專利名稱：發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法及其用途。
背景技術：
多肽是一種與生 物體內各種細胞功能都相關的生物活性物質，是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成的化合物，包括植物多肽和動物多肽。研究認為，天然生物活性肽具有以下特點1.天然性和安全可靠性；2.具有多種營養(yǎng)成分和生物活性；
3.無毒副作用。微生物具有強大的富集鈣的能力，能產生一些能和鈣絡合的蛋白，通過與鈣絡合以有機態(tài)存在。在食用菌中礦質元素90%以上以有機態(tài)存在，具有良好的穩(wěn)定性，便于儲存、運輸及更好地與其他成分相配伍，其中大部分與蛋白、糖和脂肪類物質結合，有利于礦質元素的吸收和利用。骨質疏松是中老年人的一種常見病和多發(fā)病。人體鈣在漫長的過程中丟失，將導致或引起骨質疏松、骨質增生及各類骨折，以及高血壓、冠心病、結石、老年癡呆，并可能增加惡性腫瘤的發(fā)病率。調查發(fā)現(xiàn)，我國65歲以上的老年人中，約有21%的男性和60%的女性患有骨質疏松，80歲以上的老年人則100 %都有骨質疏松，可見優(yōu)良的補鈣制劑市場需求人群相當多。目前市場上常用的鈣劑有無機鈣類及其制劑、有機鈣類及其制劑、中藥鈣類及其它。其中無機鈣類(如碳酸鈣)是所有藥用鈣鹽中含鈣量最高的一種，且價格低廉，是目前應用最廣的補鈣劑，胃酸缺乏者會影響其吸收；有機鈣類(葡萄糖酸鈣)的水溶性好，但吸收率低；中藥類鈣劑的原料大多采用動物骨骼、海洋生物的脊椎、貝殼等，堿性較強，對胃腸刺激大，如果這些生物受到污染，體內可蓄積大量重金屬，易造成二次中毒。另外，雌激素替代療法可預防絕經(jīng)后婦女骨量減少并降低骨質疏松性骨折的發(fā)生，但長期應用對生殖系統(tǒng)存在潛在的致癌風險。因此，開發(fā)具有自主知識產權、可用于預防和治療骨質疏松癥、安全、高效、低毒的新型藥物和保健食品具有重大的經(jīng)濟效益和社會效益。多肽可以來源于動物和植物。骨肽是從動物的骨骼中提取出來的小分子多肽類物質，已被證實其能夠改善骨的代謝、促進骨折愈合，能夠預防和治療骨質疏松，并具有良好的鎮(zhèn)痛和消炎作用。許多植物中也含有多肽類物質，具有較好的生物活性，有些植物多肽已被應用于生產和科研工作當中，如大豆多肽等。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法及其用途。發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法如下一、按照質量與體積比為Ig : 2 IOmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中，在室溫超聲提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，過濾，棄去濾液，將濾渣干燥，得到脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉；二、按照質量與體積比為Ig : 4 20mL的比例將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入到PH值為4. 0 9. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液或pH值為4. 0 9. 0的磷酸鹽緩沖液中，在4°C攪拌2 4h或者在4°C浸泡24 36h，然后以3000 6000轉/分的速度離心，取上清液，將上清液經(jīng)過分子量50000道爾頓的超濾膜超濾，再經(jīng)過10000道爾頓的超濾膜超濾，濃縮濾液，冷凍干燥或噴霧干燥，即得發(fā)酵黃瓜籽多肽；步驟一中所述的有機溶劑為石油醚、正己烷或乙醚。發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法如下
一、按照質量與體積比為Ig : 2 IOmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中，在室溫超聲提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，過濾，棄去濾液，將濾渣在40°C以下干燥，得到脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉；二、按照質量與體積比為Ig 2 5mL的比例將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入水中，再加入復合酶，復合酶用量為脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉質量的I % 4%，在pH值為6 8、溫度為40 60°C的條件下,定向酶解4 IOh,然后在80 90°C保溫5 20min,在3000 5000轉/分鐘的轉速下離心，收集上清液，得到小肽液；三、將小肽液經(jīng)10000道爾頓的超濾膜超濾，濃縮濾液，冷凍干燥或噴霧干燥，即得發(fā)酵黃瓜籽多肽；步驟一中所述的復合酶為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及中性蛋白酶中的兩種或三種按任意比例組成；步驟一中所述的有機溶劑為石油醚、正己烷或乙醚。本發(fā)明的發(fā)酵黃瓜籽多肽用于預防和治療骨質疏松。本發(fā)明的發(fā)酵黃瓜籽多肽安全可靠，無毒副作用，能夠促進成骨細胞的增殖，并能降低堿性磷酸酶活性，改善骨質疏松癥狀，可起到預防和治療骨質疏松、促進骨骼發(fā)育的作用。
