棉鈴蟲和煙夜蛾的npy神經(jīng)肽及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法

棉鈴蟲和煙夜蛾的npy神經(jīng)肽及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種棉鈴蟲和煙夜蛾的NPY神經(jīng)肽及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；（b）將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明還保護(hù)抑制所述基因表達(dá)的物質(zhì)在如下（c）或（d）中的應(yīng)用：（c）培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物；（d）制備抗蟲劑。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，抑制NPY基因表達(dá)的物質(zhì)可以用于培育轉(zhuǎn)基因抗蟲作物，即通過干擾害蟲的取食作用，從而抑制害蟲對(duì)植物的危害，無污染，不會(huì)將有害物質(zhì)傳遞到害蟲的天敵體內(nèi)，與環(huán)境的相容性好，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大有益價(jià)值。
【專利說明】棉鈴蟲和煙夜蛾的NPY神經(jīng)肽及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種棉鈴蟲和煙夜蛾的NPY神經(jīng)肽及其編碼基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)肽NPY (Neuropeptide Y)首先在高等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，之后相繼在無脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，在昆蟲中的發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚。由于最早發(fā)現(xiàn)的Neuropeptide Y成熟肽C-末端為酪氨酸(Y)而被命名NPY，無脊椎動(dòng)物中以苯丙氨酸(F)結(jié)尾，所以將無脊椎動(dòng)物此類神經(jīng)肽統(tǒng)稱為NPF，或無脊椎動(dòng)物的NPY家族。目前在昆蟲中NPY命名尚未統(tǒng)一，以酪氨酸結(jié)尾的稱NPY (如意大利蜜蜂)，以苯丙氨酸結(jié)尾的稱NPF (如果蠅)，昆蟲NPF或者NPY總稱NPY類神經(jīng)肽。目前，昆蟲其他目的物種中，僅發(fā)現(xiàn)有NPF或者NPY，而在鱗翅目昆蟲中發(fā)現(xiàn)同時(shí)含有NPF和NPY。該類基因主要分布于腦和中腸中，在取食、酒精過敏、能量平衡、性行為、焦慮、學(xué)習(xí)和記憶、生物節(jié)律等許多方面都起著重要的調(diào)控作用。
[0003]目前，在無脊椎動(dòng)物中，對(duì)NPY基因功能的研究相對(duì)滯后，主要集中在果蠅和線蟲的NPF上。在鱗翅目昆蟲中，該基因還未見報(bào)道。研究棉鈴蟲NPY的基因及其功能，對(duì)于害蟲防治新技術(shù)的開發(fā)具有廣泛的前景。
[0004]煙夜蛾和棉鈴蟲都屬于鱗翅目、夜蛾科，主要以幼蟲取食幼嫩組織為害作物，以蛹越冬。煙夜蛾在全國各地均有分布，屬寡食性害蟲，主要為害煙草。棉鈴蟲是一種在全球范圍內(nèi)為害農(nóng)作物的害蟲，食性廣，為害嚴(yán)重。另外，棉鈴蟲具有顯著的生理生態(tài)及行為特點(diǎn)，例如雜食性、滯育、遷飛等，還是研究鱗翅目昆蟲的代表物種。

【發(fā)明內(nèi)容】

`[0005]本發(fā)明的目的是提供一種棉鈴蟲和煙夜蛾的NPY神經(jīng)肽及其編碼基因和應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，來自棉鈴蟲或煙夜蛾，命名為NPY蛋白，是如下(a)或(b):
[0007](a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；
[0008](b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
[0009]編碼所述蛋白的基因(NPY基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]所述基因可為如下I)至6)中任一所述的DNA分子:
[0011]I)序列表的序列2自5’末端第24-305位核苷酸所示的DNA分子；
[0012]2)序列表的序列3自5’末端第24-305位核苷酸所示的DNA分子；
[0013]3)序列表的序列2所示的DNA分子；
[0014]4)序列表的序列3所示的DNA分子；
[0015]5)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)蛋白的DNA分子；
