一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法

專利名稱：一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人工抗原遞呈技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
癌癥是世界范圍內(nèi)僅次于心血管疾病的第二大嚴(yán)重威脅人類健康和生命的疾病，隨著分子生物學(xué)、免疫學(xué)和生物工程技術(shù)的快速發(fā)展，腫瘤免疫治療正成為繼腫瘤手術(shù)治療和放化療之后的另一種新的治療手段，免疫治療的目的在于使機(jī)體產(chǎn)生有效的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)從而治愈疾病，對(duì)感染性疾病和抗腫瘤而言是一種非常有前景的治療方法。一般認(rèn)為機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)中起重要作用的是細(xì)胞免疫，以T淋巴細(xì)胞為核心。T細(xì)胞的活化、增殖及分化為效應(yīng)細(xì)胞需要接受來自抗原提呈細(xì)胞(antigen-presenting cells, APC)所提供的雙重刺激信號(hào)一是T細(xì)胞受體(T cell rec印tor, TCR)與APC表面的MHC-抗原肽復(fù)合物的特異性識(shí)別和結(jié)合；二是APC和T細(xì)胞表面的多種共刺激分子和黏附分子之間(如 B7/CD28，LFA-l/ICAM-1，CD2/LFA-3 或 4-1BBL/4-1BB 等)的相互作用。這些共刺激分子及其受體在T細(xì)胞與APC相互作用時(shí)，以TCR: MHC-抗原肽復(fù)合體為中心聚集在一起，形成一種稱為免疫突觸的超分子結(jié)構(gòu)，成為T細(xì)胞活化信號(hào)傳遞的通道。免疫共刺激分子是誘發(fā)機(jī)體有效的細(xì)胞免疫反應(yīng)所必需的，目前已知的有B7-1、B7-2、B7-H4分子等，腫瘤細(xì)胞常常缺失B7這一類共刺激分子。B7-1和B7-2作為表達(dá)在抗 原呈遞細(xì)胞表面的主要的共刺激因子，均可與表達(dá)在淋巴細(xì)胞表面的配體CD28或CTLA-4結(jié)合來發(fā)揮作用。很多具有正常免疫力的宿主并不能有效排除體內(nèi)的高免疫原性腫瘤，可能是由于腫瘤細(xì)胞缺乏T細(xì)胞活化的共刺激信號(hào)，如腫瘤細(xì)胞常常缺失B7這一類共刺激分子，從而使CTLs不能有效地對(duì)腫瘤產(chǎn)生免疫應(yīng)答，如果給該腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染B7基因(CD80/CD86)，則可有效地激發(fā)T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫。研究表明，腫瘤細(xì)胞本身可通過減少B7-1、B7-2的表達(dá)，使得T細(xì)胞克隆無能；通過上調(diào)抑制性B7-H4分子的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。
因此，進(jìn)行免疫共刺激因子的有效呈遞是激活腫瘤免疫反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵。游離性基因工程表達(dá)的免疫共刺激分子同樣可以參與免疫活化過程，但游離的蛋白在體內(nèi)血漿清除率高，且作用缺乏特異性。樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DC)是體內(nèi)主要的抗原呈遞細(xì)胞之一，作為免疫系統(tǒng)中最強(qiáng)的APC，其可在體內(nèi)或體外作為免疫共刺激分子的天然載體參與免疫活化過程。但DC細(xì)胞的使用也有諸多局限性，如DC分離培養(yǎng)困難，耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，獲得DC的數(shù)量和質(zhì)量往往也不夠穩(wěn)定，且由于其表面的免疫共刺激因子種類多樣，因此其表面共刺激分子的特異性和復(fù)雜性都難于控制。有學(xué)者采用胞外體(exosome，ES)代替DC細(xì)胞，但同樣由于其表達(dá)多種T細(xì)胞共刺激分子，無法保持共刺激分子的特異性，增加了提呈的復(fù)雜性，降低了其特異性和穩(wěn)定性。為解決這一問題，近年來建立的人工抗原提呈技術(shù)利用表面攜帶有特定共刺激分子的人工抗原提呈細(xì)胞(artificial antigen presenting cells, AAPC)為抗原特異性T細(xì)胞提供刺激信號(hào)，有效的刺激了 T細(xì)胞的活化增殖。人工抗原提呈細(xì)胞是將MHC-抗原肽復(fù)合物及共刺激分子或者粘附分子展現(xiàn)在某種載體表面，通過與T細(xì)胞表面的受體有效識(shí)別和結(jié)合達(dá)到活化淋巴細(xì)胞的目的。目前制備的AAPC可分為以細(xì)胞性的AAPC和非細(xì)胞性的AAPC。細(xì)胞性AAPC主要是以細(xì)胞為載體，通過基因改造的方法在細(xì)胞表面偶聯(lián)共刺激分子，引發(fā)特異性免疫反應(yīng)，活化T細(xì)胞。常用的有K562細(xì)胞、K32細(xì)胞、鼠成纖維細(xì)胞等。