具體實施例方式本發(fā)明技術方案不局限于以下所列舉具體實施方式
，還包括各具體實施方式
間的任意組合。
具體實施方式
一本實施方式發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法如下一、按照質量與體積比為Ig : 2 IOmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中，在室溫超聲提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，過濾，棄去濾液，將濾渣干燥，得到脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉；二、按照質量與體積比為Ig : 4 20mL的比例將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入到PH值為4. 0 9. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液或pH值為4. 0 9. 0的磷酸鹽緩沖液中，在4°C攪拌2 4h或者在4°C浸泡24 36h，然后以3000 6000轉/分的速度離心，取上清液，將上清液經(jīng)過分子量50000道爾頓的超濾膜超濾，再經(jīng)過10000道爾頓的超濾膜超濾，濃縮濾液，冷凍干燥或噴霧干燥，即得發(fā)酵黃瓜籽多肽。本實施方式中發(fā)酵黃瓜籽粉的制備方法如下黃瓜籽完全浸泡于水中10 20小時，過濾，向浸泡后的黃瓜籽中加入占浸泡后的黃瓜籽總重量5% 10%的碳酸鈣得到混合物，裝袋，每個袋里的混合物為200 300g，在溫度為121 °C條件下滅菌40分鐘，冷卻至室溫，然后向每個袋中接入3mL濃度為I X IO5 IX IO8CfuAiL的側耳菌菌液，在25°C 30°C下發(fā)酵25-35天，真空干燥，粉碎，即得到發(fā)酵黃瓜籽粉。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中所述的有機溶劑為石油醚、正己烷或乙醚。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟一中按照質量與體積比為Ig SmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一不同的是步驟二中在10°C浸泡18 24h。其它與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法如下
一、按照質量與體積比為Ig : 2 IOmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中，在室溫超聲提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，過濾，棄去濾液，將濾渣在40°C以下干燥，得到脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉；二、按照質量與體積比為Ig 2 5mL的比例將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入水中，再加入復合酶，復合酶用量為脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉質量的I % 4%，在pH值為6 8、溫度為40 60°C的條件下，定向酶解4 IOh,然后在80 90°C保溫5 20min,在3000 5000轉/分鐘的轉速下離心，收集上清液，得到小肽液；三、將小肽液經(jīng)10000道爾頓的超濾膜超濾，濃縮濾液，冷凍干燥或噴霧干燥，即得發(fā)酵黃瓜籽多肽。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
五不同的是步驟一中所述的復合酶為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及中性蛋白酶中的兩種或三種按任意比例組成。其它與具體實施方式
五相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
五不同的是步驟一中所述的有機溶劑為石油醚、正己烷或乙醚。其它與具體實施方式
五相同。
具體實施方式
八本實施方式與具體實施方式
五不同的是步驟一中按照質量與體積比為Ig SmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中。其它與具體實施方式