[0016]6)與I)或2)或3)或4)限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)蛋白的DNA分子。[0017]含有所述NPY基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0018]本發(fā)明還保護(hù)抑制所述NPY基因表達(dá)的物質(zhì)在如下(C)或(d)中的應(yīng)用:(C)培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物；(d)制備抗蟲劑。所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為煙草，如煙草NC98。所述抗蟲具體可為抗鱗翅目昆蟲，更具體可為抗夜蛾科昆蟲，進(jìn)一步具體可為抗棉鈴蟲或抗煙夜蛾。
[0019]本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將抑制所述NPY基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入出發(fā)植物，得到對(duì)昆蟲抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物。所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為煙草，如煙草NC98。所述昆蟲具體可為鱗翅目昆蟲，更具體可為夜蛾 科昆蟲，進(jìn)一步具體可為棉鈴蟲或煙夜蛾。
[0020]本發(fā)明還保護(hù)一種抗蟲劑，它的活性成分為抑制所述NPY基因表達(dá)的物質(zhì)。所述抗蟲具體可為抗鱗翅目昆蟲，更具體可為抗夜蛾科昆蟲，進(jìn)一步具體可為抗棉鈴蟲或抗煙夜蛾。
[0021]以上任一所述抑制NPY基因表達(dá)的物質(zhì)可為針對(duì)所述NPY基因的干擾載體或抑制所述NPY基因表達(dá)的雙鏈RNA。
[0022]所述干擾載體中具有特異DNA片段；所述特異DNA片段為雙鏈，包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之間的間隔序列；所述DNA片段甲的序列與所述DNA片段乙的序列反向互補(bǔ)；所述DNA片段乙為所述NPY基因或其片段。所述DNA片段乙具體可為序列4自5’末端第6至263位核苷酸所示的雙鏈DNA分子或序列6自5’末端第6至263位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。所述干擾載體具體可為如下質(zhì)粒:骨架載體為PGreen-HYKM載體，在骨架載體的不同多克隆位點(diǎn)分別插入了所述DNA片段甲和所述DNA片段乙。所述干擾載體更具體可為如下質(zhì)粒:骨架載體為pGreen-HY104載體，在所述骨架載體的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入了所述DNA片段甲，在骨架載體的SmaI和BamHI酶切位點(diǎn)之間插入了所述DNA片段乙。
[0023]所述雙鏈RNA具體可為序列表的序列8所示的雙鏈RNA分子、序列表的序列9所示的雙鏈RNA分子、序列表的序列5所示的雙鏈RNA分子或序列表的序列7所示的雙鏈RNA分子。
[0024]本發(fā)明還保護(hù)序列表的序列8所示的雙鏈RNA分子、序列表的序列9所示的雙鏈RNA分子、序列表的序列5所示的雙鏈RNA分子或序列表的序列7所示的雙鏈RNA分子。
[0025]本發(fā)明還保護(hù)具有特異DNA片段的干擾載體。所述特異DNA片段為雙鏈，包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之間的間隔序列；所述DNA片段甲的序列與所述DNA片段乙的序列反向互補(bǔ)；所述DNA片段乙為所述NPY基因或其片段。所述DNA片段乙具體可為序列4自5’末端第6至263位核苷酸所示的雙鏈DNA分子或序列6自5’末端第6至263位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。所述干擾載體具體可為如下質(zhì)粒:骨架載體為pGreen-HYKM載體，在骨架載體的不同多克隆位點(diǎn)分別插入了所述DNA片段甲和所述DNA片段乙。所述干擾載體更具體可為如下質(zhì)粒:骨架載體為pGreen-HY104載體，在所述骨架載體的HindIII和EcoRI酶切位點(diǎn)之間插入了所述DNA片段甲，在骨架載體的SmaI和BamHI酶切位點(diǎn)之間插入了所述DNA片段乙。
[0026]以上任一所述的pGreen_HY104載體具體可為序列表的序列10所示的質(zhì)粒，結(jié)構(gòu)示意圖見圖6。
[0027]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，抑制NPY基因表達(dá)的物質(zhì)可以用于培育轉(zhuǎn)基因抗蟲作物(特別是煙草、棉花、玉米等棉鈴蟲為害的農(nóng)作物)，其作用機(jī)理是通過干擾害蟲的取食作用，從而抑制害蟲對(duì)植物的危害，無污染，不會(huì)將有害物質(zhì)傳遞到害蟲的天敵(通常為益蟲)體內(nèi)，與環(huán)境的相容性好，對(duì)于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重大有益價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1為pDNR-LIB載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0029]圖2為棉鈴蟲腦組織cDNA文庫的菌落PCR鑒定，泳道1_20分別為隨機(jī)挑取的單克隆。
