專利名稱：重組人源lect2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，尤其是涉及重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的分泌表達(dá)和純化制備方法。
背景技術(shù)：
LECT2 蛋白，即白細(xì)胞衍生趨化因子2 (leukocyte cell-derived chemotaxin 2) 是一個(gè)多功能的蛋白質(zhì)，分子量約為16 kDa，含三個(gè)分子內(nèi)二硫鍵。LECT2蛋白最初被鑒定為趨化因子，但越來(lái)越多的文獻(xiàn)表明，LECT2蛋白更類似于細(xì)胞因子，是一個(gè)多功能的蛋白。 報(bào)道表明，在小鼠刀豆堿性肝損傷模型試驗(yàn)中，LECT2蛋白的表達(dá)瞬時(shí)減少；在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)展中，血液LECT2蛋白含量與病癥嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)；它能觸發(fā)肝再生的早期事件， 表現(xiàn)為肝細(xì)胞增殖的伴生抑制；它能通過(guò)抑制血管增生達(dá)到抑制肝癌的生長(zhǎng)和遷移；它也與腎淀粉樣病變緊密相關(guān)。因此，LECT2蛋白被認(rèn)為是一種潛在的相關(guān)疾病治療藥物和分子診斷標(biāo)記。LECT2蛋白的制備可以從血清中分離純化，但由于血清少，含量低，如果從血清中分離提取LECT2蛋白，產(chǎn)量極低，成本極高，并且不同物種的LECT2蛋白不能替代，因此無(wú)法規(guī)?；a(chǎn)。在外源基因表達(dá)系統(tǒng)中，原核表達(dá)系統(tǒng)產(chǎn)量高，成本低，但用于表達(dá)真核基因有重大缺陷，由于缺少翻譯后的加工修飾，表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性往往會(huì)受到影響。真核表達(dá)系統(tǒng)中的中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，活性較高，但產(chǎn)量低，并且細(xì)胞培養(yǎng)成本很高。真核表達(dá)系統(tǒng)中的巴斯德畢赤酵母iPichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)量大，并且具有糖基化、脂肪?；?、蛋白磷酸化等翻譯后加工修飾功能，重組蛋白生物學(xué)活性高，是表達(dá)真核基因的理想系統(tǒng)之一。但是，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)采用畢赤酵母表達(dá)制備重組人源LECT2蛋白并進(jìn)一步進(jìn)行純化制備的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種表達(dá)水平高、生產(chǎn)成本低及產(chǎn)量高的重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為將人工合成的人源LECT2基因插入胞外表達(dá)載體PPICZaA中；酶切線性化后電擊導(dǎo)入畢赤酵母X33中，獲得重組工程菌株； 經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)重組人源LECT2蛋白的分泌表達(dá)；再利用柱層析進(jìn)行純化制備得到純度為95%以上的重組人源LECT2蛋白，步驟如下
(1)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒
抽取人外周血細(xì)胞中RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登錄號(hào)為 NM002302,以此為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增人源LECT2蛋白，將含人源LECT2基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶和幻7/71雙酶切，將用相同限制性內(nèi)切酶和^雙酶切的的質(zhì)粒PPICZ α A與酶切后的PCR產(chǎn)物用Τ4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia中， 得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α -LECT2 ；(2)篩選高表達(dá)重組工程菌株
將重組表達(dá)質(zhì)粒？？扣2(1-1^012經(jīng)5^1酶切后，將感受態(tài)畢赤酵母X33細(xì)胞與經(jīng)Mel 酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒PPICZ α -LECT2按比例16ul Iug混合后，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子經(jīng)博萊霉kocin高抗性篩選及PCR鑒定，陽(yáng)性克隆為重組工程菌X33/ pPICZ α -LECT2 ；將獲得的博萊霉高抗性重組工程菌株Χ33/ pPICZ α -LECT2接種于BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600達(dá)2. 0 6. 0收集細(xì)胞，重懸于BMMY培養(yǎng)基中，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，上清液用SDS-PAGE蛋白電泳及Wfestern blot免疫印跡鑒定分析，篩選表達(dá)水平為60_70mg/ L的菌株，得到高表達(dá)重組工程菌株；