五相同。采用下述實驗驗證本發(fā)明效果實驗一發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法如下一、取發(fā)酵黃瓜籽進行粉碎過篩，粉碎細度為40目；二、按照質量與體積比為Ig 6mL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到正己烷中，在20°C浸泡24h，過濾，棄去濾液，將濾渣干燥，得到脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉；三、按照質量與體積比為Ig SmL的比例將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入到pH值為6. 8的磷酸鹽緩沖液中，在4°C攪拌2h，然后以5000轉/分的速度離心，取上清液，將上清液經(jīng)過分子量50000道爾頓的超濾膜超濾，再經(jīng)過10000道爾頓的超濾膜超濾，濃縮濾液，冷凍干燥或噴霧干燥，即得發(fā)酵黃瓜籽多肽。實驗二 發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法如下一、取發(fā)酵黃瓜籽進行粉碎過篩，粉碎細度為100目；二、按照質量與體積比為Ig SmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到乙醚中，室溫超聲提取20min，過濾，棄去濾液，將濾渣在40°C以下干燥，得到脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉；三、按照質量與體積比為Ig 4mL的比例將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入水中，再加入復合酶，復合酶用量為脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉質量的2%，在pH值為6. 8、溫度為450C的條件下，定向酶解10h，然后在85°C保溫lOmin，在4000轉/分鐘的轉速下離心，收集上清液，得到小肽液，其中復合酶為胰蛋白酶和木瓜蛋白酶按I : I的質量比混合而成；
四、將小肽液經(jīng)10000道爾頓的超濾膜超濾，濃縮濾液，冷凍干燥或噴霧干燥，即得發(fā)酵黃瓜籽多肽。將實驗一與實驗二制備的發(fā)酵黃瓜籽多肽進行如下試驗I、發(fā)酵黃瓜籽多肽急性毒性試驗取昆明種小鼠20只，觀察實驗一與實驗二制備的發(fā)酵黃瓜籽多肽(發(fā)酵黃瓜籽多肽濃度均為280mg/mL)腹腔注射給藥0. 4mL/20g所產生的毒性反應和死亡情況，7日內均無異常反應、無死亡。小鼠急性毒性試驗結果是人用量的3000倍，證明該測定樣品安全可靠，無毒副作用。2、發(fā)酵黃瓜籽多肽對大鼠成骨細胞的增殖作用在無菌的條件下，取新生I日齡Wistar大鼠顱蓋骨，剔除附著的結締組織，PBS液清洗3次，將其置入含有DMEM培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，剪成0. 5mmX0. 5mm大小碎塊，加入質量濃度為0. 25g/100mL胰蛋白酶5mL，置入孵箱中消化30min，棄去胰酶液，加入I. Og/L II型膠原酶5mL，置于孵箱中消化lh，棄去消化液，1000r/min離心lOmin，使細胞沉淀，用PBS沖洗細胞2次，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，24h后換液，以后隔日換液I次。培養(yǎng)至第4 7天，細胞長成致密單層，鋪滿培養(yǎng)瓶底，進行傳代。棄去原培養(yǎng)液，用PBS液沖洗2次，加入0. 25g/100mL胰蛋白酶消化，1000r/min離心lOmin，棄去消化液，再用PBS液沖洗I次，加入培養(yǎng)液，制成細胞懸液。將成骨細胞懸液按I X IO5細胞/mL密度接種于96孔板，待細胞貼壁后，將培養(yǎng)液換成質量濃度lg/100mL胎牛血清的DMEM維持液，同時加入不同濃度的發(fā)酵黃瓜籽多肽溶液，使終濃度為含原液的40mg/L、20mg/L、10mg/L、5mg/L、2. 5mg/L、l. 25mg/L,對照組加入等量的維持液，培養(yǎng)24h，48h，72h后，加入MTT 20 y L，于37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，加入二甲基亞砜(DMSO) 150 iiL，用酶標儀于570nm處測定吸光度值。結果見表I和表2。表I發(fā)酵黃瓜籽多肽(實驗一制備)對大鼠成骨細胞的增殖檢測結果(X±S，n=8)
權利要求