[0030]圖3為棉鈴蟲神經(jīng)肽NPY基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0031]圖4為煙夜蛾腦組織cDNA文庫的菌落PCR鑒定，泳道1_15分別為隨機(jī)挑取的單克隆。
[0032]圖5為煙夜蛾神經(jīng)肽NPY基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0033]圖6為pGreen_HY104載體的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0034]圖7為HindIII和BamHI雙酶切鑒定RNAi棉鈴蟲干擾載體；泳道I對(duì)應(yīng)酶切后的棉鈴蟲RNAi載體，泳道2對(duì)應(yīng)pGre en-HY104載體。
[0035]圖8為HindIII和BamHI雙酶切鑒定煙夜蛾RNAi干擾載體；泳道I對(duì)應(yīng)pGreen-HY104載體，泳道2對(duì)應(yīng)酶切后的煙夜蛾RNAi載體。
[0036]圖9為棉鈴蟲dsRNA和煙夜蛾dsRNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；泳道I對(duì)應(yīng)棉鈴蟲dsRNA,泳道2對(duì)應(yīng)煙夜蛾dsRNA。
[0037]圖10為實(shí)施例5中，在煙草中導(dǎo)入棉鈴蟲RNAi干擾載體后dsRNA的表達(dá)情況；泳道I對(duì)應(yīng)煙草植株I的原葉，泳道2對(duì)應(yīng)煙草植株2的原葉，泳道3對(duì)應(yīng)煙草植株I的新葉，泳道4對(duì)應(yīng)煙草植株2的原葉,泳道M對(duì)應(yīng)分子量標(biāo)記。
[0038]圖11為實(shí)施例5中棉鈴蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草植株的危害情況(實(shí)驗(yàn)l);a:實(shí)驗(yàn)組接種棉鈴蟲24小時(shí)后；b:實(shí)驗(yàn)組接種棉鈴蟲48小時(shí)后；c:實(shí)驗(yàn)組接種棉鈴蟲72小時(shí)后；d:對(duì)照組接種棉鈴蟲24小時(shí)后；e:對(duì)照組接種棉鈴蟲48小時(shí)后；f:對(duì)照組接種棉鈴蟲72小時(shí)后。
[0039]圖12為實(shí)施例5中棉鈴蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草的葉片的危害情況(實(shí)驗(yàn)2) ；a為照片，b為棉鈴蟲取食葉片的面積。
[0040]圖13為被棉鈴蟲進(jìn)食前的飼料的照片。
[0041]圖14為被棉鈴蟲進(jìn)食后的飼料照片。
[0042]圖15為實(shí)施例6中注射棉鈴蟲dsRNA后棉鈴蟲的取食量變化。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。[0044]棉鈴蟲(英文名稱為cotton bollworm，拉丁名為 Helicoverpa armigera):提及棉鈴蟲的文獻(xiàn):A simple and reliable method for discriminating between Helicoverpaarmigera and Helicoverpa assulta(Lepidoptera:Noctuidae)，Chen，J:Wu，YC;Chen，X;.11.YT:Zhang.DX，INSECT SCIENCE)。棉鈴蟲在中國農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生理生化分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為:溫度26°C，光周期為每天16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗，相對(duì)濕度控制在55-65% ；2齡后分管單管飼養(yǎng)，玻璃管直徑1.5cm、高10cm。
[0045]煙夜蛾(英文名稱為Tobacco budworms，拉丁名為 Helicoverpa assulta):提及煙夜蛾的文獻(xiàn):A simple and reliable method for discriminating between Helicoverpaarmigera and Helicoverpa assulta(Lepidoptera:Noctuidae)，Chen，J:Wu，YC:Chen，X;J1.YT: Zhang.DX, INSECT SCIENCE)。飼養(yǎng)條件:溫度26°C，光周期為每天16小時(shí)光照、8小時(shí)黑暗，相對(duì)濕度控制在55-65% ；2齡后分管單管飼養(yǎng)，玻璃管直徑1.5cm、高10cm。
[0046]pGreen-HY104載體(又稱pGreen-GUS-dsRNA)，結(jié)構(gòu)不意圖見圖6，為序列表的序列 10 所不的質(zhì)粒。HpGreen 0229 (http://www.pgreen.ac.uk/JIT/JIT_fr.htm)為骨架構(gòu)建得到的。在XbaI和SacI之間插入CaMV ter序列，在KpnI和XhoI之間插入35spromoter序列，在EcoRI和PstI之間插入GUS基因序列。
