專利名稱：一種固相制備戈舍瑞林的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種多肽藥物的制備方法，尤其涉及一種固相制備戈舍瑞林的制備方法。
背景技術(shù)：
前列腺癌在歐美是男性癌死亡的主要原因之一。發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)，前列腺癌發(fā)病有明顯的地區(qū)和種族差異，據(jù)統(tǒng)計(jì)中國(guó)人最低，歐洲人最高，非 洲和以色列居間，我國(guó)及日本等國(guó)家為前列腺癌低發(fā)地區(qū)，因此有人認(rèn)為東方人癌細(xì)胞生長(zhǎng)比西方人緩慢，臨床病例較少。另外前列腺癌與環(huán)境亦有關(guān)系。乳腺癌是人類最常見的ー種惡性腫瘤，各國(guó)因地理環(huán)境、生活習(xí)慣的不同，乳腺癌的發(fā)病率有很大差異。北美和北歐大多數(shù)國(guó)家是女性乳腺癌的高發(fā)區(qū)，南美和南歐ー些國(guó)家為中等，而亞洲、拉丁美洲和非洲的大部分地區(qū)為低發(fā)區(qū)。在北美、兩歐等發(fā)達(dá)國(guó)家，女性乳腺癌的發(fā)病率居女性惡性腫瘤發(fā)病率的首位。乳腺癌在我國(guó)各地區(qū)的發(fā)病率也不相同，在世界上我國(guó)雖屬女性乳腺癌的低發(fā)國(guó)。但近年來乳腺癌的發(fā)病率明顯增高。尤其滬、京、津及沿海地區(qū)是我國(guó)乳腺癌的高發(fā)地區(qū)。常用的腫瘤藥物主要是化學(xué)藥物，但其化療反應(yīng)副作用大，所以尋找ー種高效、低度的生物藥物是大勢(shì)所趨，目前臨床效果較好的是促性腺釋放激素類似物(LHRH-a)。戈舍瑞林優(yōu)點(diǎn)是副作用少，無心血管并發(fā)癥。戈舍瑞林分子式為=Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(tBu) -Leu-Arg-Pro-Azagly-NH2。戈舍瑞林及其類似物的制備方法主要是液相合成エ藝，操作復(fù)雜，反應(yīng)步驟多，純化方法繁瑣，不利于エ業(yè)生產(chǎn)，應(yīng)用價(jià)值不高，例如美國(guó)藥物化學(xué)雜志J. Med.Chem 121 (10)，1018-1024，1978采用的是4+6片斷縮合法，首先采用液相合成法合成保護(hù)六肽 Z-Tyr-(Bzl)-D-Ser-Arg (NO2)-Pro-AzaGly-NH2,合成出四肽pGlu-His-Trp-Ser-OMe。將合成出來的四肽片段和六肽片段再次采用疊氮物法合成出戈舍瑞林。雖然在前面短肽的合成中解決了精氨酸保護(hù)的問題，但是在脫除六肽保護(hù)時(shí)將酪氨酸側(cè)鏈酚羥基和精氨酸側(cè)鏈胍基上的保護(hù)基也脫除掉，在最后ー步接肽時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，而且副產(chǎn)物性質(zhì)相差不大，很難分離。US4024248采用3+7片斷縮合法。該路線中，首先，液相合成保護(hù)三肽pGlu-His-Trp-OMe。再合成七妝 Z-Ser-Tyr-D-Ser G3ut)-Leu-Arg-Pro-AzaGly-NH2,分別將三肽片段pGlu-Hi s-Trp-OMe肼解，七肽片段除Z保護(hù)基后，采用疊氮法將三肽片段和七肽片段縮合，即得到戈舍瑞林。這種方法分段少，七肽逐步縮合產(chǎn)率很低，并且精氨酸側(cè)鏈胍基未保護(hù)，導(dǎo)致每步縮合出現(xiàn)副產(chǎn)物，每步分離純化很困難。波蘭專利PL194997報(bào)道了ー種5+5片斷縮合法，首先采用液相合成法，分別合成出ニ肽片段Z-Ser-Tyr-OMe和Z-Pro-AzaGly-NH2,然后分別采用碳鏈逐步增長(zhǎng)法合成出五肽片段pGlu-Hi s-Trp-Ser-Tyr-OMe和D-Ser(But)-Leu-Arg- Pro-AzaGly-NH2,最后將兩個(gè)五肽片段采用疊氮物法合成出十肽目標(biāo)化合物戈舍瑞林。由于氨基酸均未進(jìn)行側(cè)鏈保護(hù)，這樣會(huì)導(dǎo)致在接下來的縮合過程中均會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，導(dǎo)致純化困難。US2010311946A1采用的是2-CTC樹脂或者M(jìn)errifield樹脂，需固液結(jié)合法合成戈舍瑞林，并且最后要用到劇毒的試劑K0CN,對(duì)環(huán)境和藥物造成風(fēng)險(xiǎn)；另外，F(xiàn)moc-Osu和水合肼合成Fmoc-NH-NH2,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fmoc-NH-NH2在DMF很難溶解，對(duì)固相合成造成很大困難。
發(fā)明內(nèi)容
