專利名稱：重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應(yīng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，尤其是涉及一種重組人促紅素的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法。
背景技術(shù)：
重組人促紅細(xì)胞生成素(簡(jiǎn)稱EP0)，是保護(hù)和促進(jìn)骨髓中造血干細(xì)胞分化、増殖和成熟為紅細(xì)胞的特異性造血因子，由美國(guó)安進(jìn)公司首先開發(fā)上市，在臨床上用于治療各種腎性貧血和非腎性貧血，被稱為迄今技術(shù)最成熟、療效最確切和全球銷售額最高的基因エ程藥物。不過(guò)，該藥物存在用藥頻繁(每周ー針或三針)和生物活性低等主要問(wèn)題，給患者帶來(lái)較大的治療痛苦和生活不便，因此有進(jìn)一步修飾改良的需要，也就是開發(fā)長(zhǎng)效化EPO藥物。目前，國(guó)際上比較成熟的長(zhǎng)效EPO藥物之一，就是美國(guó)安進(jìn)公司開發(fā)上市的第二代EPO 制劑“Aranesp”，其半衰期比第一代EPO延長(zhǎng)了 2倍，可以實(shí)現(xiàn)每周只需注射I次的治療方案，自上市以來(lái)，受到醫(yī)院和病人的歡迎，在2008年的年銷售額已達(dá)10億美元以上，并超過(guò)了第一代EPO的市場(chǎng)年增長(zhǎng)率。同時(shí)，聚こニ醇化(PEG化)作為ー種很有效的制備長(zhǎng)效蛋白質(zhì)藥物的化學(xué)修飾途徑，也已應(yīng)用于長(zhǎng)效EPO藥物的制備。以瑞士羅氏公司于2007年8月上市的“Mircera”為例，其藥物活性成分就是單取代的PEG化EPO (mPEG-EPO),該藥物擁有比“Aranesp”更為持久的半衰期，達(dá)到了大約134小時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)毎月只需注射2次或I次的治療方案，進(jìn)ー步壓縮了常規(guī)EPO藥物的市場(chǎng)份額，形成了“長(zhǎng)效、高活性、低治療成本”的藥物特點(diǎn)和競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，從而顯著地降低患者的治療痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，有效地提高了患者的生活質(zhì)量。而在PEG-EPO藥物的研發(fā)過(guò)程中，PEG-EPO的合成反應(yīng)エ藝是非常關(guān)鍵的技術(shù)。一個(gè)好的PEG-EPO合成エ藝可以顯著地減低PEG-EPO藥物的生產(chǎn)成本，同時(shí)直接影響到了最終所得PEG-EPO藥物的生物活性以及藥效。目前在國(guó)際上，比較成功的PEG-EPO藥物是羅氏上市的“ Mircera”，其合成エ藝的單取代反應(yīng)率大約在40%左右，同時(shí)多取代產(chǎn)物含量達(dá)到38%，其中的單取代產(chǎn)物是PEG-EPO合成反應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物，具有較為確定的分子結(jié)構(gòu)和較高的藥物活性，而多取代產(chǎn)物則是反應(yīng)的副產(chǎn)物，會(huì)加大后續(xù)純化工藝的難度。此外，相比已有的其它PEG化蛋白質(zhì)藥物，EPO具有9個(gè)反應(yīng)位點(diǎn)(如圖I所示)，包括8個(gè)賴氨酸殘基和N端氨基，在反應(yīng)中容易形成多取代產(chǎn)物，更難于實(shí)現(xiàn)特異性定點(diǎn)PEG化合成。以羅氏的PEG-EPO藥物為例，其最終形成制劑的單取代PEG-EPO藥物是由三種以上不同取代位置的單取代產(chǎn)物組成的，其主要的取代位置分別是氮端氨基酸、52位賴氨酸和45位賴氨酸。因此，PEG-EPO合成エ藝的重點(diǎn)和難點(diǎn)在于提高單取代率，同時(shí)降低多取代率，以利于后續(xù)純化工藝。
發(fā)明內(nèi)容
為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種單取代率高、多取代率低的重組人促紅素的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法。
本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)的，一種重組人促紅素的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其中，EPO分子在第一種緩沖液中完成第一次PEG化反應(yīng)后至少還包括以下步驟將第一次PEG化反應(yīng)的反應(yīng)液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進(jìn)ー步加入PEG進(jìn)行第二次PEG化反應(yīng)，得到最終反應(yīng)液。為了使單取代率更高，在得到最終反應(yīng)液前還包括以下若干步驟將前一次PEG化反應(yīng)的反應(yīng)液在與第一種緩沖液不同的緩沖液中進(jìn)ー步加入PEG進(jìn)行后一次PEG化反應(yīng)。作為ー種優(yōu)選方式，在得到最終反應(yīng)液前還包括以下步驟將第二次PEG化反應(yīng)的反應(yīng)液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液或第三種緩沖液中進(jìn)ー步加入PEG進(jìn)行第三次PEG化反應(yīng)。具體的，所述第一種緩沖液包括pH6. 5 7. 5的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的緩沖液包括與第一種緩沖液PH值不重疊的pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖液、pH7. 4