[0047]農(nóng)桿菌C58 (Agrobacterium tumefaciens C58):參考文獻(xiàn):Development ofAgrobacterium tumefaciens C58-1nduced plant tumors and impact on host shoots are controlled by a cascade of jasmonic acid, auxin, cytokinin, ethylene andabscisic acid，Veselov, D;LanghansjM;HartungjW;AlonijR;Feussnerj I;GotzjC;Veselova，S;Schlomski，S;Dickler，C;Bachmann，K;Ullrich，CI，PLANTA，216(3):512-522。
[0048]煙草NC98(野生型煙草)！Distribution of solanesol in Nicotianatabacum，ZHAO Chun—jian，ZUYuan—gang，LI Chun-ying, TIAN Cheng-yu, Journal ofForestry Research, 18(I):69 - 72(2007)。
[0049]實(shí)施例1、棉鈴蟲NPY蛋白及其編碼基因的獲得
[0050]一、cDNA文庫構(gòu)建
[0051]文庫構(gòu)建使用SMART cDNA Library Construction Kit試劑盒。構(gòu)建流程如下:取 2μ L 棉鈴蟲幼蟲腦總 RNA (約 2μ g)，依次加入 1μ L SMART IV Oligoncleotide (5’_AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGG-3)，I μ L CDS/3’PCR primer (ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T) 30N-1N)，然后加入2 μ L無RNase去離子水。輕輕混勻后離心，72°C孵育2min，冰上冷卻2min后離心，每管中加入2 μ L 5x第一鏈合成Buffer，IuL DTT (20mM)，I μ L dNTP混合物(IOmM)，I μ L麗LV反轉(zhuǎn)錄酶，至總體積為10 μ L0同時(shí)做一個(gè)陽性對(duì)照。輕輕混勻后離心后在PCR儀中42°C孵育lh，在冰上終止第一鏈的合成，至此第一鏈合成完成。
[0052]在合成第二鏈的反應(yīng)中選用LD-PCR法，加入第一鏈cDNA 2 μ L，去離子水 80 μ L，IOX Advantage 2PCR Buffer 10 μ L,50X dNTP Mix 2 μ L，5，PCR 引物(5，-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3，)2 μ L，CDS III/3’PCR 引物 2μ?，50ΧAdvantage2Polymerase Mix 2 μ L，總體積100 μ L。輕輕混勻后離心，使用以下程序進(jìn)行反應(yīng):95°C Imin ；95°C 15sec、68t: 6min，20 個(gè)循環(huán)。
[0053]反應(yīng)結(jié)束后，取5 μ L在1.1%含有EtBr的膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。第二鏈產(chǎn)物合成后需用蛋白酶K進(jìn)行消化。方法如下:在0.5mL的離心管中加入50 μ L ds cDNA和2 μ L蛋白酶Κ(20 μ g/ μ L)，混勻后離心,45°C孵育20min，反應(yīng)結(jié)束后加入50 μ L去離子水,然后加入100 μ L酌.:氯仿:異戍醇(25:24:1,體積比)進(jìn)行抽提，14000rpm離心5min后取上清。在上清中加入 10 μ L NaAC (醋酸鈉，3Μ，ΡΗ4.8)，L 3 μ L Glycogen (糖原，20 μ g/μ L)和260 μ L 959?)ΕΤΟΗ(乙醇)，室溫下迅速14000rpm離心20min，小心棄去上清，加IOOyL 80%乙醇洗滌沉淀，沉淀干燥約IOmin以除去殘留的乙醇。加入79 μ L的去離子水，充分溶解沉淀。
[0054]在上述79yL ds cDNA 溶液中加入 10 μ L IOX Sfi Buffer, 10 μ L SfiI 內(nèi)切酶和IyLlOOX BSA，混勻后50°C孵育2hr進(jìn)行酶切。反應(yīng)結(jié)束后加入2 μ L 1%二甲苯青染色，然后準(zhǔn)備進(jìn)行ds cDNA片段分離。ds cDNA片段分離使用CHROMA SPIN-400柱子進(jìn)行，步驟如下:1)在離心管鐵架臺(tái)上放置16個(gè)1.5mL離心管；2)將CHROMA SPIN-400柱從4°C冰箱中取出，按以下步驟處理柱子:a)室溫放置lh，顛倒數(shù)次徹底懸浮膠體，或者打開上蓋子用微量槍頭輕輕混勻山)輕輕懸浮膠體(勿產(chǎn)生氣泡)，拔掉底蓋；c)將柱子水平固定在鐵架臺(tái)上，打開柱子下面封口，使貯存緩沖液自然流下，待流盡后看凝膠體積是否達(dá)到lmL，如果沒有l(wèi)mL，在其它柱子中取凝膠補(bǔ)充至ImL ；d)柱子流速大約為I滴/40_60s，I滴約為40 μ L，若流速太低(〈I滴/100s)或每滴體積太小(〈25 μ L)必須重復(fù)上述步驟進(jìn)行重新懸??