專利名稱：基于固相合成的多肽的切割法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的是基于固相合成的多肽的一種切割方法，是根據(jù)肽序中氨基酸的不同而選用不同的切割液并能洗脫出多肽的一種切割方法。
背景技術(shù)：
多肽(polypeptide)是a —氨基酸以肽鏈連接在一起而形成的化合物,也是蛋白質(zhì)水解的中間產(chǎn)物，簡稱為肽。由兩個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物叫做二肽，同理類推還有三肽、四肽、五肽……一直到九肽。通常由10 100氨基酸分子脫水縮合而成的化 合物叫多肽。它們的分子量低于10，OOODa (Dalton道爾頓)，能透過半透膜，不被三氯乙酸及硫酸銨所沉淀。多肽有生物活性多肽和人工合成多肽兩種。生物提取的多肽具有很強(qiáng)的活性，所以叫做活性肽。只有活性肽才能對人體產(chǎn)生很好的效果。但是人工合成的多肽有很多是沒有活性的，是需要篩選的，只有活性肽才能被人體安全使用。人體的很多活性物質(zhì)都是以肽的形式存在的。肽涉及人體激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長和生殖各領(lǐng)域，是涉及人體內(nèi)多種細(xì)胞功能的重要物質(zhì)，是人體重要的生理調(diào)節(jié)物，具有重要的生物學(xué)功能。肽對生命的存在非常重要。多肽合成是一個(gè)重復(fù)添加氨基酸的過程，總的來說分成兩種固相合成和液相多肽合成。1963年，Merrifield首次提出固相多肽合成方法(SPPS)，這是在多肽化學(xué)研究上具有里程碑意義的合成方法。Merrifield經(jīng)過反復(fù)篩選，放棄了芐氧羰基(Z)在固相上的使用，發(fā)明了將叔丁羰基(BOC)用于保護(hù)0-氨基并在固相合成上進(jìn)行使用。1972年，LouCarpino首先將9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保護(hù)Q-氨基，其在堿性條件下可以迅速脫除且反應(yīng)條件溫和，因而得到廣泛使用。多肽固相合成順序一般從C端(羧基端)向N端(氨基端)合成，涉及多步反應(yīng)，其原理是按照所需要的肽序?qū)⒏鞣N氨基酸連接起來合成一個(gè)生物大分子——多肽。在合成過程中通過將要合成肽序末端氨基酸的羧基適當(dāng)連接分子鍵合于不溶性高分子樹脂上，并用結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為組分，再經(jīng)過脫去氨基酸保護(hù)基與過量的活化羧基組分反應(yīng)連接長的肽序，達(dá)到所需的多肽，然后再選擇適當(dāng)?shù)那懈钜喝コ齻?cè)鏈保護(hù)基和從樹脂上裂解的產(chǎn)物?，F(xiàn)有對側(cè)鏈保護(hù)基及樹脂的切割方法一標(biāo)準(zhǔn)氫氟酸(HF)切割法，其步驟包括
A、將多肽樹脂倒入離心管中，再向離心管中加入切割液
肽序中含半胱氨酸(Cys)的多肽選用由HF/苯甲醚/ 二甲基硫(DMS)/苯甲硫醚構(gòu)成的切割液，它們的比例為10:1:1:0. 2 ;
肽序中不含半胱氨酸的多肽選用由HF/苯甲醚/ 二甲基硫構(gòu)成的的切割液，它們的比例為 10:1:1 ；
B、經(jīng)過一段時(shí)間的反應(yīng)后再通入氮?dú)庖哉舭l(fā)HF和DMS；C、用三氟乙酸(TFA)吸取切除下的多肽；
D、將樹脂與多肽通過負(fù)壓作用從砂芯漏斗中分離出來，然后在離心管中倒入足量的乙醚析出粗品多肽；
E、將乙醚與多肽搖勻于離心管中使其成為溶液；將離心管放入離心機(jī)使肽得以沉淀；復(fù)用乙醚清洗多肽以洗掉切割液獲得較為純凈的肽；
F、去掉最后一遍洗滌多肽的乙醚，將離心管的蓋子旋緊放入干燥器用油泵抽干乙醚?，F(xiàn)有HF切割法的不足之處是
