專利名稱：一種從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)的提取方法，具體涉及一種從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法。
背景技術(shù)：
雞蛋清中的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和哺乳動物母乳中的乳鐵蛋白類似，在生物體內(nèi)發(fā)揮著提高免疫功能、抵御細菌和病毒感染，維持機體正常生長發(fā)育的重要作用。尤其與鐵離子的高度親和性，使其在生物體內(nèi)擔當轉(zhuǎn)運鐵的重要任務，對哺乳動物鐵吸收起至關(guān)重要的作用。目前已有多種方法分離制備卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，但均存在一些缺點。早期主要采用鹽析法或有機溶劑沉淀法，獲得的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白純度不高，且經(jīng)過高鹽和有機溶劑處理后，蛋白的天然結(jié)構(gòu)和活性已遭到破壞。目前，主要采用液相層析法獲得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，但是目前的層析 法產(chǎn)品純度和得率不高，而且一般需采用離子交換層析與凝膠過濾層析或親和層析相結(jié)合的方法，多步層析法在各步層析之間往往需要更換緩沖液或?qū)θ芤哼M行濃縮，操作復雜，提取工藝耗時漫長，可達3飛天，此外，凝膠過濾層析處理量很小，而親和層析填料成本昂貴，這些問題嚴重制約著卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的提取。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，采用乙醇沉淀法與Q Sepharose FF陰離子交換層析相結(jié)合的技術(shù)方案，并確定了合適的工藝參數(shù)，克服了現(xiàn)有技術(shù)中操作復雜、處理量小、產(chǎn)品純度和得率低的問題。上述目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，包括以下步驟
(1)蛋清預處理向蛋清稀釋液中加入NaHCO3和NaCl，使?jié)舛确謩e為l(T50mmOl/L和2(Tl00mmOl/L，然后加入濃度為0. Olmol/L、體積為蛋清稀釋液2%的FeCl3，充分攪拌，得到飽和鐵的蛋清稀釋液；
(2)提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白向飽和鐵的蛋清稀釋液中加入乙醇，使乙醇的體積濃度達到35-45%，離心分離得上清液，凍干，即為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品；
(3)分離純化將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品溶解于pH為8.0-8. 5的Tris-HCl緩沖液中，用Q Sepharose FF色譜柱分離，用含有0、0. 06 0. 12、0. 25 0. 5和2 mol/L氯化鈉的pH為8. 0-8. 5的Tris-HCl緩沖液梯度洗脫，收集0. 06、. 12 mol/L氯化鈉的洗脫液，用水透析后冷凍干燥得到成品。步驟(I)中，所述蛋清稀釋液由雞蛋清與等體積水混合而成。步驟(I)中，加入NaHCO3和NaCl，優(yōu)選使?jié)舛确謩e為20mmol/L和50mmol/L。步驟(2)中，優(yōu)選使乙醇的體積濃度達到40%。本方法的有益效果是1、本發(fā)明對雞蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白進行鐵飽和的預處理后，提高了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的穩(wěn)定性，使其能夠在一定濃度的乙醇溶液中保持天然結(jié)構(gòu)，從而用一步乙醇沉淀即獲得富含卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的粗品。與目前常用的鹽析法相比，本方法可以減少層析前樣品的透析脫鹽步驟，大大簡化了工藝流程，縮短了提取周期；
2、得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品純度高，回收率好。選擇QSepharose FF作為離子交換層析填料，該填料具有生產(chǎn)成本低、性質(zhì)穩(wěn)定、適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。
圖I為不同濃度乙醇沉淀蛋清離心后上清液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖2為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品的陰離子交換層析圖譜。圖3為蛋清(I)、乙醇沉淀粗產(chǎn)品(2)、層析后產(chǎn)品(3)和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白標準品(4) 的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例I
一種從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，包括以下步驟
I、蛋清預處理
(1)將新鮮的雞蛋打蛋，使用蛋黃分離器分離蛋清和蛋黃，收集蛋清；
(2)取IOOOmL蛋清，邊攪拌邊向蛋清中加入等體積的蒸餾水，攪拌混合均勻，即得蛋清稀釋液；
(3)邊攪拌邊向蛋清稀釋液中加入3 4g碳酸氫鈉，使碳酸氫鈉的摩爾濃度為20mM左右，同時加入約6 9g氯化鈉，使氯化鈉的摩爾濃度為50mM左右，充分攪拌，然后加入40mL0. 01mol/L的FeCl3溶液，充分攪拌使蛋清中的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白充分鐵飽和。2、提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白
加入無水乙醇，使乙醇的終濃度為40%，攪拌lmin，此時溶液中產(chǎn)生沉淀，然后在4°C、轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/分鐘的條件下離心20分鐘，得到上清；凍干得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品。3、分離純化