9.0的硼砂緩沖液、pH9. 0 12的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或pH4. 5 7. 0的醋酸緩沖液。更具體的，所述第一種緩沖液包括pH7. 2的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的緩沖液包括PH7. 4的磷酸緩沖液、pH7. 4的硼砂緩沖液、pH9. 3的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或PH5.8的醋酸緩沖液。一種優(yōu)選的反應(yīng)條件，所述PEG化反應(yīng)方法包括將PEG與EPO混合反應(yīng)至少2小時(shí)，反應(yīng)pH值為7.0 7. 5，所述PEG與EPO的摩爾比為10 25 I，所述PEG中聚こニ醇的分子量為30，000 40，000道爾頓。具體的，所述PEG與EPO的摩爾比為10 25 I為全部PEG化反應(yīng)步驟中PEG與EPO的摩爾比。具體的，所述PEG化反應(yīng)方法包括將PEG與EPO混合反應(yīng)為2. 5小時(shí)。作為進(jìn)一歩提高單取代率的方式，還包括在最終反應(yīng)液中純化單取代PEG-EPO的步驟將最終反應(yīng)液經(jīng)疏水層析純化得到單取代PEG-EPO與PEG的混合物，再?gòu)膯稳〈鶳EG-EPO與PEG的混合物中分離得到單取代PEG-EP0。PEG-EPO合成エ藝之所以單取代率低、多取代率高，是因?yàn)樵诘谝淮蜳EG化反應(yīng)以后，所得PEG-EPO反應(yīng)液具有較高的穩(wěn)定性，未反應(yīng)的EPO原液很難進(jìn)一歩與新加入的PEG試劑發(fā)生二次PEG化反應(yīng)。其原因在于反應(yīng)液中已經(jīng)水解失去活性的PEG試劑，在EPO分子周圍形成的空間位阻很大，阻止了新加入的帶有反應(yīng)活性的PEG試劑與反應(yīng)液中的游離的EPO分子的相互反應(yīng)。同吋，已經(jīng)被單取代或多取代的EPO分子中可供修飾的氨基數(shù)目也變少了，并且剩下的位點(diǎn)比較難被修飾。依據(jù)緩沖液可改變蛋白質(zhì)構(gòu)象或封閉某些反應(yīng)部位的原理，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在相同的PH值范圍內(nèi)，采用不同的緩沖體系進(jìn)行修飾反應(yīng)，所得反應(yīng)效果有很明顯的差別。這應(yīng)該是由于在不同的緩沖環(huán)境中，PEG與EPO分子的氨基結(jié)合位點(diǎn)不同，同時(shí)在離子類型不同的緩沖液中，EPO分子各賴氨酸殘基所處的微環(huán)境不同，即PEG與各氨基結(jié)合的難易程度不同。通過(guò)更深入的實(shí)驗(yàn)研究，我們進(jìn)一歩發(fā)現(xiàn)，在EPO分子完成第一次PEG化反應(yīng)以后，往所得反應(yīng)液體系中，加入適量的另ー種緩沖液，可以非常有效地降低溶液中游離EPO分子所受到的PEG分子的位阻作用，從而為EPO分子的第二次，乃至多次PEG化反應(yīng)提供了合適的反應(yīng)條件。在此基礎(chǔ)上，我們已經(jīng)成功地實(shí)現(xiàn)了 EPO的二次、三次，乃至四次PEG化反應(yīng)，建立了一種新的PEG-EPO的制備方法，所得單取代產(chǎn)物的收率較高，并顯著地降低了多取代產(chǎn)物的形成。同吋，紫外光譜測(cè)試、電泳測(cè)試、唾液酸測(cè)試和體外活性測(cè)試等測(cè)試結(jié)果表明，所得PEG-EPO單取代產(chǎn)物很好地保留其生物活性和蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)。因此本發(fā)明創(chuàng)造性地應(yīng)用了多緩沖體系的反應(yīng)方法，實(shí)現(xiàn)了 EPO的可連續(xù)PEG化反應(yīng)，建立了ー種具有較高單取代率、較低多取代率的反應(yīng)方法。
圖I為EPO分子的氨基酸序列圖；圖2為純化產(chǎn)物mPEG-EPO的SEC-HPLC分析圖譜；圖3為純化產(chǎn)物mPEG-EPO的紫外光譜分析結(jié)果(從上到下M-PEG-SCM聚合物樣品；EP0原液樣品；純化產(chǎn)物mPEG-EPO樣品)；
圖4為純化產(chǎn)物mPEG-EPO的電泳分析結(jié)果(從左到右EP0原液樣品；分子量Marker樣品；M_PEG_SCM聚合物樣品；純化產(chǎn)物mPEG-EPO 樣品)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合相關(guān)實(shí)驗(yàn)和具體實(shí)施例并對(duì)照附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說(shuō)明。在實(shí)驗(yàn)和具體實(shí)施例中使用了兩種PEG試劑都來(lái)自北京鍵凱科技有限公司，分別是35KD的GLUC-PEG-NHS (葡萄糖聚こニ醇NHS酷)，以及35KD的M-PEG-SCM (甲氧基聚こニ醇こ酸酷)。所用的EPO原液，由深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司制備。實(shí)驗(yàn)ー PEG-EP0反應(yīng)液成分含量的長(zhǎng)期穩(wěn)定性用15ml塑料離心管，加入I. 63ml EPO原液(EP0含量3. 07mg/ml)，以及3. 37mlpH7. 5的40mM磷酸緩沖液，EPO的終濃度為lmg/ml。準(zhǔn)確稱量109. 