專利名稱：Gpc3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8g6及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類生命健康，有報(bào)道顯示，在所有疾病中，肝細(xì)胞性肝癌發(fā)病率居第五而病死率高居第三。據(jù)估計(jì)，全世界每年有超過(guò)100萬(wàn)新發(fā)現(xiàn)的HCC患者，約100萬(wàn)人病死。由于HCC早期癥狀和體征不明顯或缺乏特異性，導(dǎo)致HCC的早期診斷率較低，患者就醫(yī)時(shí)常為中晚期，喪失治療機(jī)會(huì)(研究顯示，早中期HCC可手術(shù)治療，小肝癌手術(shù)切除術(shù)后5年生存率大約有62. 9%，大肝癌術(shù)后5年生存率則僅為34. 6%)。同時(shí)，由于HCC對(duì)放療和化療均不大敏感，預(yù)后總體較差，外科手術(shù)包括肝移植仍是治療痊愈肝癌的唯一方法。然而，高復(fù)發(fā)與高轉(zhuǎn)移率導(dǎo)致手術(shù)后長(zhǎng)期生存率較低，治療效果不理想。在目前治療尚無(wú)更好治療策略之際，對(duì)高危人群的有效篩選和HCC的早期診斷，是提高生存率、降低病死率的有效途徑。而對(duì)小肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和診斷，生物標(biāo)志物最具優(yōu)勢(shì)。目前在肝癌診斷中最為經(jīng)典和被公認(rèn)的是甲胎蛋白AFP，但其陽(yáng)性檢測(cè)率也僅為30飛0%，而且特異性不夠，不能滿足臨床對(duì)AFP陰性肝癌的早期診斷。肝癌的致病機(jī)理是一個(gè)多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程，所以至今仍無(wú)一個(gè)特異指標(biāo)能在臨床上應(yīng)用，通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)多種指標(biāo)可早期發(fā)現(xiàn)肝癌的發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，從而進(jìn)行早期治療。因此，尋找有效診斷和治療靶標(biāo)，已成為HCC研究的重點(diǎn)、難點(diǎn)及方向。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (glypican-3, GPC3)是膜性硫酸乙酰肝素多糖蛋白，在胎兒肝臟表達(dá)豐富，在成人肝臟不表達(dá)，于肝癌發(fā)生時(shí)常常再激活，是HCC發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)重要物質(zhì)，李慎菁等用Northern雜交結(jié)果顯示GPC3基因在正常肝臟組織中不表達(dá)，而在肝癌組織中為高表達(dá)，并同腫瘤大小及肝癌病理分級(jí)呈正相關(guān)，提示GPC3基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，與肝癌的病變程度有關(guān)。這說(shuō)明該基因有可能是肝癌組織特異性的標(biāo)志基因，可作為肝癌的臨床早期診斷、治療和判斷惡性程度的參考指標(biāo)，具有一定的臨床應(yīng)用前景。GPC3不但在腫瘤組織中特異性高表達(dá)，同時(shí)也可在外周血中被檢測(cè),Capurro等用ELISA法測(cè)得53%肝癌患者血清中存在GPC3的C端片段。而在樣本量為53的健康對(duì)照組中無(wú)一陽(yáng)性，在樣本量為20的肝硬化患者對(duì)照組中僅一例陽(yáng)性，提示GPC3較高的特異性。Nakatsura等用不同的C2端抗體亦取得相似的結(jié)果。其量的變化又與HCC病灶的存在與否、病情的嚴(yán)重程度密切關(guān)聯(lián)(可反映手術(shù)前后的狀態(tài)及治療效果，較AFP敏感)。尤其是GPC3在AFP陰性肝癌中特異性表達(dá)，聯(lián)合檢測(cè)AFP和GPC3，可顯著提高HCC的診斷檢測(cè)率和準(zhǔn)確性，因此被認(rèn)為是一種極具潛能的新穎肝癌標(biāo)志物。同時(shí)，研究還表明GPC3具有較高的免疫原性，在HCC的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，有可能成為肝癌靶向治療的新靶點(diǎn)。目前可以檢測(cè)GPG3的抗體產(chǎn)品均為國(guó)外一些公司如BioMosaics的產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，限制了該蛋白作為臨床靶標(biāo)驗(yàn)證及其功能研究方面的應(yīng)用。發(fā)明 內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供GPC3 (人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6。本發(fā)明的另一目的是提供上述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6的制備方法。本發(fā)明的又一目的是提供上述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的
GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6，分類命名為磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6，于2011年11月04日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5427，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該細(xì)胞株本發(fā)明簡(jiǎn)稱為GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6。由上述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6分泌的單克隆抗體。上述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6的制備方法，步驟如下以GPC3蛋白為免疫原免疫BALB/c小鼠，取血清效價(jià)在1:104以上的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用含20wt%小牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，用GPC3蛋白包被ELISA板，間接ELISA法篩選融合細(xì)胞培養(yǎng)上清液，選擇效價(jià)最高的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆化，用有限稀釋法反復(fù)克隆至100%細(xì)胞陽(yáng)性率，最后獲得GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6。