為了克服上述液相合成技術(shù)的缺陷，如反應(yīng)周期長(zhǎng)、副產(chǎn)物多、難以分離、不利于放大生產(chǎn)等等，本發(fā)明提供了一種高收率、低成本、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、有利于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的戈舍瑞林的固相制備エ藝。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案一種制備戈舍瑞林的方法，其特征在于:
1)由N，N- ニ琥珀酰亞胺碳酸酯和替代度范圍為0. 2-1. 2mmol/g的酸敏感性氨基樹脂在有機(jī)弱堿性催化劑下偶聯(lián)；
2)用水合肼與步驟I)所得樹脂反應(yīng)得到Azagly-Resin；
3)用Fmoc-Pro-OH 與 Azagly-Resin 在偶聯(lián)劑的作用下得到 Fmoc-Pro-Azagly-Resin ；
4)將Fmoc-Pro-Azagly-Resin與Fmoc保護(hù)氨基酸和偶聯(lián)劑按照戈舍瑞林肽序逐一偶聯(lián)的方式合成得到戈舍瑞林-Resin ；
5)對(duì)戈舍瑞林-Resin進(jìn)行裂解，脫除側(cè)鏈保護(hù)，得到粗肽經(jīng)過液相純化、凍干得到戈舍瑞林。步驟1)，其中，所述的酸敏感性氨基樹脂包括Sieber Resin、Sieber-AM Resin,樹脂的替代度范圍優(yōu)選0. 3-0. 9mmol/g,更優(yōu)選0. 4-0. 8 mmol/g ;由于戈舍瑞林具有D-Ser側(cè)鏈tBu的結(jié)構(gòu)，本發(fā)明的技術(shù)方案對(duì)樹脂要求比較高，需要使用酸敏感性氨基樹脂；如果使用其他類型的樹脂，在裂解時(shí)D-Ser的側(cè)鏈tBu容易受到破壞，不能實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。酸敏感性氨基樹脂優(yōu)選Sieber樹脂、Sieber-AM樹脂。本發(fā)明申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，樹脂的替代度低于0.2mmol/g時(shí)，需要的樹脂量過大，大量的樹脂應(yīng)用使產(chǎn)品的成本提升；當(dāng)樹脂的替代度大于I. 2mmol/g時(shí)，偶聯(lián)反應(yīng)發(fā)生不完全，生成缺省肽，不僅使純化工藝變得極為復(fù)雜，同時(shí)最終產(chǎn)物的純度不高。經(jīng)過申請(qǐng)人刻苦攻關(guān)，意外地發(fā)現(xiàn)當(dāng)樹脂的替代度為0. 2-1. 2mmol/g時(shí)，在產(chǎn)業(yè)化中可以滿意的平衡產(chǎn)品的純度與成本間的關(guān)系。申請(qǐng)人進(jìn)ー步發(fā)現(xiàn)，當(dāng)樹脂的替代度范圍為0. 3-0. 9mmol/g時(shí)產(chǎn)品純度和成本更加符合產(chǎn)業(yè)化的要求；替代度在0. 4-0. 8 mmol/g時(shí)，更加理想。N，N - ニ琥珀酰亞胺碳酸酯的用量為3-10倍于酸敏感性氨基樹脂；
申請(qǐng)人:意外地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)N，N - ニ琥珀酰亞胺碳酸酯用量少于3倍，會(huì)致使反應(yīng)不完全，導(dǎo)致純化難度加大，同時(shí)反應(yīng)時(shí)間太長(zhǎng)，致使產(chǎn)品成本升高；N，N - ニ琥珀酰亞胺碳酸酯用量高于10倍時(shí)，超出了反應(yīng)所需要的用量，剰余的N，N - ニ琥珀酰亞胺碳酸酯増加了純化的難度，使エ藝變得復(fù)雜。、
所述的催化劑是有機(jī)弱堿，優(yōu)選三こ胺，2，4，6-三甲基吡啶，DMAP, DIPEA ;更優(yōu)選是DMAP ；
申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明對(duì)催化劑的堿性要求較為苛刻，需要在有機(jī)弱堿的條件下進(jìn)行，意外地發(fā)現(xiàn)，三こ胺，2，4，6-三甲基吡啶，DMAP, DIPEA的堿性對(duì)本發(fā)明有良好的催化效果，使反應(yīng)時(shí)間明顯縮短，并提高了反應(yīng)物的利用率，其中DMAP堿性最合適，催化效果最好。步驟2)用水合肼與步驟I)所得的樹脂反應(yīng)得到Azagly-Resin ；,反應(yīng)時(shí)間為1-5小時(shí)，優(yōu)選2-5小時(shí)。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間小于I小時(shí)，反應(yīng)物反應(yīng)未充分造成原材料浪費(fèi)，反應(yīng)物難以純化，不能得到理想的產(chǎn)業(yè)化結(jié)果；反應(yīng)時(shí)間大于5小吋，比如6小吋、10小時(shí)等雖然可以實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，但其合成的效率并沒有提高，反而增加了反應(yīng)時(shí)間，使エ藝的時(shí)間延長(zhǎng)，造成了能源與人力成本的浪費(fèi)，使產(chǎn)品的成本増加。