(I)氫氟酸(HF)是一種酸性極強(qiáng)、具有高毒性的物質(zhì)，一旦吸入HF氣體將危害人體甚至導(dǎo)致人員死亡，HF氣體的溢出會(huì)對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。
(2)HF具有強(qiáng)腐蝕性，不可在玻璃儀器中進(jìn)行多肽的切割，須在特殊材料的儀器中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(3)用HF切割多肽的操作難度大，因此必須在能耐強(qiáng)腐蝕的通風(fēng)櫥中進(jìn)行；操作員必須佩戴眼罩、防毒面具、耐腐蝕橡膠手套等防護(hù)裝備。
(4)用HF切割后使用氮?dú)庹舭l(fā)HF和DMS增添了操作的復(fù)雜性。(5)反應(yīng)中可能帶有氨基?；雀狈磻?yīng)參與。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決上述問題，提供一種基于固相合成的多肽的切割法，所述的多肽為基于BOC法或FMOC法合成的多肽，本切割法主要是根據(jù)肽序中氨基酸的不同而選用不同的切割液并能方便地洗脫出多肽的一種切割方法，能獲得低污染、高產(chǎn)量的多肽。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下。一種基于固相合成的多肽的切割法，所述的多肽為基于BOC法或FMOC法合成的多肽，其特征是，包括以下步驟
(1)配制切割液 首先，配制三種濃度不同的切割液
切割液I :采用TFA、對甲酚、乙二硫醇(EDT)、H20、苯甲硫醚進(jìn)行配制，它們的配比為
16.5:1:1:1:0. 5，配制后切割液中TFA的濃度為82. 5% ；
切割液II :采用TFA、H20、苯酚、苯甲硫醚、EDT進(jìn)行配制，它們的配比為
17.5:1:0. 5:0. 5:0. 5，配制后切割液中TFA的濃度為87. 5% ；
切割液III :采用TFA、三異丙基硅烷(TIS)、H20進(jìn)行配制，它們的配比為38:1:1，配制后切割液中TFA的濃度為95% ；
配制切割液時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照比例進(jìn)行配制先倒入一半的TFA，加入各類添加劑后再倒另一半的TFA ；
(2)切割液的選用 切割液的選用標(biāo)準(zhǔn)為
①肽序中Arg> I的選用切割液I ;
②肽序中含有I個(gè)Arg的選用切割液II；
③肽序中無Arg的選用切割液III;
④肽序中含I個(gè)色氨酸(Trp)，Ig樹脂加0.Iml乙二硫醇、0. 2ml對甲酚；肽序中含兩個(gè)色氨酸(Trp)，加雙倍即0. 2ml乙二硫醇、0. 4ml對甲酚；
其他范圍依此類推；
⑤肽序中含有Met、Cys的，加乙二硫醇；
(3)切割反應(yīng)時(shí)間及溫度控制
①20肽以下有色氨酸(Trp)的切割反應(yīng)時(shí)間為2個(gè)小時(shí)，無色氨酸的切割反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)30分鐘；
20肽以上有色氨酸(Trp)的切割反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)10分鐘,無色氨酸的切割反應(yīng)時(shí)間
為2小時(shí)45分鐘；
②切割溫度控制在<25°C ；
(4)具體切割步驟
①將所需切割的多肽樹脂倒入離心管，根據(jù)肽序中氨基酸的不同選用切割液，倒入切割液的量應(yīng)保證多肽樹脂浮于離心管內(nèi)；
②旋緊離心管的蓋子并將管內(nèi)溶液搖勻后傾斜放置在低速振蕩器中，按步驟(3)所述的切割反應(yīng)時(shí)間及溫度控制進(jìn)行切割反應(yīng)；
③待切割反應(yīng)完全后將樹脂與多肽通過負(fù)壓作用從砂芯漏斗中分離出來；