上述方法中，所述的GPC3蛋白優(yōu)選為重組蛋白，具體制備方法為以SEQ IDNO: Γ2所示序列為上下游引物，以Huh7 (可購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù))細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR法擴(kuò)增GPC3基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用I和Sal I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的載體PET-Ilb (可購(gòu)于Merck Chemicals公司)連接,得到重組載體GPC3/PET-llb，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化得到GPC3重組蛋白。上述方法中，小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合優(yōu)選用50 wt % PEG-4000。本發(fā)明的GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6分泌的單克隆抗體在檢測(cè)GPC3蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。如能用于ELISA、時(shí)間分辨熒光免疫、化學(xué)發(fā)光、western-blot、免疫熒光以及組織的免疫組織化學(xué)檢測(cè)等技術(shù)領(lǐng)域。作為一種應(yīng)用方法，本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株8G6分泌的單克隆抗體可以制備成一種GPC3免疫檢測(cè)試劑盒。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6分泌抗體產(chǎn)量高，且易存活，所分泌的單克隆抗體效價(jià)高，反應(yīng)靈敏易于檢測(cè)，可廣泛應(yīng)用于GPC3蛋白表達(dá)的檢測(cè)，在肝細(xì)胞性肝癌早期檢測(cè)中具有突出的優(yōu)勢(shì)，并且降低了 GPC3抗體的生產(chǎn)成本，有利于GPC3的臨床靶標(biāo)驗(yàn)證及其功能研究。
圖I. GPC3 N端基因即GPC3 72-369 bp片段擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果及重組載體GPC3/PET-Ilb雙酶切鑒定結(jié)果，其中I為GPC3基因片段的PCR結(jié)果，2為marker, DL2000，3為GPC3/PET-llb雙酶切結(jié)果，4為GPC3/PET_llb重組質(zhì)粒。圖2. GPC3重組蛋白IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE電泳(12%)結(jié)果，其中m: marker,1 和 3 GPC3/PET-1 lb/Rosetta 誘導(dǎo)前；2 和 4 GPC3/PET-llb/Rosettal 誘導(dǎo)后。圖3. GPC3重組蛋白菌體超聲后的SDS-PAGE電泳(12%)結(jié)果。1，3 :GPC3/PET_llb/Rosetta 超聲上清；2，4 GPC3/PET-llb/Rosettal 超聲沉淀。圖4. GPC3重組蛋白純化的SDS-PAGE電泳(12%)結(jié)果。其中M :marker ;1，2 :純
化蛋白。圖5.本發(fā)明單抗8G6對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7免疫熒光染色的結(jié)果以及普通光鏡下的對(duì)照結(jié)果(顯微鏡放大倍數(shù)200倍)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步解釋本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍進(jìn)行任何形式的限制，在不背離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，對(duì)本發(fā)明所作的本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易實(shí)現(xiàn)的任何改動(dòng)都將落入本發(fā)明的權(quán)利要求保護(hù)范圍之內(nèi)。實(shí)施例I制備GPC3重組蛋白
I.GPC3/PET-llb重組載體的構(gòu)建
根據(jù)GenBank中提供的人GPC3mRNA(NM_001164619)序列，去除N末端信號(hào)肽，針對(duì)序列的第 72-369 堿基設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物5’ TAATGAATTCATGCAGCCCCCGCCGCC 3’ (SEQID NO: I)下游引物5’ AGCGGTCGACTCACTTGGCATGGCGAACAACAA 3’ (SEQ ID N0:2)。在兩個(gè)引物的5’端分別引入I和I酶切位點(diǎn)，用常規(guī)PCR方法以Huh7 (購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù))細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板調(diào)取GPC3 N端基因，瓊脂糖凝膠電泳顯示，成功獲得了 GPC3 N端基因，片段長(zhǎng)度與預(yù)期一致(圖I)。原核表達(dá)載體PET-Ilb (購(gòu)自Merck Chemicals公司)以及經(jīng)瓊脂糖凝膠純化后的GPC3基因片段，用I和Sal I雙酶切處理，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化后連接，得到重組質(zhì)粒GPC3/PET-llb，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定(圖1)，同時(shí)將重組質(zhì)粒送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明重組的GPC3片段與設(shè)計(jì)序列完全一致。2. GPC3重組蛋白的表達(dá)