所以此反應(yīng)步驟需要摸索最佳的反應(yīng)時(shí)間，即需要平衡反應(yīng)充分與產(chǎn)品成本之間的關(guān)系。經(jīng)過技術(shù)攻關(guān)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間為1-5小時(shí)是理想的產(chǎn)業(yè)化結(jié)果，更加優(yōu)選在2-5小時(shí)，這個(gè)時(shí)間段內(nèi)平衡反應(yīng)充分與產(chǎn)品成本的效果更好。3)用 Fmoc-Pro-OH 與 Azagly-Resin 反應(yīng)得到 Fmoc-Pro-Azagly-Resin,所使用的偶聯(lián)劑為 DIC + A 或 B + A+C，其中 A 為 HOBt 或 HOAt，B 為 HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP，C 為DIPEA 或 TMP。步驟4)所述的 Fmoc 保護(hù)氨基酸是 Fmoc-Arg(R1)-OH, Fmoc-Leu-OH,Fmoc-D-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Tyr (R2) -OH, Fmoc-Trp (R3)-OH, Fmoc-Ser (R4) -OH,Fmoc-His(Trt)-OH, Pyr-OH。 其中，R1=HCU NO2, H ；R2=H, 2-ClTrt, 4-N02Z, Bzl ；R3=H,
2-ClTrt ； R4=H, Trt。
其中，中氨基酸的偶聯(lián)劑為DIC + A或B + A+C，其中A為HOBt或HOAt，B為HBTU、HATU, TBTU 或 PyBOP，C 為 DIPEA 或 TMP。申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)劑對(duì)本發(fā)明有著關(guān)鍵的影響，有些偶聯(lián)劑會(huì)產(chǎn)生消旋的現(xiàn)象，有些偶聯(lián)劑收率不高。選擇減少消旋同時(shí)偶聯(lián)收率高的偶聯(lián)劑是ー個(gè)需要解決的技術(shù)問題。經(jīng)過發(fā)明人的研究，意外地發(fā)現(xiàn)偶聯(lián)劑為DIC + A或B + A+C，其中A為HOBt或H0At，B為HBTU, HATU, TBTU或PyBOP，C為DIPEA或TMP符合本發(fā)明的技術(shù)要求。步驟5)裂解試劑是三氟こ酸、ニ氯甲烷、水，其中三氟こ酸的體積比例(V:V)為1-15%，優(yōu)選3-10% ;ニ氯甲烷的體積比例(V:V)為75-85%，優(yōu)選80-85% ;水的體積比例(V:V)為1-5%，優(yōu)選3-5% ;更優(yōu)選TFA :ニ氯甲烷=H2O的體積比=10:85:5。脫除側(cè)鏈其方法為氫化還原和氫轉(zhuǎn)移的方法脫除側(cè)鏈保護(hù)基，氫化還原采用鈀碳，蘭尼鎳，Pt，Pt/C, PtO2, Pd(OH)2, Rd/C, RhCl (PPh3)3等；氫轉(zhuǎn)移催化，參與反應(yīng)的供氫體可以是環(huán)己烯、環(huán)己ニ烯、甲酸、甲酸銨、四氫化萘等。反應(yīng)可以使用単一供氫體，也可以混合使用。在本發(fā)明的一較佳實(shí)施例中優(yōu)選為甲酸銨，另ー實(shí)施例采用的是甲酸。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明エ藝具有反應(yīng)操作簡(jiǎn)單、后處理容易、原料簡(jiǎn)單易得、成本低、收率高等特點(diǎn)，具有可觀的經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值，同時(shí)在多肽藥物設(shè)計(jì)合成領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.一種制備戈舍瑞林的方法，包含以下步驟 1)由N，N-ニ琥珀酰亞胺碳酸酯和替代度范圍為0. 2-1.2mm0l/g的酸敏感性氨基樹脂在有機(jī)弱堿性催化劑下偶聯(lián)；其中酸敏感性氨基樹脂為Sieber Resin、Sieber-AM Resin ； 2)用水合肼與步驟I)所得的樹脂反應(yīng)得到Azagly-Resin； 3)用Fmoc-Pro-OH 與 Azagly-Resin 在偶聯(lián)劑的作用下得到 Fmoc-Pro-Azagly-Resin ； 4)將Fmoc-Pro-Azagly-Resin與Fmoc保護(hù)氨基酸和偶聯(lián)劑按照戈舍瑞林肽序逐一偶聯(lián)的方式合成得到戈舍瑞林-樹脂； 5)對(duì)戈舍瑞林-Resin進(jìn)行裂解，脫除側(cè)鏈保護(hù)，得到粗肽經(jīng)過純化得到戈舍瑞林。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟I)所述的有機(jī)弱堿性催化劑是三こ胺，2，4，6-三甲基吡啶，DMAP或DIPEA。