④在分離后得到的溶液中倒入冷乙醚使多肽析出，用離心機(jī)對析出的多肽進(jìn)行離心，使多肽得以沉淀；然后用乙醚清洗多肽2 3遍以洗掉切割液得到較純凈的多肽；
⑤將步驟(4)④獲得的多肽用吹風(fēng)機(jī)將多肽表面的乙醚吹除，再將多肽放入干燥器用油泵抽干乙醚，即可獲得切割下的多肽。本發(fā)明的積極效果是
(I)選用不同的切割液(百分比濃度分別為82. 5%,87. 5%、95%)，通過對多肽序列中氨基酸的不同選用不同的切割液切割側(cè)鏈保護(hù)基及樹脂，實(shí)現(xiàn)對HF的棄用，使對固相合成的多肽的切割變得更環(huán)保，更高效。(2)對含有色氨酸(Trp)的肽序可嚴(yán)格控制切割時(shí)間及環(huán)境溫度。(3)對環(huán)境友好、能減少對操作人員的危害，降低了成本，提高了多肽切割的效率。
具體實(shí)施例方式以下給出本發(fā)明基于固相合成的多肽的切割法的具體實(shí)施方式
，但是，本發(fā)明的實(shí)施不限于以下的實(shí)施方式。一種基于固相合成的多肽的切割法，所述的多肽為基于BOC法或FMOC法合成的多肽，包括以下工藝步驟
(I)配制切割液
首先，配制三種濃度不同的切割液
切割液I :采用TFA、對甲酚、乙二硫醇(EDT)、H20、苯甲硫醚進(jìn)行配制，它們的配比為
16.5:1:1:1:0. 5，配制后切割液中TFA的濃度為82. 5% ；；
切割液II :采用TFA、H20、苯酚、苯甲硫醚、EDT進(jìn)行配制，它們的配比為
17.5:1:0. 5:0. 5:0. 5，配制后切割液中TFA的濃度為87. 5% ；
切割液III :采用TFA、三異丙基硅烷(TIS)、H20進(jìn)行配制，它們的配比為38:1:1，配制后切割液中TFA的濃度為95% ；(解釋切割液濃度是指在配制后溶液中TFA的含量，配制使用的是純TFA)；
配制切割液時(shí)應(yīng)注意TFA的引流，嚴(yán)格按照比例進(jìn)行配制以先倒入一半的TFAjPA各類添加劑后再倒另一半的TFA為宜。(2)切割液的選用 切割液的選用標(biāo)準(zhǔn)為
①所需切割的多肽樹脂的肽序中Arg> I的選用切割液I ;
②所需切割的多肽樹脂的肽序中含有I個(gè)Arg的選用切割液II ；
③所需切割的多肽樹脂的肽序中無Arg的選用切割液III；
④所需切割的多肽樹脂的肽序中含I個(gè)色氨酸(Trp)，Ig樹脂加0.Iml乙二硫醇、0. 2ml對甲酚；
肽序中含兩個(gè)色氨酸(Trp)，加雙倍即0. 2ml乙二硫醇、0. 4ml對甲酚；
其他范圍依此類推；
⑤所需切割的多肽樹脂的肽序中含有Met、Cys的，加乙二硫醇。(3)切割反應(yīng)時(shí)間及溫度控制
①20肽以下有色氨酸(Trp)的切割反應(yīng)2個(gè)小時(shí),無色氨酸的切割反應(yīng)2小時(shí)30分
鐘；
20肽以上有色氨酸(Trp)的切割反應(yīng)2小時(shí)10分鐘,無色氨酸的切割反應(yīng)2小時(shí)45分鐘；
②切割溫度控制在25°C。(4)具體切割步驟
①將所需切割的多肽樹脂倒入離心管(一般不超過4g)，根據(jù)肽序中氨基酸的不同選用切割液，參見步驟(2)，倒入切割液的量應(yīng)保證多肽樹脂能得到充分的反應(yīng)，視切割液的粘稠度繼續(xù)添加切割液直至多肽樹脂浮于離心管內(nèi)；
②旋緊離心管的蓋子并將管內(nèi)溶液搖勻后傾斜放置在低速振蕩器中，按步驟(3)所述的切割反應(yīng)時(shí)間及溫度控制進(jìn)行切割反應(yīng)；
③待切割反應(yīng)完全后將樹脂與多肽通過負(fù)壓作用從砂芯漏斗中分離出來；
④在分離后得到的溶液中倒入冷乙醚使多肽析出，用離心機(jī)對析出的多肽進(jìn)行離心，使多肽得以沉淀；然后用乙醚清洗多肽2 3遍以洗掉切割液得到較純凈的多肽；
⑤將步驟(4)④獲得的多肽采用吹風(fēng)機(jī)將多肽表面的乙醚吹除，再將多肽放入干燥器用油泵抽干乙醚，獲得切割下的多肽。
權(quán)利要求