；3)貯存緩沖液流完后，在柱的中心處加入700 μ L柱緩沖液，讓其流出；4)待柱緩沖液流干后，小心將約100 μ L經(jīng)Sfi1-酶切的cDNA和二甲苯青混合物加到膠頂部中心部位；5)當(dāng)樣品充分進(jìn)入膠內(nèi)時(shí)，向柱內(nèi)加入100 μ L的柱緩沖液，待柱內(nèi)凝膠表面液體消失且沒有液滴滴下時(shí)進(jìn)行下一步；6)準(zhǔn)備好17個(gè)1.5mL離心管的架子置于柱子下面，第一個(gè)管子置于柱子出口下部；加入600 μ L的柱緩沖液，立即開始收集,每管35 μ L (約I滴)，直至收集夠全部17管；7)制備1.1%的瓊脂糖凝膠，電泳檢測(cè)17管的收集物，每管用3 μ L連續(xù)在點(diǎn)樣孔加樣，150V電泳IOmin ;收集6_11管含有cDNA的組分到一個(gè)新1.5mL的離心管中；8)依次加入 1/10 體積 NaAC (3M; pH 4.8)，1.3μ L Glycogen (20mg/mL), 2.5 倍體積 95%ET0H(-20) °C,充分混勻，_20°C過夜沉淀；9)室溫HOOOrpm離心20min ；10)小心棄上清，輕離心，用移液器小心吸去剩余的上清，干燥約IOmin ;11)以7 μ L無離子水溶解沉淀，輕微混勻，即制備好酶切完成的PCR片段。
[0055]將酶切完成的PCR片段與經(jīng)SfiI酶切的pDNR-LIB載體(結(jié)構(gòu)示意圖見圖1)連接。連接體系如下:dscDNA 1.0μ L、pDNR-LIB 載體 1.0μ L、10X ligation buffer 0.5 μ L、ATP(IOmM)0.5 μ L、T4DNA 連接酶 0.5 μ L、去離子水 1.5μ L。
[0056]將上述反應(yīng)后的重組質(zhì)粒,通過電擊轉(zhuǎn)化儀導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α菌株感受態(tài)細(xì)胞中。取3份25 μ L感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化，分別加入上述連接產(chǎn)物，混勻后加入到電轉(zhuǎn)杯中進(jìn)行電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后迅速取出電轉(zhuǎn)杯，加入970 μ L 37°C預(yù)熱的SOC培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到IOmL離心管中，37°C震蕩培養(yǎng)Ihr (200rpm/min)。取培養(yǎng)物涂布在含有30mg/mL氯霉素的平板上，37°C倒置培養(yǎng)過夜。根據(jù)菌落生長(zhǎng)情況確定適合的連接體系，以此作為原始文庫，4°C保存。棉鈴蟲腦組織cDNA文庫的菌落PCR鑒定結(jié)果見圖2。
[0057]二、5’RACE PCR 擴(kuò)增
[0058]5’RACE 上游引物米用引物 SMART cDNA Library Construction Kit 中的 5’ 引物(5 ’ -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3 ’)，下游引物采用設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物(NPF: 5 ’ -TTNCCRAANCKNGGNCKIGCIGCYTG-3' NPY:5’ -CCNCKNCCRTGNCCRTGNACNSWRTARTA-3’)。
[0059]按照試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系(25L):LA PCR Buffer (Mg2+) 2.5 μ L、dNTPmix(each IOmM) 4 μ L> LA taq 0.25 μ L>Primer I (10 μ mol/L) I μ L>Primer 2 (10 μ mol/L)I μ L、質(zhì)粒 cDNA 文庫 0.5μ L、ddH20 11.25 μ L。
[0060]在PCR管中將其混合完畢后，放入PCR儀擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:94°C 3min ；94°C 30S、65°C— 55°C (每個(gè)循環(huán)降低 1°C)、72°C 30S，10 個(gè)循環(huán)；94°C 30S、54°C 30S、72°C 30S，30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。
[0061]反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收連接克隆后轉(zhuǎn)入大腸桿菌培養(yǎng)，挑菌送樣測(cè)序。
[0062]三、3 ’ RACE快速擴(kuò)增3 ’末端
[0063]1、cDNA 合成
[0064]I)將模板RNA在冰上解凍；引物、1 0XRT mix(其中包含RNasin和DTT)、超純dNTP混合液、RNase-free ddH20在室溫(15_25°C )解凍，解凍后迅速置于冰上。使用前將每種溶液渦旋振蕩混勻，離心以收集殘留在管壁的液體。