將重組質(zhì)粒GPC3/PET-llb轉(zhuǎn)化大腸桿菌，GPC3/PET-llb的重組表達(dá)菌在含100 μ g/mL氨節(jié)青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，A600達(dá)到O. 6左右時(shí)，加入終濃度I mmol/L的IPTG，于37°C誘導(dǎo)3 h，誘導(dǎo)后的菌液于4°C、8000 rpm離心10 min，收集菌體，結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)洗滌一次，濕菌沉淀用結(jié)合緩沖液重懸，置于冰浴中，超聲破菌后12000rpm離心20 min,上清和沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果顯示,表達(dá)的融合蛋白分子量約為25 KDa (見(jiàn)圖2的2和4)，為包涵體表達(dá)(圖3)，該融合蛋白即為GPC3重組蛋白。3. GPC3重組蛋白的純化和定量
收集誘導(dǎo)后的細(xì)菌，PBS洗滌一次，濕菌沉淀用8mol/L尿素的結(jié)合緩沖液振蕩洗滌，12000 rpm離心20 min,上清為待純化的蛋白樣品。將His6_Ni Superflow Resin填料(購(gòu)自clonetech公司)裝于純化柱中，將純化柱與Akta純化儀連接，用平衡緩沖液(按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)提供的方法配制)平衡5個(gè)柱體積，待純化的蛋白樣品以I. 5 mL/min的速度上樣，上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用蛋白洗脫緩沖液洗脫，收集蛋白峰，洗脫液在含6 mol、4 mol>2 mol、l mol、0 mol尿素的結(jié)合緩沖液中4 °C梯度透 析。SDS-PAGE電泳分析顯示，GPC3重組蛋白經(jīng)His親和純化后，在分子量25 kDa左右有單一條帶(見(jiàn)圖4)，與預(yù)期值相符，Bradford法測(cè)定蛋白濃度為0.12mg/mL。實(shí)施例2鼠抗人GPC3單克隆抗體的制備
I.雜交瘤細(xì)胞株的建立
(O小鼠免疫
取純化的GPC3重組蛋白與250 μ L Bentonite佐劑混合，以100 μ g /500 μ L的量腹部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，間隔三周以100 Ug /500 μ L的量腹部皮下多點(diǎn)注射BALB/c小鼠，從第三次免疫開(kāi)始，每次免疫后的第二周尾靜脈采集小鼠血，間接ELISA方法檢測(cè)血清效價(jià)達(dá)到1:50000以上后準(zhǔn)備融合，融合前3天，尾靜脈注射加強(qiáng)免疫一次，抗原劑量100 μ go( 2 )免疫血清效價(jià)測(cè)定
采用間接ELISA法測(cè)定免疫血清效價(jià)。取30 ygGPC3重組蛋白溶解于10 mL O. 05 MPH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ L/孔，4 °C過(guò)夜。次日，使用PBS(含有0.1% (V/V) Tween-20)洗板三次，用10 mM PBS含10%新生牛血清封閉液200 μ L/孔，37 °C封閉I h，使用PBS (含有0.1% (V/V) Tween-20)洗板三次，小鼠于第三次免疫后15天尾靜脈采血，鼠免疫血清用含2%新生牛血清10 mM PBS以KT1 10_8倍稀釋，加入96孔板，100 μ L/孔 37 V I h，PBS (含有 O. 1% (V/V) Tween-20)洗板三次后，加入 I : 10000倍稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG (Sigma, INC. )，100 μ L/孔37 V I h，同上洗板后，TMB顯色，100 μ L/孔，室溫避光20 min,加50 μ L/孔2Μ H2SO2終止反應(yīng)，測(cè)450 nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對(duì)照，以測(cè)定值與對(duì)照值得比> 2. I為陽(yáng)性來(lái)判斷免疫血清的效價(jià)。(3)雜交瘤的制備
取血清效價(jià)大于I: IO4的小鼠，融合前3天，取重組抗原與等體積的PBS混勻后，以每只100 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。無(wú)菌取小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP20按10 1的比例混合，500 Xg室溫離心
5min，棄上清，用手指輕彈離心管底部，使沉淀松散，離心管置于37 °C水浴中，將在37 V水浴保溫的50%聚乙二醇(PEG，MW4000, Sigma公司)用滴管一滴滴加入離心管中，邊滴邊搖動(dòng)離心管，I min內(nèi)滴完，滴完后靜置2 min，每隔I分鐘加入37 V預(yù)熱的無(wú)血清1640培養(yǎng)基I mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL和10 mL來(lái)終止聚乙二醇的作用，細(xì)胞混合物500 X g室溫離心5 min，棄上清，加入HAT培養(yǎng)液(次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)(HAT，Sigma公司))輕輕重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分至96孔板中，每孔200 μ L。培養(yǎng)三天后，觀察細(xì)胞融合情況，更換一半HAT培養(yǎng)液，連續(xù)數(shù)日，直至有克隆形成，更換HT培養(yǎng)液(次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T) (HT，Sigma公司))培養(yǎng)三天，通過(guò)間接ELISA方法篩選出能與GPC3重組蛋白反應(yīng)的雜交瘤細(xì)胞(以與陰性血清A 450的比值大于2.1判為陽(yáng)性)，更換1640完全培養(yǎng)基。(4)篩選分泌抗人GPC3單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞
間接ELISA法篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清，選擇效價(jià)較高的陽(yáng)性克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆化，并用有限稀釋法連續(xù)克隆化2 3次，直至到100%細(xì)胞陽(yáng)性率，最后獲得穩(wěn)定分泌抗GPC3單克隆抗體細(xì)胞株13株。應(yīng)用時(shí)間分辨的方法進(jìn)行配對(duì)抗體篩選，雜交瘤細(xì)胞株8G6抗體反應(yīng)熒光值最高，將克隆化后陽(yáng)性率達(dá)100%的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后液氮凍存。(5)腹水的制備和純化
