肽，濃縮后凍干，得到純化多肽Ebl. 6。一次純化得純度98. 5%的目標(biāo)肽150毫克。將上述純化多肽Ebl. 6經(jīng)HPLC分析，結(jié)果如圖5所示，得到純化多肽Ebl. 6。實(shí)施例2、多肽Ebl. 6的檢測(cè)上述由實(shí)施例I得到的純化多肽Ebl. 6經(jīng)過測(cè)序，氨基酸序列為序列表中的序列I，再將該多肽進(jìn)行如下進(jìn)一步檢測(cè)I、多肽Eb I· 6 二硫鍵的測(cè)定多肽Ebl. 6 二硫鍵的測(cè)定采用兩步折疊法首先合成線性肽Ebl.6 (合成方法同上述實(shí)施例I實(shí)驗(yàn)二的步驟I)，第一步空氣氧化折疊形成第一對(duì)二硫鍵(Cysl_Cys3),然后碘氧化出去Acm保護(hù)基形成第二對(duì)二硫鍵(Cysl-Cys3, Cys2_Cys4),第一步氧化折疊條件為0. IM Tris-HCl緩沖液，pH=7. 7,磁力攪拌約28h，HPLC分析折疊進(jìn)程。折疊充分，用稀醋酸終止反應(yīng)，富集脫鹽凍干后，進(jìn)行下一步折疊。第二步氧化折疊條件10mM碘液與O. 4mg/mL的第一步折疊產(chǎn)物等體積混合,避光反應(yīng)IOmin后，加入適量抗壞血酸溶液終止反應(yīng)，HPLC分析產(chǎn)物情況，富集凍干純化。將兩步折疊產(chǎn)物與一步折疊產(chǎn)物混合進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC分析，判斷多肽的二硫鍵連接方式。結(jié)果如圖6所示，可以看出，Ebl.6二硫鍵的連接方式為“Cysl-Cys3，Cys2-Cys4”。2、多肽Ebl. 6鎮(zhèn)痛活性的測(cè)定規(guī)模合成多肽Ebl. 6的鎮(zhèn)痛活性用大鼠坐骨神經(jīng)松扎模型(CCI，Bennett GJ, XieYK. Pain, 1988,33 :87-107)進(jìn)行驗(yàn)證。大鼠(雄性，體重200_220g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)麻醉后，在股段中部切開皮膚和肌肉，暴露坐骨神經(jīng)干。將約2厘米的神經(jīng)游離出來，并用2-0號(hào)絲線在其上作4道較松的結(jié)扎，結(jié)扎間距約2毫米，結(jié)扎程度以神經(jīng)有形變但不影響神經(jīng)被膜血管流通為準(zhǔn)(在40倍放大鏡下觀察)。然后，以4-0號(hào)縫合線肌肉和皮膚均用棉線縫合，一周后拆線。手術(shù)七天后使用Ugo 37215型壓痛儀測(cè)試大鼠痛閾值，痛閾值下降40%以上者視為建模成功大鼠。將建模成功的大鼠分成5組，每組8只第一組為陽性對(duì)照組(嗎啡5mg/Kg+加巴噴丁 100mg/Kg)，嗎啡采用皮下注射lmg(0. lmL)，加巴噴丁采用灌胃給藥的方式O. 2mg(0. 18mL);第二至四組分別為實(shí)施例I中實(shí)驗(yàn)二得到的純化多肽Ebl. 6的三個(gè)不同劑量組(I μ g/Kg、4. 98 μ g/Kg和49. 8 μ g/Kg)，用生理鹽水(O. 9%)配制，濃度分別為50 μ g/mL>5 μ g/mL、l μ g/mL,靜脈注射劑量均為O. 2mL (大鼠體重均約為200g);第五組為陰性對(duì)照組，注射O. 2mL濃度為O. 9%的生理鹽水。給藥前和給藥2h、4h后，測(cè)試大鼠痛閾值，實(shí)驗(yàn)設(shè)三次重復(fù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Micrsoft Excel軟件和軟件origin6. O繪圖處理,計(jì)算痛閾提高率，公式為(給藥后痛閾值-給藥前痛閾值)/給藥前痛閾值，用平均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示。 