[0065]2)按照的逆轉(zhuǎn)錄體系配制混合液，徹底混勻，渦旋振蕩時(shí)間不超過5s。簡(jiǎn)短離心，并置于冰上，RNA模板請(qǐng)于第4)步加入。
[0066]3)如果要做多個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可以將配制好的混合液后分裝在單個(gè)反應(yīng)管中，置于冰上。
[0067]4)首先取適量的RNA (I μ g)進(jìn)行定量,冰浴條件下按照Tiangen (Quant OneStep RT-PCR Kit)說明進(jìn)行以下配置反轉(zhuǎn)錄體系:10X RT mix、dNTP混合液(2.5mM each)、dT3AP>Quant Reverse Transcriptase>RNAse-free H20、模板 RNA (在第 4 步加入)，總體積20 μ L0
[0068]5)將模板RNA (50ng_2 μ g)加入到混合液中，徹底混勻，渦旋振蕩時(shí)間不超過5s，離心15s。
[0069]6)37°C孵育 60min，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0070]2、3’RACE 擴(kuò)增
[0071]根據(jù)cDNA反轉(zhuǎn)錄時(shí)候3’-dT3AP引物結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)3’外引物:3Ap (5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’ );根據(jù)5’ RACE擴(kuò)增并測(cè)出的序列信息，設(shè)計(jì)出一條上游特異性引物SPF (NPF:5’ -ATGCTGAACAAGAACATCG-3’，NPY:5’ -TGCGTTTCCTCCTACCGGCCATG-3’)。
[0072]3’ RACE擴(kuò)增采用兩步PCR的方法，即第一步PCR只需在反應(yīng)體系中加入上游引物，在PCR管中將其混合完畢后，放入PCR儀擴(kuò)增，通過10個(gè)循環(huán)的單引物反應(yīng)，增加目的基因的初始拷貝數(shù)，然后再加入下游3AP引物，進(jìn)行25個(gè)左右循環(huán)的擴(kuò)增。
[0073]按照試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系(25μ L):LA PCR Buffer (Mg2+)2.5 μ L,dNTPmix(each 10mM)4yL、LA taq 0.25 μ L, Primer I (SPF) (10 μ mol/L) I μ L、ddH2011.75 μ L。
[0074]反應(yīng)條件:94°C3min ；94°C 30S、56°C 30S、72°C 30S, 10 個(gè)循環(huán)；4°C溫浴，加入下游接頭引物 3AP -M0C 30S、56°C 30S、72°C 30S，25 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。
[0075]反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收連接克隆后轉(zhuǎn)入大腸桿菌培養(yǎng)，挑菌送樣測(cè)序。
[0076]四、cDNA全長(zhǎng)的擴(kuò)增[0077]根據(jù)NPY5’和3’ RACE測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)擴(kuò)增棉鈴蟲NPY全長(zhǎng)基因序列，上游命名為P1F，下游命名為P1R。
[0078]按照試劑盒說明書操作，反應(yīng)體系(25μ L):LA PCR Buffer (Mg2+)2.5 μ L,dNTPmix(each IOmM) 4 μ L, LA taq 0.25 μ L、引物 PlF (10 μ mol/L) I μ L、引物 PlR (10 μ mol/L)I μ L、棉鈴蟲質(zhì)粒 cDNA 文庫 0.5 μ L、ddH20 11.25 μ L。
[0079]引物PIF: 5，-ACACTGGCATATACAGTCAAAATG-3，；
[0080]引物PIR: 5，-TTATAACCAAGGTTTTTAAAGGC-3，。
[0081]反應(yīng)條件為:94°C3min ；94°C 30s、65°C— 55°C(每個(gè)循環(huán)降低 l°C)30s、72°C 30s,10 個(gè)循環(huán)；94°C 30s、54°C 30s,72°C 30s, 30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。
[0082]反應(yīng)結(jié)束進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，回收連接克隆后轉(zhuǎn)入大腸桿菌培養(yǎng)，挑菌送樣測(cè)序。棉鈴蟲神經(jīng)肽NPY基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見圖3。
[0083]通過上述實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)來源于棉鈴蟲的新NPY蛋白，命名為棉鈴蟲NPY蛋白，如序列表的序列I所示。相應(yīng)的發(fā)現(xiàn)了來源于棉鈴蟲的編碼NPY蛋白的基因，命名為棉鈴蟲NPY基因，如序列表的序列2所示(其開放閱讀框?yàn)樾蛄斜淼男蛄?自5’末端第24-305位核苷酸)。