1.一種基于固相合成的多肽的切割法，所述的多肽為基于BOC法或FMOC法合成的多肽，其特征在于，包括以下步驟 (1)配制切割液 首先，配制三種濃度不同的切割液 切割液I :采用TFA、對甲酚、乙二硫醇、H20、苯甲硫醚進(jìn)行配制，它們的配比為16.5:1:1:1:0. 5,配制后切割液中TFA的濃度為82. 5% ； 切割液II :采用TFA、H20、苯酚、苯甲硫醚、EDT進(jìn)行配制，它們的配比為17.5:1:0. 5:0. 5:0. 5，配制后切割液中TFA的濃度為87. 5% ； 切割液III :采用TFA、三異丙基硅烷、H20進(jìn)行配制，它們的配比為38:1: 1，配制后切割液中TFA的濃度為95% ； 配制切割液時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照比例進(jìn)行配制先倒入一半的TFA，加入各類添加劑后再倒另一半的TFA ； (2)切割液的選用 切割液的選用標(biāo)準(zhǔn)為 ①肽序中Arg> I的選用切割液I ; ②肽序中含有I個(gè)Arg的選用切割液II； ③肽序中無Arg的選用切割液III； ④肽序中含I個(gè)色氨酸，Ig樹脂加0.Iml乙二硫醇、0. 2ml對甲酚； 肽序中含兩個(gè)色氨酸，加雙倍即0. 2ml乙二硫醇、0. 4ml對甲酚； 其他范圍依此類推； ⑤肽序中含有Met、Cys的，加乙二硫醇； (3)切割反應(yīng)時(shí)間及溫度控制 ①20肽以下有色氨酸的切割反應(yīng)時(shí)間為2個(gè)小時(shí)，無色氨酸的切割反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)0分鐘；20肽以上有色氨酸的切割反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)10分鐘，無色氨酸的切割反應(yīng)時(shí)間為2小時(shí)45分鐘； ②切割溫度控制在<25°C ； (4)具體切割步驟 ①將所需切割的多肽樹脂倒入離心管，根據(jù)肽序中氨基酸的不同選用切割液，倒入切割液的量應(yīng)保證多肽樹脂浮于離心管內(nèi)； ②旋緊離心管的蓋子并將管內(nèi)溶液搖勻后傾斜放置在低速振蕩器中，按步驟(3)所述的切割反應(yīng)時(shí)間及溫度控制進(jìn)行切割反應(yīng)； ③待切割反應(yīng)完全后將樹脂與多肽通過負(fù)壓作用從砂芯漏斗中分離出來； ④在分離后得到的溶液中倒入冷乙醚使多肽析出，用離心機(jī)對析出的多肽進(jìn)行離心，使多肽得以沉淀；然后用乙醚清洗多肽2 3遍以洗掉切割液得到較純凈的多肽； ⑤將步驟(4)④獲得的多肽用吹風(fēng)機(jī)將多肽表面的乙醚吹除，再將多肽放入干燥器用油泵抽干乙醚，即可獲得切割下的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物化學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，為基于固相合成的多肽的切割法，其步驟包括⑴配制三種濃度不同切割液；⑵切割液的選用對多肽序列中氨基酸的不同選用不同的切割液；⑶切割反應(yīng)時(shí)間及溫度控制，切割反應(yīng)小時(shí)為2小時(shí)～2小時(shí)45分鐘；切割溫度控制在≤25℃；⑷切割步驟①將所需切割的多肽樹脂倒入離心管，根據(jù)肽序中氨基酸的不同選用切割液；②按步驟⑶的要求進(jìn)行切割反應(yīng)；③切割反應(yīng)后將樹脂與多肽從砂芯漏斗中分離出來；④倒入冷乙醚析出多肽，離心、沉淀，用乙醚清洗；⑤去處乙醚，獲得切割下的多肽。本發(fā)明的切割法對環(huán)境友好、能減少對操作人員的危害，降低了成本，提高了多肽切割的效率。
文檔編號C07K1/06GK102702305SQ201210165089
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者周純澤, 張宏怡, 董昱, 趙恒樂, 陳康宜 申請人:上海電機(jī)學(xué)院