但是，由于細(xì)胞性的AAPC在制備過程中對(duì)細(xì)胞基因的改造過程繁瑣，多采用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)而存在一定的安全隱患，且其載體細(xì)胞也多為異種細(xì)胞，因而目前細(xì)胞性APCC僅適合于體外應(yīng)用，體內(nèi)運(yùn)用的遠(yuǎn)期效果和安全性評(píng)價(jià)還有待進(jìn)一步研究。非細(xì)胞性的AAPC則指的是在人工載體表面交聯(lián)不同的MHC-抗原肽復(fù)合物及共刺激分子。目前常用的人工載體包括磁珠、脂質(zhì)體和乳膠微球等。其表面可直接或間接交聯(lián)各種共刺激分子。由于磁珠的制備比較昂貴，也有人用細(xì)胞大小的聚乙烯乳膠微球外包被 抗體層偶聯(lián)相應(yīng)的肽四聚體或二聚體及共刺激分子作為人工APC。但目前非細(xì)胞性人工載體進(jìn)行共刺激分子的呈遞也有其局限性。其制備過程需要采用化學(xué)交聯(lián)或生物素親和素修飾，工藝過程相對(duì)復(fù)雜，且容易有化學(xué)物殘留等安全問題。脂質(zhì)體是另一種可用于免疫共刺激分子呈遞的非細(xì)胞載體。脂質(zhì)體是由磷脂、膽固醇等為膜材包合而成的納米級(jí)顆粒。1998年van Rensen等率先以脂質(zhì)體為載體融人HSP65-鼠MHC II復(fù)合物，構(gòu)建成人工APC，不僅能特異性地激活T細(xì)胞,還能誘導(dǎo)IL-2分泌。2000年P(guān)rakken等研究發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)體構(gòu)建的人工APC能與T細(xì)胞作用形成免疫突觸，可鑒別和活化T細(xì)胞，提示脂質(zhì)體人工APC可用于腫瘤的免疫治療。以脂質(zhì)體為載體構(gòu)建的人工APC可在體外大量制備，易于控制質(zhì)量。但脂質(zhì)體的使用在包封率、穩(wěn)定性及靶向分布等方面存在一些問題，而且由于常規(guī)工藝生產(chǎn)規(guī)模難以放大，且需要大量使用有機(jī)溶劑，難以保證產(chǎn)品的安全性，導(dǎo)致其大量應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法，利用負(fù)載免疫共刺激分子的疏水顆粒與目標(biāo)細(xì)胞的有效識(shí)別與結(jié)合，實(shí)現(xiàn)免疫激活作用。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，包括疏水性的納米級(jí)或微米級(jí)的微球，微球表面上呈遞有遞免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通過親脂蛋白或疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域與微球相連接。所述的免疫共刺激分子與親脂蛋白或疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域是由融合基因表達(dá)并純化的融合蛋白，免疫共刺激分子與親脂蛋白或疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間還設(shè)有連接肽；融合蛋白通過親脂蛋白或疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域與疏水性的微球表面的相互作用，將免疫共刺激分子固定化呈遞于微球表面。所述的微球是由疏水性高分子材料制備的，疏水性高分子微球材料為PHA，由聚羥基丁酸酯、聚羥基辛酸酯、聚羥基癸酸酯、羥基丁酸-羥基戊酸共聚酯、羥基丁酸-羥基己酸共聚酯、羥基丁酸-羥基辛酸共聚酯、羥基丁酸-羥基戊酸-羥基己酸共聚酯中的一種或幾種聚合而成；或者疏水性高分子微球材料為聚乳酸、羥基己酸和乳酸共聚物中的一種；或者疏水性高分子微球材料為聚己內(nèi)酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己內(nèi)酯、聚己二醇中的一種或幾種聚合物組成。所述的親脂蛋白為PhaP、PhaZ, PhaR、PhaC中的一種，所述的疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)镻haP> PhaZ> PhaR、PhaC中疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一種。所述的免疫共刺激分子選自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、IC0S 中的一種或幾種。所述的連接肽的長(zhǎng)度為10 15個(gè)氨基酸殘基。所述的微球?yàn)橛煽山到獾氖杷訮HA材料制成，所述的融合蛋白為B7-2_PhaP，連接肽為 G4SG3SG2S。 