(1)將QSepharose FF陰離子交換填料裝填入層析柱(50X5cm)中，用Tris-HCl緩沖液(pH8. 0,50mM),以2mL/min的流速平衡層析柱2小時；
(2)將得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品5g溶解于250mLTris-HCl緩沖液(pH8. 0,50mM)中，4°C下IOOOOXg離心10分鐘以除去少量不溶物，然后注入到陰離子交換層析柱中；
(3)先用Tris-HCl緩沖液(pH8.0,50mM)以2mL/min的流速沖洗層析柱，隨后分別用含有0. 08,0. 3和2M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(pH8. 0,50mM)以相同流速進行洗脫，收集0. 08M氯化鈉的洗脫液，用蒸餾水透析四次，冷凍干燥。4、SDS-聚丙酰胺凝膠電泳鑒定
采用12%濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。將待分析樣品的凍干粉稱取約10毫克，溶解于5毫升的雙蒸水中，充分溶解后取80微升溶液，加入20微升的蛋白上樣緩沖液(5倍濃度)，混勻后沸水浴加熱約5分鐘，冷卻后取5微升注入到點樣孔中，初始濃縮電壓80V,分離膠電壓為120V進行電泳。電泳完成后，首先使用固定液(50%乙醇，10%乙酸)對凝膠進行固定30分鐘，然后用考馬斯亮藍R-250溶液(R-250含量0. 1%，同時含有25%乙醇、8%乙酸)在45°C下染色30分鐘，染色完成后轉(zhuǎn)移至脫色液(25%乙醇和8%乙酸)中脫色，至背景顏色褪去、條帶清晰為止。不同濃度乙醇沉淀蛋清離心后上清液的電泳結(jié)果如圖I所示。隨著乙醇濃度的增力口，上清液中卵清蛋白的條帶(4(T55 kDa之間)逐漸變淺，當乙醇濃度為40%時，卵清蛋白條帶基本消失，上清液中主要為卵轉(zhuǎn)鐵蛋白，說明40%的乙醇濃度可以將絕大多數(shù)的卵清蛋白沉淀，從而獲得富含卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的上清液。將乙醇沉淀得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品經(jīng)陰離子交換層析分離，結(jié)果如圖2所示。將“洗脫峰2”進行電泳分析，結(jié)果見圖3，泳道廣4依次為蛋清、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白層析后樣品和卵轉(zhuǎn)鐵蛋白標準品，由圖可知，經(jīng)過層析后，卵轉(zhuǎn)鐵蛋白樣品純度已經(jīng)很高，接近標準品，表明采用本發(fā)明技術(shù)可以獲得高純度的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白。5、純度測定及回收率計算
(I)蛋白質(zhì)產(chǎn)品純度測定卵轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品的純度用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測·定。采用軟件(Gel-pro analyzer Version 4.0)分析圖3中電泳條帶2和條帶3,得到條帶2的純度為56. 23%，條帶3的純度為87. 54%。即經(jīng)過40%乙醇沉淀處理后的粗品純度為56. 23%，層析純化后純度為87. 54%。(2)回收率計算
根據(jù)從IOOOg雞蛋清中純化所得各種蛋白質(zhì)產(chǎn)品的質(zhì)量、蛋白含量和純度，使用以下公式計算所得的各個蛋白質(zhì)的回收率，
權(quán)利要求
1.一種從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)蛋清預處理向蛋清稀釋液中，加入NaHC03和NaCl，使?jié)舛确謩e為l(T50mmOl/L和20^100mmol/L,然后加入濃度為0. Olmol/L、體積為蛋清稀釋液2%的FeCl3溶液，充分攪拌，得到飽和鐵的蛋清稀釋液； (2)提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白向飽和鐵的蛋清稀釋液中加入乙醇，使乙醇的體積濃度達到35-45%，離心分離上清液，凍干，得卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品； (3)分離純化將卵轉(zhuǎn)鐵蛋白粗品溶解于pH為8-8.5的Tris-HCl緩沖液中，用QSepharose FF色譜柱分離，用含有0、0. 06、. 12、0. 25 0. 5和2 mol/L氯化鈉的pH為8-8. 5的Tris-HCl緩沖液洗脫，收集0. 06、. 12 mol/L氯化鈉的洗脫液，用水透析后冷凍干燥得到成品。
2.如權(quán)利要求I所述的從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，其特征在于，所述蛋清稀釋液由雞蛋清與等體積水組成。
3.如權(quán)利要求I所述的從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，其特征在于，步驟(I)中，加入NaHCO3和NaCl，使?jié)舛确謩e為20mmol/L和50mmol/L。
4.如權(quán)利要求I所述的從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，其特征在于，步驟(2)中，使乙醇的體積濃度達到40%。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從雞蛋清中提取卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的方法，是將蛋清稀釋液與鐵飽和后，采用乙醇沉淀與QSepharoseFF陰離子交換層析相結(jié)合實現(xiàn)的。本發(fā)明通過對雞蛋清中卵轉(zhuǎn)鐵蛋白進行鐵飽和，提高了卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的穩(wěn)定性，使其能夠在一定濃度的乙醇溶液中保持天然結(jié)構(gòu)，從而可用乙醇提取。本方法工藝流程簡單，提取周期短，得到的卵轉(zhuǎn)鐵蛋白產(chǎn)品純度高，回收率好。
文檔編號C07K1/30GK102796193SQ20121025481
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月23日
發(fā)明者馬美湖, 任國棟, 耿放, 袁小軍, 邱寧, 單媛媛 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學