[0084]實(shí)施例2、煙夜蛾NPY蛋白及其編碼基因的獲得
[0085]將煙夜蛾代替棉鈴蟲進(jìn)行實(shí)施例1，發(fā)現(xiàn)煙夜蛾中同樣存在序列表的序列I所示的NPY蛋白(將其命名為煙夜蛾NPY蛋白，序列與棉鈴蟲NPY蛋白完全一致)。相應(yīng)的發(fā)現(xiàn)了來源于煙夜蛾的編碼NPY蛋白的基因，命名為煙夜蛾NPY基因，如序列表的序列3所示(其開放閱讀框?yàn)樾蛄斜淼男蛄?自5’末端第24-305位核苷酸，與棉鈴蟲NPY基因的開放閱讀框的相似度為96.8%)。
[0086]煙夜蛾腦組織cDNA文庫的菌落PCR鑒定結(jié)果見圖4。
[0087]煙夜蛾神經(jīng)肽NPY基因的全長(zhǎng)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖見圖5。
[0088]實(shí)施例3、RNAi干擾載體的構(gòu)建
[0089]一、棉鈴蟲RNAi干擾載體的構(gòu)建
[0090]1、提取5齡棉鈴蟲幼蟲的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用NPYFor和NPYRev為模板，采用LA taq作為DNA聚合酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
[0091]
【權(quán)利要求】
1.一種蛋白質(zhì)，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于:所述基因是如下I)至6)中任一所述的DNA分子: O序列表的序列2自5’末端第24-305位核苷酸所不的DNA分子； 2)序列表的序列3自5’末端第24-305位核苷酸所不的DNA分子； 3)序列表的序列2所不的DNA分子； 4)序列表的序列3所不的DNA分子； 5)在嚴(yán)格條件下與I)或2)或3)或4)限定的DNA序列雜交且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)蛋白的DNA分子； 6)與I)或2)或3)或4) 限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)蛋白的DNA分子。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.抑制NPY基因表達(dá)的物質(zhì)在如下(c)或(d)中的應(yīng)用: (C)培育抗蟲轉(zhuǎn)基因植物； (d)制備抗蟲劑； 所述NPY基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
6.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟:將抑制NPY基因表達(dá)的物質(zhì)導(dǎo)入出發(fā)植物，得到對(duì)昆蟲抗性增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物； 所述NPY基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用或如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:權(quán)利要求5中的所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述抗蟲為抗鱗翅目昆蟲；權(quán)利要求6中的所述出發(fā)植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述昆蟲為鱗翅目昆蟲。
8.—種抗蟲劑，它的活性成分為抑制NPY基因表達(dá)的物質(zhì)； 所述NPY基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
9.序列表的序列8所示的雙鏈RNA分子、序列表的序列9所示的雙鏈RNA分子、序列表的序列5所示的雙鏈RNA分子或序列表的序列7所示的雙鏈RNA分子。
10.具有特異DNA片段的干擾載體，所述特異DNA片段包括DNA片段甲、DNA片段乙和位于所述DNA片段甲和所述DNA片段乙之間的間隔序列；所述DNA片段甲的序列與所述DNA片段乙的序列反向互補(bǔ)；所述DNA片段乙為NPY基因或其片段； 所述NPY基因?yàn)榫幋a如下(a)或(b)所述蛋白質(zhì)的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列I的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與昆蟲進(jìn)食量相關(guān)的由序列I衍生的蛋白質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK103665132SQ201210336811
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2012年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月12日
【發(fā)明者】趙章武, 劉曉光, 周子敬 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)