一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球的制備方法，包括以下步驟I)免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白的構(gòu)建分別擴(kuò)增待呈遞的免疫共刺激分子、親脂蛋白的核苷酸序列，并通過PCR擴(kuò)增技術(shù)將兩者通過連接肽連接得到融合基因；然后通過基因的剪切和連接，構(gòu)建成表達(dá)載體并在轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)；裂解細(xì)胞并通過蛋白提純得到免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白；2)疏水性微球的構(gòu)建將PVA溶液至于冰浴中，然后加入溶解有高分子疏水材料聚合物的氯仿溶液，超聲處理5 IOmin后,再在磁力攪拌器上溫和攪拌5 IOh,離心收集微球，并用水充分洗滌；最后用水重懸微球；3)負(fù)載結(jié)合將融合蛋白用水溶解后，加入到微球的懸浮液中，混勻，4°C攪拌過夜；離心，收集微球，得到融合蛋白負(fù)載的微球。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明提供的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，是利用生物可降解的疏水性高分子材料制備微米或納米微球，將親脂蛋白與目標(biāo)免疫共刺激分子進(jìn)行融合表達(dá)，通過親脂蛋白與疏水材料顆粒表面的相互作用，將免疫共刺激分子固定化表達(dá)呈遞于疏水材料顆粒表面，既可作為一種新型人工抗原提呈系統(tǒng)的共刺激分子呈遞部分，也可以單獨(dú)的作為提高機(jī)體免疫激活效果的固定化免疫共刺激因子使用。本發(fā)明提供的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，選用人工可降解的、生物相容性高的高分子材料制備微球，所以得該系統(tǒng)具有良好的生物相容性和生物安全性；而將親脂蛋白的編碼基因和各種免疫共刺激分子編碼基因通過基因工程操作分別進(jìn)行融合表達(dá)，這樣通過融合基因的構(gòu)建，就可以實(shí)現(xiàn)多種免疫共刺激分子的遞呈，實(shí)現(xiàn)遞呈分子的多樣化；進(jìn)一步，還可以在同一微球表面上遞呈多種免疫共刺激分子，提高對(duì)免疫細(xì)胞的刺激。本發(fā)明利用能與疏水性高分子材料很好結(jié)合的親脂蛋白，通過其與免疫共刺激分子融合表達(dá)，可以有效的將免疫共刺激分子固定化呈遞在高分子材料微球表面。這樣就省去了化學(xué)交聯(lián)法的繁瑣工藝，避免了交聯(lián)過程中可能造成的蛋白質(zhì)變性或化學(xué)物質(zhì)殘留的問題。也不需要對(duì)載體或融合蛋白進(jìn)行生物素或親和素的修飾后再進(jìn)行融合蛋白固定化，因此具有簡(jiǎn)便、快捷、低成本的特點(diǎn)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明采用的疏水性PHA材料作為微球載體進(jìn)行免疫共刺激分子的固定化，由于PHA是一種具有良好生物相容性的生物可降解材料，其在生物體內(nèi)可被完全降解成二氧化碳和水，不存在體內(nèi)長(zhǎng)期蓄積的隱患，因此，具有良好的安全性，具備體內(nèi)應(yīng)用如景。在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用聚乳酸(PLA)，羥基己酸和乳酸共聚物(PLGA)，聚己內(nèi)酯(PCL)等常見的疏水性材料作為免疫共刺激分子固定化呈遞載體，因其價(jià)格更為低廉且更易獲得，可以使本發(fā)明所述的免疫共刺激分子固定化呈遞系統(tǒng)具有更廣泛的應(yīng)用前景。


圖I是免疫共刺激分子固定化呈遞系統(tǒng)模式圖；圖2中的A、B、C分別是B7-2、PhaP、B7_2_PhaP基因的擴(kuò)增圖譜；圖3是表達(dá)載體pGEX-B72-P的質(zhì)粒圖譜；圖4中的A、B分別是B7-2_PhaP基因表達(dá)后的PCR鑒定結(jié)果和雙酶切鑒定結(jié)果·圖；圖5為B7-2_PhaP融合蛋白表達(dá)SDS-PAGE檢測(cè)圖；圖6為B7_2_PhaP融合蛋白表達(dá)后Western Blot鑒定圖；圖7為B7-2_PhaP融合蛋白與PHA納米顆粒結(jié)合情況的Western Blot檢測(cè)圖；圖8為負(fù)載B7-2_PhaP蛋白的PHA納米顆粒對(duì)人淋巴細(xì)胞體外增殖的影響圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供的一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球。參見圖1，首先親脂性蛋白和免疫共刺激分子通過基因工程表達(dá)成為一個(gè)一段親脂性的融合蛋白，然后通過親脂蛋白結(jié)構(gòu)域與疏水性材料的吸附作用黏附在可降解微納米顆粒表面，成為免疫共刺激分子固定化表達(dá)呈遞的載體。以固定化的T細(xì)胞活化第二信號(hào)參與免疫激活過程，利用負(fù)載免疫共刺激分子的疏水顆粒與目標(biāo)細(xì)胞的有效識(shí)別與結(jié)合，實(shí)現(xiàn)免疫激活作用。在上述三個(gè)環(huán)節(jié)中，微球要求是疏水性、良好生物相容性、可降解的材料即可。其中，疏水性一方面是為了能夠與親脂蛋白黏附，另一方面是為了在接近細(xì)胞時(shí)能夠與細(xì)胞膜相互作用，便于抗原遞呈。而生物相容性、可降解是為了提高安全性的考慮。