專利名稱：從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白質分離純化技術領域，具體地指一種從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法。
背景技術：
雞蛋清來源廣泛，價格低廉，干物質中蛋白質含量超過80%，是最理想的蛋白質資源之一。雞蛋清蛋白質具有優(yōu)良的功能特性，如凝膠性、起泡性和成膜性，已經(jīng)廣泛應用于食品加工業(yè)和其它制造業(yè)領域，取得了巨大的應用價值。然而雞蛋清蛋白質所具有的生物活性具有更加廣闊的應用前景。如溶菌酶的抗菌活性、卵轉鐵蛋白結合鐵的特性、卵粘蛋白的抗病毒活性，以及卵黃素蛋白結合核黃素的活性，這些重要的生物活性已經(jīng)引起廣大科研工作者的強烈關注。在生命健康越來越受到關注的今天，雞蛋清蛋白質的生物活性使其在保健食品和生物醫(yī)學領域具有巨大的潛在應用價值?，F(xiàn)有國內(nèi)雞蛋清蛋白質的分離純化技術主要為一種或兩種蛋白質的分離純化，更多種類的蛋白質聯(lián)合提取技術鮮見報道。國外有少量使用液相層析技術聯(lián)合提取多種雞蛋清蛋白質的報道，但存在提取效率低、蛋白質純度不高、需多種層析填料且填料價格高等問題，制備成本較高，在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)應用上還存在很大的局限性。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了填補國內(nèi)雞蛋清中多種蛋白質聯(lián)合提取的技術空白，提供一種提取效果好，產(chǎn)品純度高，適于工業(yè)化生產(chǎn)的從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所設計的從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法包括以下步驟(I)新鮮雞蛋清用等體積的20 IOOmM氯化鈉溶液稀釋后混勻，調節(jié)pH值至
5.O 8. 0，得到處理好的蛋清稀釋液；(2)向蛋清稀釋液中，邊攪拌邊加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀釋液中質量百分比濃度為2 6%，優(yōu)選為2. 7 4. 5%，充分攪拌2 12小時后離心分離，得到沉淀A和上清A，在上清A中繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其質量百分比濃度為8 12 %，優(yōu)選為8. 6 10. 0%，充分攪拌2 12小時后離心，得到沉淀B和上清B，上清B中再繼續(xù)添加聚乙二醇 8000至其質量百分比濃度為14 18%，優(yōu)選為14. 8 16. 3%，充分攪拌2 12小時后離心，得到沉淀C和上清D ;該步驟中充分攪拌時間均優(yōu)選為2 4小時；(3)將沉淀A懸浮于200 800mM氯化鈉溶液中，充分攪拌懸浮4 24小時后離心，所得新的沉淀懸浮于蒸餾水中，充分攪拌后離心，重復懸浮于蒸餾水中并離心一次，以洗去氯化鈉，收集沉淀，即得卵粘蛋白；(4)沉淀B、C和上清D使用Q Sepharose FF陰離子交換層析進行分離,然后用氯化鈉溶液分步洗脫，所得各洗脫峰分別收集，透析后冷凍干燥得到多個待鑒定的蛋白質產(chǎn)品;
(5)多個待鑒定的蛋白質產(chǎn)品經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，合并相同蛋白質產(chǎn)品，即得溶菌酶、卵轉鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白。其中，所述步驟(4)中的用氯化鈉溶液分步洗脫優(yōu)選為依次使用含有O. 05
O.12M、0. 15 O. 25M和O. 28 O. 50M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液以相同流速進行分步洗脫， 更優(yōu)選為依次使用含有O. 07 O. 09M、0. 16 O. 21M和O. 29 O. 40M氯化鈉的Tris-HCl 緩沖液以相同流速進行分步洗脫。優(yōu)選地，所述Tris-HCl緩沖液的pH為7. O 8. 5，濃度為10 IOOmM,所述含氯化鈉的Tris-HCl緩沖液的流速為2. O 3. OmL/min。本發(fā)明所述的從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法，可以一次性獲得卵粘蛋白、溶菌酶、卵轉鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白五種蛋白質，和現(xiàn)有的從蛋清中分離一至兩種蛋白質的方法相比提高了抽提效率和原料的利用率。