1.發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法，其特征在于發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法如下 一、按照質量與體積比為Ig 2 IOmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中，在室溫超聲提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，過濾，棄去濾液，將濾渣干燥，得到脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉； 二、按照質量與體積比為Ig 4 20mL的比例將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入到pH值為4. 0 9. 0的醋酸-醋酸鈉緩沖液或pH值為4. 0 9. 0的磷酸鹽緩沖液中，在4°C攪拌2 4h或者在4°C浸泡24 36h，然后以3000 6000轉/分的速度離心，取上清液，將上清液經(jīng)過分子量50000道爾頓的超濾膜超濾，再經(jīng)過10000道爾頓的超濾膜超濾，濃縮濾液，冷凍干燥或噴霧干燥，即得發(fā)酵黃瓜籽多肽。
2.根據(jù)權利要求I所述發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法，其特征在于步驟一中所述的有機溶劑為石油醚、正己烷或乙醚。
3.根據(jù)權利要求I所述發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法，其特征在于步驟一中按照質量與體積比為Ig SmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中。
4.根據(jù)權利要求I所述發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法，其特征在于步驟二中在10°C浸泡18 24h。
5.發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法，其特征在于發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法如下 一、按照質量與體積比為Ig 2 IOmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中，在室溫超聲提取20 60min或者在0 20°C浸泡18 24h，過濾，棄去濾液，將濾渣在40°C以下干燥，得到脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉； 二、按照質量與體積比為Ig 2 5mL的比例將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入水中，再加入復合酶，復合酶用量為脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉質量的1% 4%，在pH值為6 8、溫度為40 60°C的條件下，定向酶解4 10h，然后在80 90°C保溫5 20min，在3000 5000轉/分鐘的轉速下離心，收集上清液，得到小肽液； 三、將小肽液經(jīng)10000道爾頓的超濾膜超濾，濃縮濾液，冷凍干燥或噴霧干燥，即得發(fā)酵黃瓜籽多肽。
6.根據(jù)權利要求5所述發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法，其特征在于步驟一中所述的復合酶為胰蛋白酶、木瓜蛋白酶及中性蛋白酶中的兩種或三種按任意比例組成。
7.根據(jù)權利要求5所述發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法，其特征在于步驟一中所述的有機溶劑為石油醚、正己烷或乙醚。
8.根據(jù)權利要求5所述發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法，其特征在于步驟一中按照質量與體積比為Ig SmL的比例將發(fā)酵黃瓜籽粉加入到有機溶劑中。
9.權利要求I所述發(fā)酵黃瓜籽多肽，其特征在于所述發(fā)酵黃瓜籽多肽用于預防和治療骨質疏松。
10.權利要求5所述發(fā)酵黃瓜籽多肽，其特征在于所述發(fā)酵黃瓜籽多肽用于預防和治療骨質疏松。
全文摘要
發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法及其用途，它涉及一種發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法及其用途。本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵黃瓜籽多肽的制備方法及其用途。本方法如下一、制備脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉；二、將脫脂干燥的發(fā)酵黃瓜籽粉加入到緩沖液中，攪拌或浸泡，離心，超濾，濃縮濾液，干燥，即得。本發(fā)明的發(fā)酵黃瓜籽多肽用于預防和治療骨質疏松。本發(fā)明的發(fā)酵黃瓜籽多肽安全可靠，無毒副作用，能夠促進成骨細胞的增殖，并能降低堿性磷酸酶活性，改善骨質疏松癥狀，可起到預防和治療骨質疏松、促進骨骼發(fā)育的作用。
文檔編號C07K1/14GK102643327SQ20121012246
公開日2012年8月22日 申請日期2012年4月24日 優(yōu)先權日2012年4月24日
發(fā)明者方自若, 曹思思, 王偉明, 王昶, 陳麗艷 申請人:黑龍江省中醫(yī)研究院