在具體的材料選擇上可以為PHA、聚乳酸(PLA)、羥基己酸和乳酸共聚物(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)；PHA，由聚羥基丁酸酯、聚羥基辛酸酯、聚羥基癸酸酯、羥基丁酸-羥基戊酸共聚酯、羥基丁酸-羥基己酸共聚酯、羥基丁酸-羥基辛酸共聚酯、羥基丁酸-羥基戊酸-羥基己酸共聚酯中的一種或幾種聚合而成；聚乳酸、羥基己酸和乳酸共聚物中的一種；聚己內(nèi)酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己內(nèi)酯、聚己二醇中的一種或幾種聚合組成。免疫共刺激分子選自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、IC0S 中的一種或幾種，請(qǐng)說明免疫共刺激分子選擇的理由親脂蛋白為PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中的一種，這些蛋白含有能夠和疏水性高聚物非特異結(jié)合的疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域，可作為蛋白固定化呈遞于高聚物表面的介導(dǎo)分子。下面結(jié)合具體的PHA、B7_2、PhaP組合的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限定。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠?qū)M足三個(gè)環(huán)節(jié)的要求的材料進(jìn)行組合。I、免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建I. IPCR擴(kuò)增人B7-2基因和phaP序列根據(jù)NCBI上登陸號(hào)為NC_000003. 11和AM260479. I的人B7-2基因和phaP基因DNA序列設(shè)計(jì)引物pl/p2、p3/p4，分別擴(kuò)增編碼人B7-2胞外端的基因(52_672bp)和編碼PhaP 的基因(10-580bp)。根據(jù)重疊延伸法設(shè)計(jì)引物在B7-2胞外端的下游引物p2和phaP的基因上游引物P3之間有16bp的重復(fù)序列，包含一個(gè)由36個(gè)堿基編碼的12個(gè)氨基酸的柔性linker(G4SG3SG2S)，使phaP基因和B7-2基因用該linker連接在一起。引物如下所示P IGCGGATCCATGGCTCCTCTGAAGATTC ； P2 ACCAGAGCCACCTCCTGAACCGCCTCCACCTGTAATCCAAGGAATG ；P3 GGTTCAGGAGGTGGCTCTGGTGGATCGCTCACCCCGGAACAAGTT ；P4 CGCTCGAGAGCCGTCGTCTTCTTTGCCGT ；PCR 反應(yīng)體系(25 μ I ):5 X Primer STAR buffer 5 μ l,dNTP Mix 2μ Ι,ρΙΟ. 5μ I,ρ20· 5 μ I，Primer STARO. 3 μ I，DDW15. 7 μ I，Β7-2 (IgV+C)/TEasyl μ I。以含人Β7-2序列的Β7-2 (IgV+C)/TEasy質(zhì)粒為模板，克隆B7-2胞外區(qū)。B7-2胞外區(qū)亞克隆PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性3min ;94°C變性lmin、76. 9°C退火lmin、72°C延伸Imin，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保溫。以提取到的帶有phaP基因的pP’PI-EGFP (由清華大學(xué)生命科學(xué)院陳國強(qiáng)教授惠贈(zèng))為模板擴(kuò)增PhaP基因。phaP基因亞克隆PCR反應(yīng)條件如下94°C預(yù)變性3min ;94°C變性lmin、83°C退火lmin、72°C延伸Imin，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸5min，4°C保溫。I. 2重疊延伸PCR法拼接B7-2和phaP編碼序列分別回收純化的上述PCR擴(kuò)增的B7-2和phaP片段，然后按I : I的摩爾比例混合物互為模板和引物，利用重疊延伸PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)的B7-2-PhaP。PCR 反應(yīng)體系(25 μ I)為5 X Primer STAR buffer 5μ I, dNTP Mix 2μ I,Β7-21 μ 1，phaP I μ I, Primer STAR O. 3 μ I, DDff 15. 7μ I ；PCR 反應(yīng)條件為94°C變性 3min ；94°C 30s，61。。I. 5min，72°C延伸 I. 5min，4 個(gè)循環(huán)；第一次循環(huán)后兩個(gè)片段在互補(bǔ)的部位會(huì)準(zhǔn)確拼接并且延伸得到編碼B7-2和phaP的兩條完整的鏈，在后續(xù)的循環(huán)中以這兩條鏈為模板，以P1/P4為引物，大量擴(kuò)增B7-2-PhaP基因完整的編碼序列。上述B7-2、PhaP、B7-2_PhaP基因的擴(kuò)增圖譜分別如圖2中的A、B、C、所示，其中泳道I為擴(kuò)增的條帶，泳道2為mark。I. 3重組基因B7-2_PhaP表達(dá)質(zhì)粒pGEX_B72_P的構(gòu)建將擴(kuò)增得到的B7-2_PhaP編碼序列DNA片段用凝膠分離純化后，經(jīng)BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切。