(3)高表達(dá)酵母菌株擴(kuò)大培養(yǎng)
將高表達(dá)重組工程菌株接種于IOOmL BMGY培養(yǎng)基生長(zhǎng)，30 °C培養(yǎng)22-26小時(shí)直至 0D600達(dá)2. 0 6. 0，1500rpm離心5min收集菌體，然后將菌體轉(zhuǎn)入400mL BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30°C繼續(xù)培養(yǎng)70-75小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，使畢赤酵母分泌表達(dá)重組人源LECT2蛋白；
(4)重組人源LECT2蛋白的純化
收集步驟(3)擴(kuò)大發(fā)酵后得到的上清液，經(jīng)強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析，收集第二洗脫峰的洗脫液濃縮后，再經(jīng)superdex 75分子篩分離純化，收集最高洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到純度達(dá)95%以上的重組人源LECT2蛋白。步驟(1)中PCR引物序列如下
正向引物為 5，-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3‘, 反向引物為 5，-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3，。步驟(2)中所述的感受態(tài)畢赤酵母X33的制備方法如下將畢赤酵母X33接種于 YPD培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至0D600為1. 3-1. 5，離心收集菌體，用預(yù)冷無(wú)菌水和1 mol/L 山梨醇各洗一次，最后用1 mol/L山梨醇200 μ L懸浮，即得到X33感受態(tài)畢赤酵母。于步驟(2)具體過(guò)程如下
(1)電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母Χ33獲得轉(zhuǎn)化子
將80 μ L感受態(tài)畢赤酵母Χ33細(xì)胞和5 μ g SacI酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)?；旌?，在 1500ν，25μΡ，20(Μ條件下電擊轉(zhuǎn)化，用濃度為1 mol/L山梨醇懸浮，30°C靜置1小時(shí)，再加入YPD培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)3小時(shí)得到轉(zhuǎn)化液，將轉(zhuǎn)化液涂布含100 μ g/ml博萊霉kocin的 YPDS平板，30 °C培養(yǎng)3 4天，得到大量轉(zhuǎn)化子；
(2)博萊霉高抗性重組工程菌株X33/pPICZ α -LECT2的制備
將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)到含1000 μ g/ml博萊霉的YPDS培養(yǎng)基上，獲得博萊霉高抗性菌株，將博萊霉高抗性菌株的菌落置于無(wú)菌水中，混勻并煮沸，離心后取上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性克隆獲得博萊霉高抗性重組工程菌株X33/ pPICZ α -LECT2 ；
(3)高表達(dá)重組工程菌株的制備
將博萊霉高抗性重組工程菌株Χ33/ 扣2(1-1^012接種于51^ BMGY培養(yǎng)基中，30 V 培養(yǎng)22-26小時(shí)至0D600達(dá)2. 0 6. 0，1500rpm離心5min收集菌體，用40 mL BMMY培養(yǎng)液懸浮菌體，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30°C繼續(xù)培養(yǎng)70-75小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，取發(fā)酵液離心，上清液用于12% SDS-PAGE蛋白電泳及Wfestern blot蛋白免疫印跡鑒定分析，篩選表達(dá)水平為60-70mg/L的菌株，得到高表達(dá)重組工程菌株。
步驟(4)具體如下收集步驟(3)擴(kuò)大發(fā)酵后得到的上清液濃縮至10 mL后，上樣強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，以3.0 ml/min的流速洗脫，洗脫液為lmol/L氯化鈉溶液，收集第二洗脫峰的洗脫液濃縮至500ul后，上樣superdex 75分子篩層析柱，以1. 0 ml/min的流速洗脫，洗脫液為lOOmmol/L碳酸銨溶液，收集最高洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到純度達(dá)95%以上的重組人源LECT2蛋白。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明首次提出了一種重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中得分泌表達(dá)和純化制備方法，具體是通過(guò)獲得畢赤酵母重組工程菌株，經(jīng)發(fā)酵和誘導(dǎo)高效分泌表達(dá)，再通過(guò)柱層析的方法純化，獲得純度較高的重組人源LECT2蛋白。本發(fā)明選用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，分泌型表達(dá)菌株的表達(dá)水平達(dá)到Mmg/L左右。通過(guò)柱層析重組蛋白純度為96%。利用趨化小室檢測(cè)表明，該重組人源LECT2蛋白具有趨化活性。鑒于人源LECT2蛋白的多功能性及與多種疾病的相關(guān)性，因此采用畢赤酵母大量表達(dá)高活性的重組人源LECT2蛋白，具有穩(wěn)定、產(chǎn)量高、活性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，可用于制藥和診斷檢測(cè)。