將雜交瘤細(xì)胞株8G6以I X IO6/只的量注入液體石蠟預(yù)處理的8 10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察6 7天后小鼠腹部膨大時(shí)抽取腹水。7 10天后采集小鼠腹水，12000rpm,離心10 min收集上清,用ProteinGharose (購(gòu)自GE公司)進(jìn)行純化將ProteinG填料裝于純化柱中，將純化柱與Akta純化儀連接，用平衡緩沖液(按照說(shuō)明書(shū)提供的方法配制)平衡5個(gè)柱體積，待純化的腹水用平衡緩沖液稀釋10倍后以I. 5 mL/min速度上樣，上樣后用平衡緩沖液洗至基線，用洗脫緩沖液洗脫抗體，收集抗體峰，洗脫的抗體立即用Tris-HCl ( ρΗ9·0)中和。Bradford法測(cè)定抗體濃度。純化抗體于-20°C保存。(6)單克隆抗體的特性鑒定
抗體的免疫熒光鑒定GPC3表達(dá)陽(yáng)性的肝癌細(xì)胞Huh7 (購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù))培養(yǎng)一段時(shí)間后，胰酶消化后收集細(xì)胞，鋪于玻璃片上生長(zhǎng)過(guò)夜，PBS洗滌細(xì)胞，使用預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞，分別加入雜交瘤細(xì)胞株8G6制備的抗GPC3單克隆抗體8G6 (1:10稀釋)，37°C孵育lh，以PBS為陰性對(duì)照。PBS洗片后1:1000加入熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗(Sigma公司)，37°C孵育lh，PBS洗片后，熒光顯微鏡下觀察，經(jīng)抗GPC3單克隆抗體8G6染色的細(xì)胞均觀察到綠色熒光，如圖5所示。結(jié)果證明雜交瘤細(xì)胞8G6制備的抗GPC3單克隆抗體8G6可識(shí)別天然的人GPC3蛋白。
權(quán)利要求
1.GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6，于2011年11月04日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5427。
2.權(quán)利要求I所述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6分泌的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求I所述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6的制備方法，其特征在于步驟如下以GPC3蛋白為免疫原免疫BALB/c小鼠，取血清效價(jià)在1:104以上的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用含20wt%小牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，用GPC3蛋白包被ELISA板，間接ELISA法篩選融合細(xì)胞培養(yǎng)上清液，選擇效價(jià)最高的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行亞克隆化，有限稀釋法反復(fù)克隆至100%細(xì)胞陽(yáng)性率，最后獲得GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6的制備方法，其特征在于所述GPC3蛋白為重組蛋白，具體制備方法為以SEQ ID NO: f 2所示序列為上下游引物，以Huh7細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，PCR法擴(kuò)增GPC3基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用I和Sal I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的載體PET-Ilb連接，得到重組載體GPC3/PET-llb，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化得到GPC3重組蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6的制備方法，其特征在于小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合用50 wt % PEG-4000。
6.權(quán)利要求2所述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6分泌的單克隆抗體在檢測(cè)GPC3蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。
7.—種GPC3免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求2所述GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6分泌的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6及其制備方法和應(yīng)用，屬于細(xì)胞工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6，保藏編號(hào)為CGMCC No.5427。該雜交瘤細(xì)胞株8G6的制備方法為以GPC3蛋白為免疫原免疫小鼠，取血清效價(jià)在1:104以上的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，用HATRPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，經(jīng)過(guò)ELISA和多次有限稀釋法篩選，最后獲得雜交瘤細(xì)胞株8G6。本發(fā)明的GPC3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株8G6分泌抗體產(chǎn)量高，且易存活，所分泌的單克隆抗體效價(jià)高，反應(yīng)靈敏，易于檢測(cè)，生產(chǎn)成本低，可廣泛應(yīng)用于GPC3蛋白表達(dá)的檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07K16/18GK102634487SQ20121008601
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者徐偉文, 李明, 馬瑞娟 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)