同時(shí)用BamHI、XhoI雙酶切表達(dá)載體pGEX_4T_3。膠回收PCR產(chǎn)物及線性表達(dá)載體酶切產(chǎn)物。將回收到的PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體16°C連接過夜，構(gòu)建表達(dá)載體PGEX-B72-P，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，并對(duì)轉(zhuǎn)化菌株做PCR及雙酶切鑒定。所構(gòu)建的表達(dá)載體pGEX_B72_P的質(zhì)粒圖譜如圖3所示,其中LacPromoter Lac啟動(dòng)子；GST Tag :GST標(biāo)簽；B7_2 :免疫共刺激分子B7_2 ；PhaP :親脂蛋白；Amp :氨芐青霉素抗性基因。免疫共刺激分子B7-2編碼基因和親脂蛋白PhaP編碼基因插入到GST標(biāo)簽下游，在Lac啟動(dòng)子啟動(dòng)下表達(dá)出B7-2_PhaP融合蛋白。I. 3. I將pGEX-B72-P載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α 取100 μ I感受態(tài)細(xì)胞，加入2μ I待轉(zhuǎn)連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30min。將離心管42°C熱激90s。快速將離心管放入到冰上，使其冷卻2min。每管加入800 μ I不含抗生素的LB培養(yǎng)基,于37°C搖床低速培養(yǎng)lh。低速離心，棄去約500 μ I上清，取剩余100 μ I菌液直接涂布于含50 μ g/mlAmp的LB固體培養(yǎng)皿上。 平板于37°C正向放置至液體被吸收，置平板于37°C培養(yǎng)12_16h。I. 3. 2重組陽性克隆質(zhì)粒的篩選用滅菌牙簽挑取轉(zhuǎn)化平板中的菌落10個(gè)，接種于含有50 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)基中，37 °C、200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒。重組pGEX-B72-P質(zhì)粒的PCR鑒定以提取的質(zhì)粒為模板，pl、p4為引物，做PCR擴(kuò)增檢測(cè)，反應(yīng)條件和體系同重疊延伸PCR法擴(kuò)增B7-2-PhaP融合基因。O. 7%瓊脂糖凝膠泳分析PCR結(jié)果。PCR鑒定結(jié)果如圖4中的A所示，其中泳道I為Marker，泳道2為B7_2_PhaP擴(kuò)增產(chǎn)物，其大小為1290bp。酶切鑒定對(duì)pGEX-B72-P質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI做雙酶切鑒定。室溫酶切過夜，O. 7%瓊脂糖凝膠電泳分析雙酶切結(jié)果。酶切驗(yàn)證電泳圖如圖4中的B所示，其中泳道I為BamH I /Xho I雙酶切，泳道2為Marker ;重組質(zhì)粒pGEX_B72_P經(jīng)BamH I /Xho I雙酶切后，得到大小為1290bp和4900bp左右的兩條帶，和質(zhì)粒理論大小一致。I. 3. 5重組質(zhì)粒pGEX-B72-P的序列測(cè)定及分析PCR及雙酶切初步鑒定正確后，將含重組質(zhì)粒PGEX-B72-P的陽性菌株送上海奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序。融合基因的序列如SEQ. ID. NO. I所示測(cè)序結(jié)果表明所構(gòu)建的載體序列正確。2、B7-2_PhaP融合蛋白的原核表達(dá)及分離純化2. I在表達(dá)宿主E. coll BL21 (DE3)內(nèi)的誘導(dǎo)表達(dá)含PGEX-B72-P質(zhì)粒的表達(dá)載體在宿主菌中被異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒PGEX-B72-P通過常規(guī)CaCl2法轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主大腸桿菌E. coliBL21(DE3)中，挑取陽性克隆，37°C 2XYT培養(yǎng)至0D600值O. 6左右，加入IPTG至終濃度
O.4mM\L, 237rpm30°C搖床培養(yǎng)5h，裂解菌體，SDS-PAGE檢測(cè)，觀察目的蛋白表達(dá)情況。2. 2B7-2-PhaP 蛋白的 SDS-PAGE 檢測(cè)及鑒定收集O. 5ml菌體，加入20ulPBS重懸，與20ul 2 X SDS凝膠加樣緩沖液混合后，煮沸l(wèi)Omin，進(jìn)行8%SDS-PAGE全菌蛋白電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳安裝Bio-Rad電泳裝置，灌制5%積層膠和下層8%分離膠，各需凝固約lh。將上述已制備好了的樣品依順序加樣，每孔約20μ I。電泳起始，調(diào)電壓為90V,當(dāng)染料前沿達(dá)分離膠后，調(diào)電壓至110V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)染料前沿到達(dá)分離膠底部時(shí)，停止電泳。