圖1為重組人源LECT2蛋白UW80 nm處的UNQsphere S陽(yáng)離子交換柱洗脫曲線； 圖2為重組人源LECT2蛋白UW80 nm處的Superdex75分子篩洗脫曲線。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一、具體實(shí)施例實(shí)施例1
本發(fā)明重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法，將人工合成的人源 LECT2基因插入胞外表達(dá)載體pPICZ α A中；酶切線性化后電擊導(dǎo)入畢赤酵母Χ33中，獲得重組工程菌株；經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)重組人源LECT2蛋白的分泌表達(dá)；再利用柱層析進(jìn)行純化制備得到純度為95%以上的重組人源LECT2蛋白，步驟具體如下
(1)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒
抽取人外周血細(xì)胞中RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登錄號(hào)為 NM002302,以此為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增人源LECT2蛋白，將含人源LECT2基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶和幻7/71雙酶切，將用相同限制性內(nèi)切酶和^雙酶切的的質(zhì)粒PPICZ α A與酶切后的PCR產(chǎn)物用Τ4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia中， 得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α -LECT2，其中PCR引物序列如下 正向引物為 5，-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3，， 反向引物為 5，-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3‘；
(2)篩選高表達(dá)重組工程菌株
將重組表達(dá)質(zhì)粒？？扣2(1-1^012經(jīng)5^1酶切后，將感受態(tài)畢赤酵母Χ33細(xì)胞與經(jīng)Mel 酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α -LECT2按比例16ul Iug混合后，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子經(jīng)博萊霉kocin高抗性篩選及PCR鑒定，陽(yáng)性克隆為重組工程菌X33/pPICZ α -LECT2 ；將獲得的博萊霉高抗性重組工程菌株Χ33/ pPICZ α -LECT2接種于BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600達(dá)2. 0 6. 0收集細(xì)胞，重懸于BMMY培養(yǎng)基中，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，上清液用SDS-PAGE蛋白電泳及Wfestern blot免疫印跡鑒定分析，篩選表達(dá)水平為60_70mg/L的菌株，得到高表達(dá)重組工程菌株；
(3)高表達(dá)酵母菌株擴(kuò)大培養(yǎng)
將高表達(dá)重組工程菌株接種于IOOmL BMGY培養(yǎng)基生長(zhǎng)，30 °C培養(yǎng)22-26小時(shí)直至0D600達(dá)2. 0 6. 0，1500rpm離心5min收集菌體，然后將菌體轉(zhuǎn)入400mL BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30°C繼續(xù)培養(yǎng)70-75小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，使畢赤酵母分泌表達(dá)重組人源LECT2蛋白；
(4)重組人源LECT2蛋白的純化
收集步驟(3)擴(kuò)大發(fā)酵后得到的上清液，經(jīng)強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析，收集第二洗脫峰的洗脫液濃縮后，再經(jīng)superdex 75分子篩分離純化，收集最高洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到純度達(dá)95%以上的重組人源LECT2蛋白。實(shí)施例2
本發(fā)明重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法，具體包括如下步驟1、人源LECT2基因畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
