專利名稱：一種羊口瘡病毒蛋白o(hù)rfv059單克隆抗體雜交瘤a3及單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞工程領(lǐng)域，具體涉及羊口瘡病毒結(jié)構(gòu)蛋白0RFV059單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株A3及單克隆抗體。
背景技術(shù)：
羊傳染性膿皰病(Orf)又稱羊傳染性膿皰性炎，俗稱羊口瘡，是由羊口瘡病毒 (ORFV)引起的山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病。其病變特征是患羊口唇等處皮膚和黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀結(jié)痂。羔羊極易感，多群發(fā)。本病在世界各地均有發(fā)生，我國主要養(yǎng)羊區(qū)也較常見，是危害羊群的主要疾病之一。該病毒抵抗力強(qiáng)，羊群一旦被感染則不易清除，可持續(xù)危害羊群多年，給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。ORFV病毒屬痘病毒科，副痘病毒屬。病毒粒子呈磚形或橢圓形，其表面呈繩索樣縱橫交錯排列結(jié)構(gòu)。該病毒可在牛、綿羊、山羊的腎細(xì)胞以及犢牛和羔羊的睪丸細(xì)胞上生長， 并產(chǎn)生細(xì)胞病變。ORFV引發(fā)病灶的病理組織學(xué)特征包括角化細(xì)胞的空泡變化、腫脹，細(xì)胞間質(zhì)玻璃樣變性，表皮增生顯著，表皮內(nèi)微腫脹，皮下組織中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(DCs)、 T細(xì)胞和B細(xì)胞聚集。羊口瘡分布廣泛，傳染性強(qiáng)，一旦爆發(fā)會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病毒在病變部位持續(xù)存在，患病動物易重復(fù)感染，目前無有效疫苗，防控困難。因此，羊口瘡病毒的早期、準(zhǔn)確檢出對于疾病的控制和預(yù)防具有重要的意義。獸醫(yī)臨床上羊口瘡病的診斷主要根據(jù)其典型癥狀進(jìn)行診斷，但無法與口蹄疫(foot-and-mouth disease, FMD)和羊痘(Capripox)區(qū)分。 目前所采用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法分為，(1)免疫學(xué)方法，如ELISA，Western blotting等； (2)病理組織學(xué)方法，如免疫組織化學(xué)(IHC)等；( 分子生物學(xué)方法，如PCR和限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析等。其中以免疫學(xué)診斷方法最為重要，因其具有靈敏、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，而特異性的抗體尤其是單克隆抗體是免疫學(xué)診斷中最重要的工具。近年，在我國吉林省和甘肅省的羊群中幾次爆發(fā)羊口瘡疫情，由于特異性抗體的缺乏，疾病控制和進(jìn)一步研究工作無法有效開展。ORFV基因組全長約138kb，G+C含量豐富(63%-64%)，含132個基因。通過對羊口瘡病毒不同株(系)的基因組分析表明，0RFV059基因編碼的是一個免疫顯性蛋白。該蛋白定位于成熟病毒粒子胞膜，是C端錨定蛋白，與痘苗病毒H3L免疫顯性蛋白結(jié)構(gòu)相似，它在病毒成熟、吸附、致病的分子機(jī)制以及疾病診斷和亞單位疫苗研發(fā)等過程中具有重要作用。 因此，0RFV059有作為潛在的臨床診斷靶標(biāo)的可能，制備0RFV059的單克隆抗體具有十分重要的意義，可以為該蛋白功能的研究奠定基礎(chǔ)，同時為其作為疾病標(biāo)志物的可行性提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。由于0RFV059定位于成熟病毒粒子胞膜，通常在組織標(biāo)本中表達(dá)量較高，具有臨床檢測和驗(yàn)證的價值。由此，制備能用于臨床標(biāo)本免疫組化檢測的0RFV059單克隆抗體進(jìn)行大批量組織標(biāo)本的驗(yàn)證，可為其作為羊口瘡臨床診斷靶標(biāo)的驗(yàn)證提供有力工具。本發(fā)明具有以下的特點(diǎn)和優(yōu)勢
目前國內(nèi)外尚未有商品化0RFV059的抗體，且其單抗亞型為IgG2b型，能用于ELISA、 western-blot、免疫熒光以及免疫組織化學(xué)檢測，從而為該蛋白作為臨床靶標(biāo)驗(yàn)證及其功能的研究奠定了堅實(shí)的基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能用于ELISA、western-blot、免疫熒光以及免疫組織化學(xué)檢測的抗羊口瘡病毒蛋白0RFV059單克隆抗體。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