結(jié)果如圖7和圖8所示，圖7為靜脈注射不同劑量的Ebl. 6后2小時(shí)的鎮(zhèn)痛效果，圖8為靜脈注射不同劑量的Ebl. 6后4小時(shí)的鎮(zhèn)痛效果；可見，靜脈給予Ebl. 6 4. 98 μ g/Kg和49. 8 μ g/Kg 2小時(shí)后，大鼠痛閾提高率分別為46. 8%±9· 2和57. 4%土 17. 8，顯著高于給予陽性對(duì)照藥物組(39. 7%±11. 4)。給藥4小時(shí)后，痛閾提高率分別為26. 1%±14. 8、36. 8%±15. 9,39. 1%±8· 9 均高于陽性對(duì)照組(19. 0%±11· O)。上述結(jié)果表明，采用本發(fā)明的方法合成的多肽Ebl. 6 二硫鍵連接正確，且具有高的鎮(zhèn)痛活性。
權(quán)利要求
1.一種制備芋螺多肽Ebl. 6的方法，包括如下步驟1)采用縮合劑DIC/HOBt合成Ebl. 6線性肽；2)折疊Ebl. 6線性肽得到多肽粗品；3)純化所述多肽粗品；即得到芋螺多肽Ebl. 6。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于 所述采用縮合劑DIC/HOBt合成Ebl. 6線性肽包括如下步驟先用Fmoc保護(hù)氨基酸、以Rink樹脂為固相載體、DIC/HOBt為縮合劑、哌啶為脫保護(hù)劑，從C端依次偶聯(lián)合成，得到肽樹脂；再將所述肽樹脂裂解得到Ebl. 6線性肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于 所述Rink樹脂和每一個(gè)所述Fmoc保護(hù)氨基酸的摩爾比為1:4。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 所述折疊Ebl. 6線性肽按照包括如下步驟的方法進(jìn)行 Ca)將所述Ebl. 6線性肽在濃度為O. 1-0. 3M、pH值為8. 0-8. 4的緩沖液中折疊；所述緩沖液為碳酸氫銨緩沖液或醋酸銨緩沖液或Tris緩沖液； (b)將經(jīng)步驟(a)得到的折疊產(chǎn)物經(jīng)AmberliteXAD 16大孔吸附樹脂吸附后,用無水乙醇浸洗，收集浸洗產(chǎn)物，即得到多肽粗品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種芋螺毒素多肽Eb1.6的制備方法。本發(fā)明公開了一種制備芋螺多肽Eb1.6的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟1)采用縮合劑DIC/HOBt合成Eb1.6線性肽；2)折疊所述線性肽，即得到芋螺多肽Eb1.6。本發(fā)明的方法首先采用縮合劑DIC/HOBT提高了手工合成線性肽的效率；再選取pH值為8.0、濃度為0.1MNH4HCO3緩沖液作為折疊緩沖液，不僅價(jià)廉易得，而且折疊率高；再將折疊得到的產(chǎn)物經(jīng)過AmberliteXAD16大孔吸附樹脂進(jìn)行吸附、乙醇浸洗，浸洗液濃縮后可直接用于后續(xù)的C18柱純化，同時(shí)乙醇洗滌后的樹脂用水洗滌再生，此步驟可實(shí)現(xiàn)緩沖體系及樹脂的反復(fù)循環(huán)使用，回收率較高，降低了成本。
文檔編號(hào)C07K1/06GK102875654SQ20121036142
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月25日
發(fā)明者戴秋云, 徐艷, 董銘心, 余碩, 劉珠果, 王孝花, 周尚民, 李海濤, 代琴 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所