抽取人外周血細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，根據(jù)已發(fā)表人源泉LECT2基因序列(NM_002302)設(shè)計(jì)引物，正向引物為 5，-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3，，反向引物為 5，-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3，。PCR反應(yīng)條件按照常規(guī)設(shè)置進(jìn)行，PCR擴(kuò)增LECT2，將含LECT2的PCR產(chǎn)物用切膠回收試劑盒回收(OMEGA)，回收產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶和^(Takara)雙酶切，將酶切后的PCR產(chǎn)物與相同酶切的質(zhì)粒pPICZ α A用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a中，得到重組質(zhì)粒pPICZ α -LECT2,重組子經(jīng)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證，表明重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建完全正確。2、重組表達(dá)質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化畢赤酵母Χ33及篩選博萊霉高抗性重組工程菌株接種畢赤酵母Χ33 (Invitrogen)于YPD培養(yǎng)基(Clontech)中，30°C振蕩培養(yǎng)至
0D600=1. 3-1. 5，離心，收集菌體，用預(yù)冷無(wú)菌水和1 mol/L山梨醇各洗一次，最后用1 mol/L山梨醇200 μ L懸浮，即得到Χ33感受態(tài)細(xì)胞畢赤酵母Χ33 ；取80 μ L感受態(tài)畢赤酵母Χ33細(xì)胞和5 μ g McI(Takara)酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)?；旌?，在1500V，25 μ F，200W條件下電擊轉(zhuǎn)化，用1 mol/L山梨醇1 mL懸浮，30°C靜置1小時(shí)，再加入1 mL YPD，振蕩培養(yǎng)3小時(shí)得到轉(zhuǎn)化液，將轉(zhuǎn)化液涂布含100 μ g/ml博萊霉kocin (Invitrogen) YPDS平板，30 °C培養(yǎng)3 4天，結(jié)果得到1300多個(gè)轉(zhuǎn)化子。將這些轉(zhuǎn)化子點(diǎn)到1000 μ g/ml博萊霉的YPDS培養(yǎng)基上，獲得5個(gè)博萊霉高抗性菌株。3、酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定
取上述博萊霉高抗性菌株的菌落置于無(wú)菌水，混勻和煮沸，離心后取上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中PCR擴(kuò)增
正向引物為 5，-GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3，，
反向引物為5’ -GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3’，PCR反應(yīng)條件按照常規(guī)設(shè)置進(jìn)行，陽(yáng)性克隆為博萊霉高抗性重組工程菌株X33/ pPICZ α -LECT2。4、高表達(dá)重組人源LECT2蛋白的工程菌篩選挑取博萊霉高抗性重組工程菌株X33/ pPICZ α -LECT2接種于5mL BMGY培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)22-26小時(shí)(0D600達(dá)2. 0 6. 0)，1500rpm離心5min收集菌體，用40 mL BMMY培養(yǎng)懸浮菌體，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30°C繼續(xù)培養(yǎng)70-75小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，取發(fā)酵液離心，上清用于12% SDS-PAGE蛋白電泳及Western blot蛋白免疫印跡鑒定分析，篩選表達(dá)水平為60-70mg/L的菌株，得到高表達(dá)重組工程菌株。5、擴(kuò)大培養(yǎng)
將高表達(dá)重組工程菌接種于IOOmL BMGY培養(yǎng)基生長(zhǎng)，30 °C培養(yǎng)2246小時(shí)(0D600達(dá)2. 0 6. 0)，1500rpm離心5min收集菌體，然后轉(zhuǎn)入400mL BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30°C繼續(xù)培養(yǎng)70-75小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，使畢赤酵母分泌表達(dá)重組人源LECT2蛋白。以上所用培養(yǎng)基均為通用培養(yǎng)基，在此不詳細(xì)說(shuō)明。6、純化重組人源LECT2蛋白
收集擴(kuò)大培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)上清液濃縮至10mL，全部上樣強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱(型號(hào)UNQsphere S，生產(chǎn)廠家Biorad)，以3. 0 ml/min的流速洗脫，洗脫液為lmol/L氯化鈉溶液，收集第二洗脫峰的洗脫液濃縮至500ul后，上樣superdex 75分子篩層析柱，以1. 0ml/min的流速洗脫，洗脫液為lOOmmol/L碳酸銨溶液，收集最高洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到重組人源LECT2蛋白，其中目的組分采用BCA-200蛋白含量測(cè)定試劑盒(Pierce)測(cè)定總蛋白量，并用12% SDS-PAGE檢測(cè)純化效果，通過(guò)電泳條帶的積分光密度計(jì)算蛋白純度為96%，重組人源LECT2蛋白UW80 nm處的UNQsphere S陽(yáng)離子交換柱洗脫曲線如圖1所示，重組人源LECT2蛋白UW80 nm處的Superdex75分子篩洗脫曲線如圖2所