本發(fā)明所述的檢測羊口瘡病毒蛋白0RFV059的抗體是用原核重組表達(dá)的0RFV059蛋白作為抗原免疫BALB/C小鼠獲得，并用細(xì)胞融合技術(shù)獲得產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤細(xì)胞株A3， 雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體為IgG2b陽性，輕鏈為κ型。所述抗羊口瘡病毒蛋白0RFV059單克隆抗體雜交瘤A3，于2011年11月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. MM。本發(fā)明中羊口瘡病毒蛋白0RFV059的氨基酸序列為AAR981M，如SEQ ID NO :1所示。本發(fā)明中羊口瘡病毒蛋白0RFV059的基因序列為AY386^3，如SEQ ID NO :2所示。本發(fā)明中0RFV059的全長基因是由羊口瘡病毒基因組為模板，由PCR擴(kuò)增獲得。 擴(kuò)增 0RFV059 基因的引物序列為上游引物5，-CATTAAC CATGGATCCACCCGAAATCACGGC-3， (SEQ ID NO :3)，下游引物5，- AATCATCTCGAGCACGATGGCCGTGACCAGCAGC-3，(SEQ ID NO: 4)。上游引入NcoI內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引入BioI內(nèi)切酶位點(diǎn)。原核表達(dá)載體選擇pET48a (+ )。所述的保藏號為CGMCC No. 5424的雜交瘤細(xì)胞株A3的制備方法是取血清效價大于1 IO5的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用50% PEG-4000進(jìn)行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，用重組表達(dá)的0RFV059蛋白包被ELISA板，進(jìn)行ELISA篩選；經(jīng)過多次有限稀釋，最后獲得穩(wěn)定分泌抗0RFV059單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，標(biāo)記為A3。應(yīng)用此株雜交瘤細(xì)胞以IX IO6/只的量注入石蠟預(yù)處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察10-14天后小鼠腹部膨大時抽取腹水。采用親和色譜法ftOtein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，以SDS-PAGE鑒定單克隆抗體的純度，純度達(dá)到90%以上。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明特色如下
本發(fā)明以重組0RFV059蛋白包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的活性，并用此純化抗體對純化的羊口瘡病毒蛋白進(jìn)行Wfestern-blot證明該抗體可以識別0RFV059蛋白。本發(fā)明將此純化抗體用于進(jìn)行羊口瘡病毒的免疫熒光染色以及羊口瘡組織的免疫組化染色證明其能識別天然的0RFV059蛋白。此株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體為進(jìn)一步研究的0RFV059功能和開發(fā)0RFV059的診斷試劑奠定了基礎(chǔ)，為其作為羊口瘡臨床診斷和治療靶標(biāo)的驗(yàn)證提供有力的工具。本發(fā)明的單克隆抗體其免疫原是原核重組表達(dá)0RFV059全長蛋白，其氨基酸序列為AAR981M，全長338個氨基酸。本發(fā)明的單克隆抗體除了能應(yīng)用于ELISA和Wfestern檢測變性0RFV059蛋白以外還可以應(yīng)用于細(xì)胞免疫熒光和臨床羊口瘡組織標(biāo)本免疫組化研究檢測未變性的天然0RFV059蛋白，同時降低了應(yīng)用成本。本發(fā)明的單克隆抗體能特異性識別多種羊口瘡病毒分離株的0RFV059蛋白，與痘病毒科的其它病毒，如羊痘病毒、雞痘病毒、痘苗病毒等無交叉反應(yīng)。目前國內(nèi)外尚無針對羊口瘡病毒特異性抗體，而本發(fā)明的抗體不僅能與變性蛋白結(jié)合，還能與具有高級結(jié)構(gòu)的天然蛋白結(jié)合，從而能應(yīng)用于免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明針對0RFV059全長蛋白制備出的單克隆抗體對檢測該蛋白具有較高的特異性和靈敏度，該抗體的應(yīng)用將為0RFV059功能研究和其作為羊口瘡標(biāo)志物的臨床標(biāo)本驗(yàn)證工作提供支持。