取下凝膠置于考馬斯亮藍(lán)染液中室溫染色2-4小時(shí)，放入脫色液中脫色直至凝膠條帶清晰、背景透明為止，觀察電泳結(jié)果。Western檢測(cè)方法首先進(jìn)行8%SDS_PAGE，步驟同前，電泳結(jié)束后取出凝膠，依照彩虹Marker位置切取目的凝膠，利用Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)，依次序安裝轉(zhuǎn)印裝置陽極一墊片一濾紙一硝酸纖維素濾膜(NC膜)一凝膠一濾紙一墊片一陰極。安裝過程中修整濾紙和NC膜，兩邊濾紙不能接觸，凝膠最好大一些。內(nèi)槽加入電轉(zhuǎn)緩沖液，外槽加入部分冰塊，轉(zhuǎn)印電壓70V，電流200mA，轉(zhuǎn)印2h。轉(zhuǎn)印結(jié)束后拆卸裝置，NC膜用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2h，(為檢查蛋白轉(zhuǎn)印是否完全可將凝膠繼續(xù)置于考馬斯亮藍(lán)染液中染色、脫色)用TBST緩沖液I :1000稀釋的抗GST的小鼠IgG 4°C孵育過夜。孵育結(jié)束用TBST緩沖液洗膜3次，每次lOmin，之后用羊抗鼠IgG 二抗室溫孵育2h，TBST同樣條件洗膜3次。最后在酶聯(lián)生色底物中孵育Imin,曝光。2. 3B7-2-PhaP蛋白的分離純化常規(guī)方法裂解菌體，12000g高速離心20min取上清備用。
利用GS4B (Glutathione Sepharose 4B)樹脂純化目的蛋白。GS4B樹脂的準(zhǔn)備取L 33ml GS4B樹脂移入15ml離心管中，500g離心5min，棄上清。加入10倍體積預(yù)冷的PBS，清洗樹脂，500g離心5min，棄上清。重復(fù)I次。加入lmlPBS，制備50%樹脂懸液。將菌體裂解離心后收集的上清液移入已準(zhǔn)備好的樹脂中，室溫旋轉(zhuǎn)孵育O. 5h，500g離心5min,棄上清。加入10倍體積預(yù)冷的PBS,輕柔混勻,洗漆樹脂。500g離心5min,棄上清。重復(fù)2次。加入2ml谷胱甘肽洗漆液,重懸樹脂,室溫輕柔混勻lOmin。500g離心5min,收集
上清。重復(fù)二次。將用透析袋承裝的蛋白洗脫液放入IL O. 9%NaCl溶液中置于攪拌器上4°C透析，每隔3-4h換液一次，至少透析24h。之后將透析袋放入PEG20000濃縮，得到純化后的融合蛋白B7_2_PhaP,置于冷凍干燥機(jī)冷凍干燥備用。圖5及圖6顯示了 B7-2_PhaP融合蛋白的表達(dá)、分離純化及Western鑒定情況。圖5中泳道I為含PGEX-B72-P質(zhì)粒的陽性克隆經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后菌體裂解蛋白電泳條帶；泳道
2為含pGEX-4T-3空載體菌株GST純化條帶；泳道3、4為陽性克隆菌體裂解后上清蛋白經(jīng)GS4B樹脂純化產(chǎn)物電泳條帶；泳道5為空白E. coli BL21裂解后蛋白純化條帶；泳道6為蛋白Marker條帶。可見泳道3，4純化得到單一的條帶，且大小與目的蛋白相符。由圖3所示，誘導(dǎo)菌體及經(jīng)GST柱純化后的樣品中存在一條相對(duì)分子質(zhì)量約80000的蛋白富集條帶，可知有目的蛋白表達(dá)。只含空質(zhì)粒PGEX-4T-3的陰性對(duì)照E. coIiBL21可見一條相對(duì)分子量約26000的蛋白條帶，表明GST表達(dá)正常。圖6中泳道1、2為含pGEX-B72-P質(zhì)粒的陽性克隆經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后菌體裂解物與抗GST標(biāo)簽抗體孵育后檢測(cè)得到的條帶；泳道3為空白E. coli BL21菌體裂解物與抗GST標(biāo)簽抗體孵育后的檢測(cè)結(jié)果。泳道1、2中可見明顯的雜交條帶，說明其中含有B7-2-PhaP融合蛋白。上述檢測(cè)表明，在對(duì)pGEX-B72-P質(zhì)粒的陽性克隆經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后產(chǎn)生了 B7_2_PhaP融合蛋白，經(jīng)過菌體裂解后上清蛋白分離純化后得到了純度較高的B7-2-PhaP融合蛋白。
3、負(fù)載B7-2_PhaP的PHA (聚羥基脂肪酸酯)納米顆粒的制備3. IPHA納米顆粒的制備稱取2g分子量10000的PVA (聚乙烯醇)，溶解在200ml雙蒸水中，配成1%PVA (w/v), O. 45 μ m濾器過濾,備用。將20mg的聚合物PHA加入Iml氯仿中，攪拌溶解。取5ml 1%PVA冰浴中超聲，用注射器緩慢加入Iml溶解有PHA的氯仿溶液，超聲處理5min后(20kHz，40%最大功率)，將分散的溶液在磁力攪拌器上溫和攪拌6h。18000g下離心IOmin收集納米顆粒,并用雙蒸水洗漆兩次后重懸于5ml雙蒸水中。
O.45 μ m濾器過濾,定容。3. 2純化B7-2_PhaP融合蛋白與PHA納米顆粒結(jié)合
·