7J\ ο二、重組人源LECT2蛋白的活性驗(yàn)證
健康志愿者抽血加入抗凝劑，離心去除血漿，加入生理鹽水重懸，再加入葡聚糖，緩慢混勻，靜置去除紅細(xì)胞。經(jīng)Percoll梯度離心，獲得人嗜中性粒細(xì)胞，按照2X1 O6 / mL重懸于RPMI1640 (生產(chǎn)廠家hvitrogen)完全培養(yǎng)基備用。利用Beydon趨化小室法(生產(chǎn)廠家Corning)對(duì)利用本方法制備得到的重組人源LECT2蛋白進(jìn)行活性測(cè)定。在趨化小室的底孔中，加入重組人源LECT2蛋白，設(shè)置濃度梯度分別為0、0. 1 μ g/mL、1.0μ g/mL、10 μ g/mL、100 μ g/mL,變性重組人源LECT2蛋白作為陰性對(duì)照。趨化小室底孔上面覆蓋5. 0 μ m孔徑的無(wú)聚乙烯吡咯酮多聚碳酸酯膜，再覆蓋上頂板，于趨化小室頂孔中加入50 μ L人嗜中性粒細(xì)胞。將整個(gè)小室置37°c、5% C02，孵育箱中作用池。取出多聚碳酸酯膜，刮去上表面殘留的細(xì)胞，將整個(gè)膜置于甲醛中固定，再進(jìn)行姬姆薩染色。在顯微鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)高倍視野中遷移至多聚碳酸酯膜背面的染色細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算趨化指數(shù)CTU:100X (SM-RM) / (FM-RM)，SM表示待測(cè)樣品遷移細(xì)胞數(shù)，RM表示空白對(duì)照遷移細(xì)胞數(shù)，F(xiàn)M表示陽(yáng)性對(duì)照(趨化肽FMLP)遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，重組人源LECT2蛋白針對(duì)人嗜中性粒細(xì)胞，具有明顯的趨化活性。不同稀釋濃度的蛋白對(duì)靶細(xì)胞的趨化呈現(xiàn)量效關(guān)系，在濃度為1. 0 μ g/mL時(shí)，CTU最高值為250。上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于上述實(shí)施方式所述的技術(shù)方案，而以權(quán)利要求所述的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法，其特征在于步驟如下(1)構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒抽取人外周血細(xì)胞中RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA得到人源LECT2蛋白基因序列，登錄號(hào)為 NM002302,以此為模板設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增人源LECT2蛋白，將含人源LECT2基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶&oRI和^μI雙酶切，將用相同限制性內(nèi)切酶和^ΜI雙酶切的質(zhì)粒PPICZ α A與酶切后的PCR產(chǎn)物用Τ4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia中， 得到重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α -LECT2 ；(2)篩選高表達(dá)重組工程菌株將重組表達(dá)質(zhì)粒？？扣2(1-1^012經(jīng)5^1酶切后，將感受態(tài)畢赤酵母Χ33細(xì)胞與經(jīng)Mel 酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)粒pPICZ α -LECT2按比例16ul Iug混合后，進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)化子，將轉(zhuǎn)化子經(jīng)博萊霉kocin高抗性篩選及PCR鑒定，陽(yáng)性克隆為重組工程菌X33/ pPICZ α -LECT2 ；將獲得的博萊霉高抗性重組工程菌株Χ33/ pPICZ α -LECT2接種于BMGY培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600達(dá)2. 0 6. 0收集細(xì)胞，重懸于BMMY培養(yǎng)基中，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，上清液用SDS-PAGE蛋白電泳及Wfestern blot免疫印跡鑒定分析，篩選表達(dá)水平為60_70mg/ L的菌株，得到高表達(dá)重組工程菌株；(3)高表達(dá)酵母菌株擴(kuò)大培養(yǎng)將高表達(dá)重組工程菌株接種于IOOmL BMGY培養(yǎng)基生長(zhǎng)，30 °C培養(yǎng)22-26小時(shí)直至 0D600達(dá)2. 0 6. 