3.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于步驟2)所述的“反應(yīng)”的反應(yīng)時(shí)間為1-5小時(shí)。
4.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于步驟3)或步驟4)所述的偶聯(lián)劑為 DIC + A 或 B + A+C，其中 A 為 HOBt 或 HOAt，B 為 HBTU、HATU、TBTU 或 PyBOP，C 為DIPEA 或 TMP。
5.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于步驟4)所述的Fmoc保護(hù)氨基酸是 Fmoc-Arg (R1) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Tyr (R2) -OH, Fmoc-Trp(R3)-OH,Fmoc-Ser (R4) -OH,Fmoc-His (Trt) -OH,Pyr-OH ;其中，R1=HChNOpH ；R2=H, 2-ClTrt,4-N02Z, Bzl ； R3=H, 2-ClTrt ； R4=H, Trt0
6.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于步驟4)所述的Fmoc保護(hù)氨基酸是 Fmoc-Arg(R1)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-D-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(R2) -OH, Fmoc-Trp(R3)-OH,Fmoc-Ser (R4) -OH,Fmoc-His (Trt) -OH,Pyr-OH ;其中，R1=HChNOpH ；R2=H, 2-ClTrt,4-N02Z, Bzl ； R3=H, 2-ClTrt ； R4=H, Trt0
7.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于步驟5)所述的裂解試劑是三氟こ酸、ニ氯甲烷、水，其中三氟こ酸的體積比例為1_15%，ニ氯甲烷的體積比例為75-85%，水的體積比例為1-5%。
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟5)所述的裂解試劑是三氟こ酸、ニ氯甲烷、水，其中三氟こ酸的體積比例為1_15%，ニ氯甲烷的體積比例為75-85%，水的體積比例為1_5%。
9.如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于步驟5)所述的脫除側(cè)鏈保護(hù)，其中脫除側(cè)鏈其方法為氫化還原以及氫轉(zhuǎn)移的方法脫除側(cè)鏈保護(hù)基，氫化還原采用鈀碳，蘭尼鎳，Pt，Pt/C，PtO2, Pd(OH)2, Rd/C, RhCl (PPh3)3 ;氫轉(zhuǎn)移催化，參與反應(yīng)的供氫體是環(huán)己烯、環(huán)己ニ烯、甲酸、甲酸銨、四氫化萘，供氫體使用単一供氫體活混合使用供氫體。
10.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于步驟5)所述的脫除側(cè)鏈保護(hù)，其中脫除側(cè)鏈其方法為氫化還原以及氫轉(zhuǎn)移的方法脫除側(cè)鏈保護(hù)基，氫化還原采用鈀碳，蘭尼鎳，Pt，Pt/C, PtO2, Pd(OH)2, Rd/C, RhCl (PPh3) 3 ;氫轉(zhuǎn)移催化，參與反應(yīng)的供氫體是環(huán)己烯、環(huán)己ニ烯、甲酸、甲酸銨、四氫化萘，供氫體使用單ー供氫體活混合使用供氫體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種固相合成戈舍瑞林的方法，本發(fā)明的技術(shù)方案包括以下步驟由N，N-二琥珀酰亞胺碳酸酯和Sieber Resin偶聯(lián)；用水合肼反應(yīng)得到Azagly-sieberResin；用Fmoc-Pro-OH與Azagly-Sieber Resin偶聯(lián)；其他氨基酸逐一偶聯(lián)得到戈舍瑞林-樹脂；對(duì)戈舍瑞林-SieberResin進(jìn)行裂解，脫除側(cè)鏈保護(hù)，得到的粗肽經(jīng)過純化得到戈舍瑞林。本發(fā)明具有反應(yīng)操作簡(jiǎn)單、后處理容易、收率高、成本低等特點(diǎn)，具有可觀的經(jīng)濟(jì)實(shí)用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K1/04GK102653555SQ20121015536
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2012年5月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月18日
發(fā)明者潘俊鋒, 袁建成, 趙忠衛(wèi), 馬亞平 申請(qǐng)人:深圳翰宇藥業(yè)股份有限公司