4mg GLUC-PEG-NHS，加入1094 ill 2mM且pH3. 0的磷酸緩沖液溶解。溶解后，將GLUC-PEG-NHS溶液全部加入EPO中，試紙測(cè)定EPO溶液的pH為7. 5。反應(yīng)混合液放置于振蕩器上，室溫振蕩反應(yīng)2. 5小吋。反應(yīng)完畢后，取樣作SEC-HPLC檢測(cè)。SEC-HPLC檢測(cè)條件如下SEC-HPLC 柱GE superpose 6 分析柱流動(dòng)相PBS緩沖液HPLC 儀島津 HPLC，PDA 檢測(cè)器，LC solution 工作站檢測(cè)波長(zhǎng)280nm上樣量20ill流速0.5ml/min所得PEG-EPO反應(yīng)液未經(jīng)進(jìn)ー步處理，封閉保存于4°C冰箱中，在20個(gè)月后，重新取樣作SEC-HPLC檢測(cè)。結(jié)果列于表I。表1PEG-EP0反應(yīng)液成分含量的長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察的SEC-HPLC檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種重組人促紅素的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于EPO分子在第一種緩沖液中完成第一次PEG化反應(yīng)后至少還包括以下步驟將第一次PEG化反應(yīng)的反應(yīng)液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進(jìn)ー步加入PEG進(jìn)行第二次PEG化反應(yīng)，得到最終反應(yīng)液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于在得到最終反應(yīng)液前還包括以下若干步驟將前一次PEG化反應(yīng)的反應(yīng)液在與第一種緩沖液不同的緩沖液中進(jìn)ー步加入PEG進(jìn)行后一次PEG化反應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于在得到最終反應(yīng)液前還包括以下步驟將第二次PEG化反應(yīng)的反應(yīng)液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液或第三種緩沖液中進(jìn)ー步加入PEG進(jìn)行第三次PEG化反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于所述第一種緩沖液包括PH6. 5 7. 5的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的緩沖液包括與第一種緩沖液PH值不重疊的pH6. 0 9. 0的磷酸緩沖液、pH7. 4 9. 0的硼砂緩沖液、pH9. 0 12的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或pH4. 5 7. 0的醋酸緩沖液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于所述第一種緩沖液包括pH7. 2的磷酸緩沖液，所述與第一種緩沖液不同的緩沖液包括pH7. 4的磷酸緩沖液、PH7. 4的硼砂緩沖液、pH9. 3的硼砂-氫氧化鈉緩沖液或pH5. 8的醋酸緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于所述PEG化反應(yīng)方法包括將PEG與EPO混合反應(yīng)至少2小時(shí)，反應(yīng)pH值為7. 0 7. 5，所述PEG與EPO的摩爾比為10 25 1，所述PEG中聚こニ醇的分子量為30,000 40，000道爾頓。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于所述PEG與EPO的摩爾比為10 25 I為全部PEG化反應(yīng)步驟中PEG與EPO的摩爾比。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于所述PEG化反應(yīng)方法包括將PEG與EPO混合反應(yīng)為2. 5小時(shí)。
9.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的連續(xù)聚こニ醇化反應(yīng)方法，其特征在于還包括在最終反應(yīng)液中純化單取代PEG-EPO的步驟將最終反應(yīng)液經(jīng)疏水層析純化得到單取代PEG-EPO與PEG的混合物，再?gòu)膯稳〈鶳EG-EPO與PEG的混合物中分離得到單取代PEG-EP0。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，公開了一種重組人促紅素的連續(xù)聚乙二醇化反應(yīng)方法，其中，EPO分子在第一種緩沖液中完成第一次PEG化反應(yīng)后至少還包括以下步驟將第一次PEG化反應(yīng)的反應(yīng)液在與第一種緩沖液不同的第二種緩沖液中進(jìn)一步加入PEG進(jìn)行第二次PEG化反應(yīng)，得到最終反應(yīng)液。本發(fā)明應(yīng)用多緩沖體系的反應(yīng)方法，實(shí)現(xiàn)了EPO的可連續(xù)PEG化反應(yīng)，建立了一種具有較高單取代率、較低多取代率的PEG化反應(yīng)方法。
文檔編號(hào)C07K17/08GK102746405SQ20121025754
公開日2012年10月24日 申請(qǐng)日期2012年7月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月24日
發(fā)明者吳園園, 張向榮, 張滌平, 盛光陽(yáng), 鄭崇吉, 陳賢光, 黎雄輝 申請(qǐng)人:深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司