將凍干粉狀B7-2_PhaP融合蛋白用雙蒸水溶解，終濃度為90 μ g/ml，將4ml融合蛋白溶液加入到Iml濃度為2mg/ml的PHA顆粒溶液中，輕柔混勻，4°C攪拌過夜。將攪拌過夜的混合液12000g離心30min，棄上清，沉淀用雙蒸水洗兩次，即得負(fù)載B7-2-PhaP蛋白的PHA納米顆粒。將所得負(fù)載B7-2-PhaP蛋白的PHA納米顆粒與SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5min，12000g離心3min,取上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳及Western檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果如圖7所示，泳道1，2為與PHA顆粒共同孵育之前的B7_2_PhaP蛋白樣品；泳道3，4為B7-2-PhaP與PHA納米顆粒孵育后顆粒表面結(jié)合的蛋白條帶；泳道5，6為B7-2-PhaP與PHA納米顆粒孵育后上清中蛋白條帶；泳道7為彩虹Marker條帶。泳道3、4中可見明顯的雜交條帶，而泳道5、6中沒有檢測(cè)到明顯的條帶，說明融合蛋白經(jīng)透析除鹽后全部與顆粒結(jié)合，每毫克納米顆粒至少可以結(jié)合180 μ g重組目的蛋白。4、固定化免疫共刺激分子對(duì)淋巴細(xì)胞的免疫激活作用。4. I淋巴細(xì)胞的分離培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的分離使用淋巴細(xì)胞分離液(PAN Biotech1Aidenbach,德國)。具體方法為取2-3ml肝素抗凝靜脈血，用PBS稀釋I倍，混勻。沿管壁緩緩加入到IOml淋巴細(xì)胞分離液中，2000g水平離心20min。吸取中間灰白色層即單個(gè)核細(xì)胞層，移入另一離心管中。加入5倍以上體積的PBS液混勻，離心1500g，IOmin,棄上清。同樣方法重復(fù)洗一次。最后用1640營養(yǎng)液配制成1-2X 106/ml細(xì)胞懸液。4. 2固定化免疫共刺激分子對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響取96孔板每孔加100 μ I (1-2X IO5細(xì)胞)細(xì)胞懸液進(jìn)行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)(培養(yǎng)基為1640營養(yǎng)液)，置37°C、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)，各孔分別加入植物血凝素，anti-⑶3抗體，anti-CD3+GST, B7-2-PhaP, anti-CD3+B7-2_PhaP, B7-2-PhaP-NP, anti-CD3+B7-2-PhaP_NP和不攜帶B7-2-PhaP融合蛋白的空白納米顆粒(NP)對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行處理。培養(yǎng)72h后每孔加MTT溶液20 μ 1，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。500g離心lOmin，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加200 μ I DMS0，于微孔板振蕩器振蕩lOmin，使結(jié)晶物充分融解。選擇570nm波長(zhǎng)，并以630nm作為參考波長(zhǎng)在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值。淋巴細(xì)胞增殖情況如圖8所示，體外分離培養(yǎng)的人外周血淋巴細(xì)胞按I X IO4個(gè)/孔接種于96孔板中，分別進(jìn)行不同處理后并在體外培養(yǎng)72小時(shí)后進(jìn)行MTT檢測(cè)。I組為體外培養(yǎng)的對(duì)照組淋巴細(xì)胞，將其設(shè)為100% ；2組添加了植物血凝素(1/256稀釋)培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞相對(duì)增殖活力，其作為陽性對(duì)照，說明體外分離培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞經(jīng)適當(dāng)刺激能夠發(fā)生體外增殖；3組添加了抗⑶3抗體；4組添加了 PHA納米顆粒；5組添加了負(fù)載B7-2-PhaP的PHA納米顆粒；6組添加了負(fù)載B7-2-PhaP的PHA納米顆粒+抗⑶3抗體。**代表P < O. Ol由圖中可以看出，體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞經(jīng)植物血凝素(1/256稀釋)刺激能夠得以增殖，說明淋巴細(xì)胞活力良好，而單獨(dú)采用抗CD3抗體不能使淋巴細(xì)胞發(fā)生明顯的體外增殖?？瞻譖HA納米顆粒、負(fù)載B7-2-PhaP的PHA納米顆粒以及負(fù)載B7_2_PhaP的PHA納米顆粒加抗CD3抗體共同刺激均可以使淋巴細(xì)胞在體外大量增殖，能夠有效激活淋巴細(xì)胞。且負(fù)載B7-2-PhaP的PHA納米顆粒加抗CD3抗體對(duì)淋巴細(xì)胞體外擴(kuò)增的程度最高。由結(jié)果可知，固定化呈遞于PHA納米顆粒上的免疫共刺激分子能夠刺激淋巴細(xì)胞增殖，當(dāng)使用抗CD3抗體作為T細(xì)胞活化的第一信號(hào)時(shí)，淋巴細(xì)胞的活化增殖被進(jìn)一步加 強(qiáng)。由此可以說明，本發(fā)明所述的免疫共刺激分子固定化表達(dá)呈遞系統(tǒng)可以作為淋巴細(xì)胞活化的信號(hào)增強(qiáng)體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的活化增殖。