本方法采用聚乙二醇分級沉淀預分離、離子交換層析純化的技術路線，聚乙二醇分級沉淀法與現(xiàn)有技術中常采用的硫酸銨鹽析沉淀法相比，具有以下優(yōu)勢其一、條件溫和，有利于保持蛋白質的天然構象和生物活性；其二、沉淀所得蛋白質產(chǎn)品經(jīng)溶解后即可直接進行離子交換層析，不需要脫鹽處理，縮短了時間(約縮短24小時)，降低了大量蒸餾水消耗；其四、聚乙二醇性質穩(wěn)定，無環(huán)境危害，不會導致水質富營養(yǎng)化等問題。在預分離過程中，通過優(yōu)化聚乙二醇8000分級沉淀的濃度范圍，使蛋清中幾種主要的蛋白質成分有效分開，其中卵粘蛋白全部存在于沉淀A中，卵黃素蛋白主要存在于沉淀B中，溶菌酶和卵轉鐵蛋白王要存在于沉淀B和C中，而大部分的卵清蛋白存在于上清D中，每種蛋白質在其對應的沉淀中已經(jīng)具有較好的純度，從而使后續(xù)的Q Sepharose FF陰離子交換層析僅需采用一種層析填料即可獲得高純度的蛋白，無需更換填料，簡化了操作步驟，進一步縮短了提取蛋白質的時間。本發(fā)明中的Q Sepharose FF陰離子交換層析可采用市售常用填料,價格低, 性能穩(wěn)定，且支持工業(yè)化應用，在生產(chǎn)規(guī)模從實驗室擴大至中試和工業(yè)化的過程中，其相關技術參數(shù)不需再次優(yōu)化。本發(fā)明的有益效果通過從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法可以在一次提取過程中同時獲得五種蛋白質，且蛋白質產(chǎn)品純度高，回收率較好，該方法僅需常用層析填料即可進行，大幅度縮減了生產(chǎn)成本，為蛋清中蛋白質提取的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了有利條件。
圖I為本發(fā)明的從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法的流程示意圖；圖2為沉淀A、B、C和上清D的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖3為沉淀B的陰離子交換層析圖譜；圖4為沉淀C的陰離子交換層析圖譜；圖5為上清D的陰離子交換層析圖譜；圖6為沉淀B、C和上清D經(jīng)陰離子交換層析所得各峰的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖；圖7為溶菌酶產(chǎn)品的HPLC圖譜；圖8為卵轉鐵蛋白產(chǎn)品的HPLC圖譜；
圖9為卵清蛋白產(chǎn)品的HPLC圖譜；圖10為卵黃素蛋白產(chǎn)品的HPLC圖譜；其中，OVM為卵粘蛋白、LYZ為溶菌酶、OVT為卵轉鐵蛋白、OVA為卵清蛋白、OVF為卵黃素蛋白、EW為雞蛋清。
具體實施例方式以下結合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步的詳細描述。實施例一、樣品前處理將新鮮的雞蛋打蛋，使用蛋黃分離器分離蛋清和蛋黃，收集蛋清。二、蛋白質提取(I)取I. OL蛋清，邊攪拌邊向蛋清中加入等體積的50mM氯化鈉溶液，攪拌2小時以混合均勻，然后用濃度為2Mol/L的鹽酸調pH值到6. O,即得處理好的蛋清稀釋液；(2)向蛋清稀釋液中，邊攪拌邊加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀釋液中質量百分比濃度為2. 7 4. 5%，此時溶液中產(chǎn)生沉淀，利用磁力攪拌充分擴散2小時，得到懸濁液， 然后在4°C、轉速為15000 Xg的條件下離心10分鐘，得到沉淀A和上清A ;(3)向上清A中繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清A中質量百分比濃度為8. 6 10. 0%，充分攪拌2小時，然后在4°C、轉速為12000Xg條件下離心10分鐘，得到沉淀B和上清B ;(4)向上清B中進一步添加聚乙二醇8000至其在上清B中質量百分比濃度為 14. 8 16. 3%，充分攪拌2小時，然后在4°C、轉速為12000X g條件下離心10分鐘，得到沉淀C和上清D。將沉淀A、B、C和上清D取樣，進行SDS-聚丙酰胺凝膠電泳，結果如圖2所示，可以初步鑒定其中所含的蛋白質成分。三、蛋白質分離與純化(I)將沉淀A懸浮于500mM氯化鈉溶液中，4°C下攪拌4小時，然后在4°C、15000Xg 下離心10分鐘，除去大部分的溶菌酶、卵清蛋白、卵轉鐵蛋白，收集所得的沉淀Al，再將沉淀Al在蒸餾水中懸浮2小時，并于同樣條件下離心分離，再懸浮于蒸餾水中并離心一次，以洗去氯化鈉，收集沉淀，真空冷凍干燥后得到3. 38g卵粘蛋白產(chǎn)品，其SDS-聚丙酰胺凝膠電泳顯示如圖2中的0VM，使用凝膠成像分析軟件計算其純度為82. 