0，1500rpm離心5min收集菌體，然后將菌體轉(zhuǎn)入400mL BMMY培養(yǎng)基中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30°C繼續(xù)培養(yǎng)70-75小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，使畢赤酵母分泌表達(dá)重組人源LECT2蛋白；(4)重組人源LECT2蛋白的純化收集步驟(3)擴(kuò)大發(fā)酵后得到的上清液，經(jīng)強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱層析，收集第二洗脫峰的洗脫液濃縮后，再經(jīng)superdex 75分子篩分離純化，收集最高洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到純度達(dá)95%以上的重組人源LECT2蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法，其特征在于步驟(1)中PCR引物序列如下正向引物為 5’ -GGAATTCGGGCCATGGGCTAATATATG-3，，反向引物為 5，-GGGTACCCAGGTATGCAGTAGGGTCAC-3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法，其特征在于步驟(2)中所述的感受態(tài)畢赤酵母X33的制備方法如下將畢赤酵母X33接種于YPD 培養(yǎng)基中，30°C振蕩培養(yǎng)至0D600為1. 3-1. 5，離心收集菌體，用預(yù)冷無(wú)菌水和1 mol/L山梨醇各洗一次，最后用1 mol/L山梨醇200 μ L懸浮，即得到Χ33感受態(tài)畢赤酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法， 其特征在于步驟(2)具體過(guò)程如下(1)電擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)畢赤酵母Χ33獲得轉(zhuǎn)化子將80 μ L感受態(tài)畢赤酵母Χ33細(xì)胞和5 μ g SacI酶切線性化的重組表達(dá)質(zhì)?；旌希?1500ν，25μΡ，20(Μ條件下電擊轉(zhuǎn)化，用濃度為1 mol/L山梨醇懸浮，30°C靜置1小時(shí)，再加入YPD培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)3小時(shí)得到轉(zhuǎn)化液，將轉(zhuǎn)化液涂布含100μ g/ml博萊霉kocin的 YPDS平板，30 °C培養(yǎng)3 4天，得到大量轉(zhuǎn)化子；(2)博萊霉高抗性重組工程菌株X33/pPICZ α -LECT2的制備將轉(zhuǎn)化子點(diǎn)到含1000 μ g/ml博萊霉的YPDS培養(yǎng)基上，獲得博萊霉高抗性菌株，將博萊霉高抗性菌株的菌落置于無(wú)菌水中，混勻并煮沸，離心后取上清進(jìn)行PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性克隆獲得博萊霉高抗性重組工程菌株X33/ pPICZ α -LECT2 ；(3)高表達(dá)重組工程菌株的制備將博萊霉高抗性重組工程菌株Χ33/ 扣2(1-1^012接種于51^ BMGY培養(yǎng)基中，30 V 培養(yǎng)22-26小時(shí)至0D600達(dá)2. 0 6. 0，1500rpm離心5min收集菌體，用40 mL BMMY培養(yǎng)液懸浮菌體，0. 5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，30°C繼續(xù)培養(yǎng)70-75小時(shí)，每M小時(shí)補(bǔ)加一次甲醇，取發(fā)酵液離心，上清液用于12% SDS-PAGE蛋白電泳及Wfestern blot蛋白免疫印跡鑒定分析，篩選表達(dá)水平為60-70mg/L的菌株，得到高表達(dá)重組工程菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法，其特征在于步驟(4)具體如下收集步驟(3)擴(kuò)大發(fā)酵后得到的上清液濃縮至10 mL后，上樣強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱，以3.0 ml/min的流速洗脫，洗脫液為lmol/L氯化鈉溶液，收集第二洗脫峰的洗脫液濃縮至500ul后，上樣superdex 75分子篩層析柱，以1. 0 ml/min的流速洗脫，洗脫液為lOOmmol/L碳酸銨溶液，收集最高洗脫峰的洗脫液進(jìn)行真空冷凍干燥，即得到純度達(dá)95%以上的重組人源LECT2蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化方法，特點(diǎn)是包括將人工合成的人源LECT2基因插入胞外表達(dá)載體pPICZαA中構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒的步驟；酶切線性化后電擊導(dǎo)入畢赤酵母X33中，獲得重組工程菌株的步驟；經(jīng)過(guò)搖瓶發(fā)酵和甲醇誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)重組人源LECT2蛋白的分泌表達(dá)的步驟；再利用柱層析進(jìn)行純化制備得到純度為95%以上的重組人源LECT2蛋白的步驟，優(yōu)點(diǎn)是首次提出了重組人源LECT2蛋白在畢赤酵母中得分泌表達(dá)和純化制備方法，采用畢赤酵母大量表達(dá)高活性的重組人源LECT2蛋白，具有穩(wěn)定、產(chǎn)量高、活性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，可用于制藥和診斷檢測(cè)。
文檔編號(hào)C07K1/18GK102559739SQ20121001877
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月20日
發(fā)明者史雨紅, 李明云, 李長(zhǎng)紅, 章瑞程, 陸新江, 陳炯 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)