圖1是本發(fā)明單抗A3對羊口瘡病毒免疫印跡的結(jié)果，其結(jié)合條帶的分子量約為 39kDa。1. 10 μ g OFTu細(xì)胞裂解蛋白；2. 2 μ g純化重組0RFV059蛋白；3. 2 μ g純化病毒蛋白。圖2是本發(fā)明單抗A3對羊口瘡病毒免疫熒光染色的結(jié)果，5 MOI羊口瘡病毒感染 OFTu細(xì)胞，分別于接種后12和M小時收集細(xì)胞，4%多聚甲醛固定，先后用單抗A3及綠色熒光標(biāo)記的羊抗鼠二抗孵育，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。圖3是本發(fā)明單抗A3對羊口瘡病變組織免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果，A.抗 0RFV059單克隆抗體A3，B.正常鼠血清(陰性對照)，(顯微鏡放大倍數(shù)400倍)。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1 本發(fā)明單克隆抗體的制備和鑒定 1、單抗A3的制備
1)重組0RFV059抗原制備
以羊口瘡病毒基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得全長0RFV059基因，構(gòu)建原核重組表達(dá)載體 pET28a(+)/0RFV059，在大腸桿菌fec力 ric力ia coli BL21 中表達(dá)，利用 Ni Sepharose 親和層析純化柱進(jìn)行純化，獲得純度達(dá)90%以上的重組0RFV059蛋白。2)免疫小鼠
以純化的重組抗原免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。第一次免疫取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠；
第二次免疫隔2周后，取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠；
第三次免疫再隔2周后，取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾靜脈取血，以重組抗原包被，ELISA檢測血清效價，取效價大于1:105的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合； Bentonite佐劑使用商品化產(chǎn)品。3)免疫血清效價測定采用間接ELISA法測定免疫血清效價。取50yg重組0RFV059蛋白溶解于IOml 0. 05M PH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C過夜。使用PBS(含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，用IOmM PBS含1 % BSA封閉液100 μ 1/孔，37°C封閉2h，使用 PBS (含有0.05% (V/V) Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾靜脈采血，鼠免疫血清用含1 % BSA IOmM PBS進(jìn)行1(Γ2 1(Γ8倍稀釋，加入96孔板，100 μ 1/孔37°C Ih, PBS (含有0.05% (V/V) Tween-20)洗板三次后，加入1 :10000倍稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgG (Sigma，INC. )，100μ 1/孑 L 37 °C 30min，同上洗板后，TMB 顯色，100 μ 1/孔，室溫避光IOminJn 50 μ 1/孔2Μ H2SO2終止反應(yīng)，測450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作為陰性對照，以測定值與對照值得比> 2. 1為陽性來判斷免疫血清的效價。4)雜交瘤的制備
取血清效價大于1: IO5的小鼠，融合前3天，取重組抗原與等體積的PBS混勻后，以每只50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。無菌取小鼠脾臟，制成脾細(xì)胞懸液與對數(shù)生長期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0按1 :1的比例混合，IOOOXg室溫離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管底部，使沉淀松散，離心管置于37°C水浴中，將在37°C 水浴保溫的50%聚乙二醇(PEG, MW4000，Sigma)用滴管一滴滴加入離心管中，邊滴邊搖動離心管，Imin內(nèi)滴完，滴完后靜置2min，每隔1分鐘加入37°C預(yù)熱的無血清1640培養(yǎng)基1ml、 2ml,3ml,4ml,5ml和IOml來終止聚乙二醇的作用，細(xì)胞混合物IOOOXg室溫離心5min，棄上清，加入HAT培養(yǎng)液(次黃嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T) (HAT, Sigma))輕輕重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分至96孔板中，每孔200μ 1。培養(yǎng)三天后，觀察細(xì)胞融合情況，更換一半HAT培養(yǎng)液，連續(xù)數(shù)日，直至有克隆形成，融合后七天更換HT培養(yǎng)液(次黃嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T) (HT，Sigma))培養(yǎng)。5)篩選分泌抗0RFV059單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞
間接ELISA法篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清，選擇效價較高的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克隆化，并用有限稀釋法連續(xù)克隆化2-3次，直至到100%細(xì)胞陽性率，最后獲得穩(wěn)定分泌抗 0RFV059單克隆抗體細(xì)胞株，標(biāo)記為A3。將克隆化后陽性率達(dá)100%的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后液氮凍存。6)腹水的制備和純化
將A3雜交瘤細(xì)胞株以IX IO6/只的量注入液體石蠟預(yù)處理的8-10周齡的BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察10-14天后小鼠腹部膨大時抽取腹水。采用親和色譜法ftOtein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，以SDS-PAGE測定單克隆抗體的純度，純度達(dá)到90% 以上。2、本發(fā)明單克隆抗體的特性鑒定
1)抗體濃度的測定經(jīng)雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 5424制備的腹水經(jīng)純化后獲得0RFV059 單克隆抗體A3，使用BIO-RAD公司生產(chǎn)的Smart Spec plus核酸蛋白測定儀測定，其濃度為 0. 51mg/ml。2)抗體亞型鑒定采用Roche公司的鼠單抗亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株的亞型，A3分泌抗體的亞型為IgG2b型，輕鏈為κ鏈。3)純化抗體的效價鑒定50 μ g重組0RFV059抗原溶于IOml pH9. 6的0. 05M碳酸鹽包被緩沖液中，加入96孔板，每孔100yL，4°C過夜。PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，用IOmM PBS含1 % BSA封閉液150 μ 1/孔，37°C封閉2h，使用PBS (含有0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入100 μ 1純化抗體，37°C孵育lh, PBS (含有0. 05% (V/ V) Tween-20)洗板三次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG多克隆抗體為二抗，37°C孵育 30min, PBS (含有 0. 05% (V/V) Tween-20)洗板三次，每孔加入 100 μ 1，TMB 顯色，37°C 孵育15min后，加入2M H2SO4溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在吸光度值450 nm處檢測。4)抗體的Wfestern blot鑒定0FTu細(xì)胞裂解蛋白、純化的羊口瘡病毒蛋白及重組 0RFV059蛋白用2 X SDS裂解緩沖液裂解后上樣，經(jīng)12%SDS_PAGE后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉lh，pH7. 4的Tris-HCl緩沖液(含有0. 1% (V/ V) Tween-20)洗膜3次，每次5min，1 1000加入經(jīng)純化的雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 5424制備的抗0RFV059單克隆抗體A3，4°C孵育過夜，pH7. 4的1Tris-HCl緩沖液(含有0. 1% (V/ V) Tween-20)洗膜3次，每次5min，加入1:10000稀釋的羊抗鼠IgG多克隆抗體(Sigma) 為二抗，室溫孵育2h，TBST洗膜3次，用濾紙吸去多余的溶液，平鋪于干凈的保鮮紙上，力口入 L4ml Pierce-Thermo Scientific ECL 系列 Western 化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液(A:B=1 1 )， 使膜完全浸潤于反應(yīng)液中，迅速取出，用濾紙吸去多余液體，鋪于另一張保鮮紙上，用保鮮紙把膜包好，放入X射線攝影暗盒，在暗房中顯影。雜交瘤細(xì)胞CGMCC No.54M制備的抗 0RFV059單克隆抗體A3出現(xiàn)單一的特異性條帶，結(jié)果如圖1所示。5)抗體的免疫熒光鑒定收集原代綿羊胎兒鼻甲骨(OFTu)細(xì)胞鋪于玻璃片上生長過夜，羊口瘡病毒(ORFV)感染(M0I=5)，分別于12、24h后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞，使用預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì)胞，加入雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 5424制備的抗0RFV059單克隆抗體 A3 (1:1000稀釋)，室溫孵育lh，以PBS為陰性對照。