40%，將卵粘蛋白產(chǎn)品于零下20°C下貯存。(2)沉淀B、C和上清D使用Q Sepharose FF陰離子交換層析進行分離將Q Sepharose FF陰離子交換填料裝填入層析柱(50X 5cm)中，用Tris-HCl緩沖液(pH8. 0， 20mM)，以2mL/min的流速平衡層析柱2小時。取沉淀B，溶解于Tris-HCl緩沖液(pH8. 0,20mM)中，4°C下12000 Xg離心10分鐘以除去少量不溶物，然后注入到陰離子交換層析柱中。先用Tris-HCl緩沖液(pH8. 0,20mM) 以2mL/min的流速沖洗層析柱，隨后分別用含有O. 07,0. 16和O. 40M氯化鈉的Tris-HCl緩沖液(pH8.0，20mM)以相同流速進行分步洗脫。分別收集洗脫過程中產(chǎn)生的各個峰，將各峰收集液用蒸餾水透析四次，然后冷凍干燥。沉淀C和上清D也使用相同的方法進行分離，如圖3 5所示，得到和沉淀B、C和上清D中各個峰相對應的多個待鑒定的蛋白質產(chǎn)品的凍干粉則、82、83、84、(1、02、03、01、02、03。
(3) SDS-聚丙酰胺凝膠電泳鑒定采用12%濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳。將上述待鑒定的蛋白質產(chǎn)品的凍干粉稱取約10毫克，溶解于5毫升的雙蒸水中， 充分溶解后取80微升溶液，加入20微升的蛋白上樣緩沖液(5倍濃度)，混勻后沸水浴加熱約5分鐘，冷卻后取5微升注入到點樣孔中，恒定電壓100V進行電泳。電泳完成后，首先使用固定液(50%乙醇，10%乙酸)對凝膠進行固定30分鐘，然后用考馬斯亮藍R-250溶液 (R-250含量O. 1%，同時含有25%乙醇、8%乙酸)在45°C下染色30分鐘，染色完成后轉移至脫色液(25%乙醇和8%乙酸)中脫色，至背景顏色褪去、條帶清晰為止。使用軟件對電泳條帶進行分析，計算相對分子量。所得的電泳圖如圖6所示，BI中所含的蛋白質為溶菌酶，B2中所含的蛋白質為卵轉鐵蛋白，B3中所含的蛋白質為卵清蛋白，B4中所含的蛋白質為卵黃素蛋白，Cl中所含的蛋白質為溶菌酶，C2中所含的蛋白質為卵轉鐵蛋白，C3中所含的蛋白質為卵清蛋白，Dl和D2中未含目的蛋白質，D3中所含的蛋白質為卵清蛋白。將相同蛋白組分合并，B1、C1混合為1.57g溶菌酶產(chǎn)品，B2、C2混合為15. 51g卵轉鐵蛋白產(chǎn)品， B3、C3和D3混合為138. 46g卵清蛋白產(chǎn)品，B4為2. IOg卵黃素蛋白產(chǎn)品。四、純度測定及回收率計算(I)蛋白質產(chǎn)品中的蛋白質含量測定卵粘蛋白產(chǎn)品采用凱氏定氮法測定蛋白含量。溶菌酶、卵轉鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白產(chǎn)品采用考馬斯亮藍試劑盒法測定蛋白含量。各蛋白質產(chǎn)品中的蛋白含量測定結果如下
χΖ 口廣口口卵粘蛋白溶菌酶卵轉鐵蛋白卵清蛋白卵黃素蛋白蛋白含量78.32%74.51%64.90%36.56%14.67%(2)蛋白質產(chǎn)品純度測定卵粘蛋白產(chǎn)品的純度已在沉淀A的分離純化步驟中用 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定。溶菌酶產(chǎn)品、卵轉鐵蛋白產(chǎn)品、卵清蛋白產(chǎn)品和卵黃素蛋白產(chǎn)品的純度使用Grace Vydac C4 (214TP, 5 μ m, 250 X 4. 6mm)反相高效液相色譜柱進行測定。用含O. 1%三氟乙酸(TFA)的乙腈溶液以I. OmL/min的流速進行線性梯度洗脫，首先用5%乙腈溶液平衡色譜柱5分鐘，然后在15分鐘內(nèi)乙腈濃度由5%升高至80%，再在I 分鐘內(nèi)降至5%，并維持4分鐘。柱溫度維持在35°C。用Waters e2695光電二極管檢測器在280nm下進行檢測。由軟件對峰面積進行積分，根據(jù)峰面積比對各蛋白質產(chǎn)品純度進行定量計算。各蛋白質產(chǎn)品純度測定結果如下(圖7 10):
χΖ 口廣口口卵粘蛋白溶菌酶卵轉鐵蛋白卵清蛋白卵黃素蛋白純度82.40%91.84%94.55%96.45%88.16% (3)回收率計算
根據(jù)從250g雞蛋清中純化所得各種蛋白質產(chǎn)品的質量、蛋白含量和純度，使用以下公式計算所得的各個蛋白質的回收率，
蛋白樣品干重X樣品蛋白含量X蛋白純度N/ nn o/ _蛋清質量X蛋清中蛋白質含量X該蛋白占蛋清總蛋白質的比例
需要說明的是，根據(jù)文獻報道，新鮮蛋清中蛋白質含量以10. 2%計算，卵粘蛋白、溶菌酶、卵轉鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白占蛋清總蛋白質的比例分別以3. 4%、3. 5%、12%、54%和O. 5%計算，將其作為理論數(shù)值與本實施例所得的各蛋白質產(chǎn)品進行對比，結果見下表