權(quán)利要求
1.一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，包括疏水性的納米級(jí)或微米級(jí)的微球，微球表面上呈遞有遞免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通過親脂蛋白或疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域與微球相連接。
2.如權(quán)利要求I所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的免疫共刺激分子與親脂蛋白或疏水結(jié) 合結(jié)構(gòu)域是由融合基因表達(dá)并純化的融合蛋白，免疫共刺激分子與親脂蛋白或疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間還設(shè)有連接肽； 融合蛋白通過親脂蛋白或疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域與疏水性的微球表面的相互作用，將免疫共刺激分子固定化呈遞于微球表面。
3.如權(quán)利要求I或2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的微球是由疏水性高分子材料制備的，疏水性高分子微球材料為PHA，由聚羥基丁酸酯、聚羥基辛酸酯、聚羥基癸酸酯、羥基丁酸-羥基戊酸共聚酯、羥基丁酸-羥基己酸共聚酯、羥基丁酸-羥基辛酸共聚酯、羥基丁酸-羥基戊酸-羥基己酸共聚酯中的一種或幾種聚合而成； 或者疏水性高分子微球材料為聚乳酸、羥基己酸和乳酸共聚物中的一種； 或者疏水性高分子微球材料為聚己內(nèi)酯，由聚甲基丙烯酸甲酯、聚己內(nèi)酯、聚己二醇中的一種或幾種聚合物組成。
4.如權(quán)利要求I或2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的親脂蛋白為PhaP、PhaZ、PhaR、PhaC中的一種，所述的疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)镻haP、PhaZ、PhaR、PhaC中疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域中的一種。
5.如權(quán)利要求I或2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的免疫共刺激分子選自B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、ICOS中的一種或幾種。
6.如權(quán)利要求2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的連接肽的長(zhǎng)度為10 15個(gè)氨基酸殘基。
7.如權(quán)利要求2所述的固定化呈遞免疫共刺激分子的微球，其特征在于，所述的微球?yàn)橛煽山到獾氖杷訮HA材料制成，所述的融合蛋白為B7-2-PhaP，連接肽為G4SG3SG2S。
8.一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 O免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白的構(gòu)建分別擴(kuò)增待呈遞的免疫共刺激分子、親脂蛋白的核苷酸序列，并通過PCR擴(kuò)增技術(shù)將兩者通過連接肽連接得到融合基因；然后通過基因的剪切和連接，構(gòu)建成表達(dá)載體并在轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，誘導(dǎo)表達(dá)載體在宿主細(xì)胞中表達(dá)；裂解細(xì)胞并通過蛋白提純得到免疫共刺激分子-親脂蛋白融合蛋白； 2)疏水性微球的構(gòu)建將PVA溶液至于冰浴中，然后加入溶解有高分子疏水材料聚合物的氯仿溶液，超聲處理5 IOmin后，再在磁力攪拌器上溫和攪拌5 IOh,離心收集微球，并用水充分洗滌；最后用水重懸微球； 3)負(fù)載結(jié)合將融合蛋白用水溶解后，加入到微球的懸浮液中，混勻，4°C攪拌過夜；離心，收集微球，得到融合蛋白負(fù)載的微球。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固定化呈遞免疫共刺激分子的微球及其制備方法，包括疏水性的納米級(jí)或微米級(jí)的微球，微球表面上呈遞有遞免疫共刺激分子，免疫共刺激分子通過親脂蛋白或疏水結(jié)合結(jié)構(gòu)域與微球相連接。既可作為一種新型人工抗原提呈系統(tǒng)的共刺激分子呈遞部分，也可以單獨(dú)的作為提高機(jī)體免疫激活效果的固定化免疫共刺激因子使用。
文檔編號(hào)C07K17/08GK102718869SQ20121018472
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者劉倩倩, 盧曉云, 張雅利, 李明川, 王蕾蕾 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)