PBS洗片后1:1000加入Alex 594 (紅色熒光)標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Sigma)，室溫孵育lh，DAPI (藍(lán)色)染色lOmin，PBS洗片后， 熒光顯微鏡下觀察，經(jīng)抗0RFV059單克隆抗體A3染色的細(xì)胞均觀察到綠色熒光，如圖2所示。結(jié)果證明雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 5424制備的抗0RFV059單克隆抗體A3可識別天然的 0RFV059 蛋白。6)抗體的免疫組化(IHC)鑒定收集患羊病變組織，利用純化后的雜交瘤細(xì)胞 CGMCC No. 5似4制備的抗0RFV059單克隆抗體A3 (1 1000稀釋)進(jìn)行免疫組化染色，使用福建邁新公司的免疫組化試劑盒，染色方法參照邁新試劑盒說明書，DAB顯色，陰性對照組以正常鼠血清代替一抗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗0RFV059單克隆抗體A3染色的組織標(biāo)本上細(xì)胞被染成棕黃色，如圖3所示。病變組織的免疫組化染色結(jié)果證明雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 5424制備的抗0RFV059單克隆抗體A3可識別天然的0RFV059蛋白。7)抗體對不同羊口瘡病毒分離株和其它痘病毒的反應(yīng)性檢測采用ELISA和 IHC方法檢測抗0RFV059單克隆抗體A3對不同羊口瘡病毒分離株和其它種屬痘病毒的反應(yīng)性。結(jié)果如表1所示，抗0RFV059單克隆抗體A3能識別從中國分離的各不同地區(qū)的ORFV 分離株以及美國標(biāo)準(zhǔn)ORFV分離株0V-IA82，而與其它種屬的痘病毒，如痘苗病毒、羊痘病毒和雞痘病毒無交叉反應(yīng)。
表1.本發(fā)明單抗A3對不同羊口瘡病毒分離株和其它痘病毒的反應(yīng)性
權(quán)利要求
1.一種抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株A3，于2011年11月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. MM。
2.一種抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體A3，其特征是由權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞株A3分泌所得。
3.權(quán)利要求1所述抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株A3的制備方法， 其特征是取血清效價大于1 :105的BALB/c小鼠脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按常規(guī)方法用 50%PEG-4000進(jìn)行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培養(yǎng)基篩選融合細(xì)胞，用重組表達(dá)的羊口瘡病毒0RFV059蛋白包被ELISA板，進(jìn)行ELISA篩選；經(jīng)過多次有限稀釋，最后獲得穩(wěn)定分泌抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，標(biāo)記為A3。
4.一種檢測羊口瘡病毒0RFV059表達(dá)情況的免疫檢測試劑，其特征是含有權(quán)利要求2 所述抗羊口瘡病毒0RFV059單克隆抗體A3。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種羊口瘡病毒蛋白ORFV059單克隆抗體雜交瘤A3及單克隆抗體。一種抗羊口瘡病毒ORFV059單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株A3，于2011年11月4日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No.5424。本發(fā)明以重組ORFV059蛋白包被ELISA板，通過ELISA法檢測純化抗體的活性，并用此純化抗體對純化的羊口瘡病毒蛋白進(jìn)行Western-blot證明該抗體可以識別ORFV059蛋白。本發(fā)明將此純化抗體用于進(jìn)行羊口瘡病毒的免疫熒光染色以及羊口瘡組織的免疫組化染色證明其能識別天然的ORFV059蛋白。此株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體為進(jìn)一步研究的ORFV059功能和開發(fā)ORFV059的診斷試劑奠定了基礎(chǔ)，為其作為羊口瘡臨床診斷和治療靶標(biāo)的驗(yàn)證提供有力的工具。
文檔編號C07K16/08GK102559605SQ20121001737
公開日2012年7月11日 申請日期2012年1月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者廖小青, 李宏, 李明, 羅樹紅, 郝文波 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)