權利要求
1.一種從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)新鮮雞蛋清用等體積20 IOOmM氯化鈉溶液稀釋后混勻，調節(jié)pH值至5.O 8. 0， 得到處理好的蛋清稀釋液；(2)向蛋清稀釋液中，邊攪拌邊加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀釋液中質量百分比濃度為2 6%，充分攪拌2 12小時后離心分離，得到沉淀A和上清A，在上清A中繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清A中質量百分比濃度為8 12%，充分攪拌2 12小時后離心，得到沉淀B和上清B，上清B中再繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清B中質量百分比濃度為14 18%，充分攪拌2 12小時后離心，得到沉淀C和上清D ；(3)將沉淀A懸浮于200 800mM氯化鈉溶液中，充分攪拌懸浮4 24小時后離心，所得沉淀Al懸浮于蒸餾水中，充分攪拌后離心，再懸浮于蒸餾水中并離心一次，以洗去氯化鈉，收集沉淀，即得卵粘蛋白；(4)沉淀B、C和上清D分別使用QSepharose FF陰離子交換層析進行分離，然后分別用氯化鈉溶液分步洗脫，所得各洗脫峰分別收集，透析后冷凍干燥得到多個待鑒定的蛋白質廣品；(5)對多個待鑒定的蛋白質產(chǎn)品進行取樣，并經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定后，合并相同蛋白質產(chǎn)品，即得溶菌酶、卵轉鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白。
2.根據(jù)權利要求I所述從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法，其特征在于所述步驟⑷中的用氯化鈉溶液分步洗脫為用含有O. 05 O. 12M、0. 15 O. 25M和O. 28 O. 50M 氯化鈉的Tris-HCl緩沖液以相同流速進行分步洗脫。
3.根據(jù)權利要求2所述從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法，其特征在于所述 Tris-HCl緩沖液的pH為7. O 8. 5，濃度為10 IOOmM,所述含氯化鈉的Tris-HCl緩沖液的流速為2. O 3. OmL/min。
4.根據(jù)權利要求I或2或3所述從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法，其特征在于 所述步驟(2)向蛋清稀釋液中，邊攪拌邊加入聚乙二醇8000至其在蛋清稀釋液中質量百分比濃度為2. 7 4. 5%，充分攪拌2 4小時后離心分離，得到沉淀A和上清A，在上清A中繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清A中質量百分比濃度為8. 6 10. 0%，充分攪拌2 4 小時后離心，得到沉淀B和上清B，上清B中再繼續(xù)添加聚乙二醇8000至其在上清B中質量百分比濃度為14. 8 16. 3%，充分攪拌2 4小時后離心，得到沉淀C和上清D。
5.根據(jù)權利要求2所述從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法，其特征在于所述步驟(4)中的用氯化鈉溶液分步洗脫為用含有O. 07 O. 09M、O. 16 O. 2IM和O. 29 O. 40M 氯化鈉的Tris-HCl緩沖液以相同流速進行分步洗脫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從雞蛋清中聯(lián)合提取多種蛋白質的方法，通過聚乙二醇8000分級沉淀蛋白質，然后采用Q Sepharose FF陰離子交換層析進行分離，可以一次性獲得卵粘蛋白、溶菌酶、卵轉鐵蛋白、卵清蛋白和卵黃素蛋白，且蛋白質產(chǎn)品純度高，回收率較好，該方法僅需常用層析填料即可進行，大幅度縮減了生產(chǎn)成本，為蛋清中蛋白質提取的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)提供了有利條件。
文檔編號C07K1/18GK102604915SQ20121008336
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權日2012年3月27日
發(fā)明者張曉維, 耿放, 馬美湖, 黃群 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學