專利名稱：一種蚯蚓提取物及其提取方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種以蚯蚓成蟲(chóng)為原料提取具有很強(qiáng)生物活性的蚯蚓多肽，同時(shí)還涉及該蚯蚓多肽的提取方法和該蚯蚓多肽的應(yīng)用，屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
帕金森病(Parkinson' s disease, PD)是ー種中老年常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，以黑質(zhì)多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元缺失和Lewy小體形成為其主要病理特征。隨著我國(guó)人口老齡化進(jìn)程的加快，H)發(fā)病率日益增高。目前絕大多數(shù)H)患者以藥物治療為主，雖能改善臨床癥狀，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)“開(kāi)-關(guān)”現(xiàn)象、運(yùn)動(dòng)及精神障礙等副作用，且仍無(wú)法延緩DA能神經(jīng)元進(jìn)行性變性。近年來(lái)藥物治療的研究由直接補(bǔ)充DA轉(zhuǎn)向多環(huán)節(jié)作用，研究重點(diǎn)集中于對(duì)DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用及減少多巴制劑毒副作用上，但其臨床效果尚不令人滿意。因此，針對(duì)H)發(fā)病機(jī)制，研發(fā)療效明確且毒副作用少的藥物，已成為當(dāng)今老年醫(yī) 學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。蚯蚓在我國(guó)入藥已有幾千年的歷史，中藥俗稱為地龍，性寒，味威，具有清熱定驚、通絡(luò)、平喘、利尿之功效，是我國(guó)重要的中藥材之一。最早的中藥學(xué)專著《神農(nóng)本草經(jīng)》中收載的67種動(dòng)物藥中就有蚯蚓。《本草綱目》中用蚯蚓入藥的處方有40多種?！吨兴幋筠o典》中記載用蚯蚓配方治療各種疾病者達(dá)30多處?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蚯蚓具有多方面的藥理學(xué)活性具有抗凝血、溶血栓的雙重作用、降壓作用、免疫增強(qiáng)作用、殺滅精子、強(qiáng)化精子的雙向作用、抗癌作用、解熱、抗腦缺血、平喘、抗菌、抗氧化、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)和細(xì)胞再生等作用。其中以纖溶酶的研究最多，取得較大進(jìn)展，其他有效部位及成分尚不十分明確。作為ー種常用動(dòng)物藥材，其化學(xué)成分種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，大多為高分子有機(jī)化合物，雖然由于其藥理活性顯著，資源豐富，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但在化學(xué)成分、藥理等方面的基礎(chǔ)研究相對(duì)薄弱，大大限制了其在臨床上的深入應(yīng)用，而蚯蚓多肽作為ー種天然來(lái)源的活性肽具有分子量小、制備相對(duì)容易、純度高、抗原性弱、功能較明確、特異性強(qiáng)、毒副作用小、易于多途徑吸收等大分子蛋白不可比擬的優(yōu)點(diǎn)。目前，有關(guān)蚯蚓多肽的提取方法及具體藥理作用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種蚯蚓提取物。同時(shí)，本發(fā)明的目的還在于提供了ー種蚯蚓提取物的提取方法。進(jìn)ー步地，本發(fā)明的目的還在于提供了ー種該蚯蚓提取物在構(gòu)建對(duì)帕金森病離體細(xì)胞模型保護(hù)方面的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了ー種蚯蚓提取物，由以下方法提取獲得(1)粗多肽的制備新鮮冰凍艇蝴(赤子愛(ài)勝艇蝴，Eisenia foetida) Ikg,切成小段，用預(yù)先冷卻的蒸餾水(3_5°C )沖洗，至完全無(wú)血色為止；絞肉機(jī)絞成肉泥，加入預(yù)冷的勻漿液(pH為4的甘氨酸水溶液5000ml)用膠體磨反復(fù)勻漿；所得勻漿液離心(4°C，5500rpm，lOmin)，取上清，加入95%こ醇使其終濃度達(dá)到60%，4°C放置并攪拌，4h后離心(4°C，5500rpm，15min)，取上清；所得上清真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(55°C )回收こ醇至濃縮液體積為500ml ；濃縮液冷凍干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，_20°C保存為凍干品待用；以上操作除回收こ醇外均應(yīng)在低溫4°C條件下進(jìn)行；(2)粗多肽的脫鹽純化取上述凍干品2. 5g,用IOml蒸懼水溶解，以SephadexG-25為介質(zhì)裝填層析柱(柱規(guī)格ct35mmX30Cm)，層析柱用蒸餾水充分平衡，將樣品加入柱內(nèi)，用蒸餾水洗脫，流速為2. 5ml/min，至出峰時(shí)起用自動(dòng)餾分收集器收集，每管IOml ;采用電導(dǎo)率儀測(cè)定各管的電導(dǎo)率，將峰前部分收集，凍干得凍干品即為蚯蚓多肽。步驟⑵得到的凍干品在-20°C保存。本發(fā)明的技術(shù)方案還在于采用了ー種蚯蚓提取物的提取方法，包括以下步驟(I)粗多肽的制備新鮮冰凍蟲(chóng)丘蝴(赤子愛(ài)勝艇蝴，Eisenia foetida) Ikg,切成小段,用預(yù)先冷卻的蒸懼水(3-5°C )沖洗，至完全無(wú)血色為止；絞肉機(jī)絞成肉泥，加入預(yù)冷的勻衆(zhòng)液(pH為4的甘氨酸水溶液5000ml)用膠體磨反復(fù)勻漿；所得勻漿液離心(4°C，5500rpm，IOmin)， 取上清，加入95 %こ醇使其終濃度達(dá)到60 %，4°C放置并攪拌，4h后離心(4°C，5500rpm,15min)，取上清；所得上清真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(55°C )回收こ醇至濃縮液體積為500ml ;濃縮液冷凍干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，_20°C保存為凍干品待用；以上操作除回收こ醇外均應(yīng)在低溫4°C條件下進(jìn)行；(2)粗多肽的脫鹽純化取上述凍干品2. 5g,用IOml蒸懼水溶解，以SephadexG-25為介質(zhì)裝填層析柱(柱規(guī)格ct35mmX30Cm)，層析柱用蒸餾水充分平衡，將樣品加入柱內(nèi)，用蒸餾水洗脫，流速為2. 5ml/min，至出峰時(shí)起用自動(dòng)餾分收集器收集，每管IOml ;采用電導(dǎo)率儀測(cè)定各管的電導(dǎo)率，將峰前部分收集，凍干得凍干品即為蚯蚓多肽。本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了ー種該蚯蚓提取物-蚯蚓多肽在構(gòu)建對(duì)帕金森病離體細(xì)胞模型保護(hù)方面的應(yīng)用。本發(fā)明建立系統(tǒng)的蚯蚓多肽提取方法，通過(guò)該方法可以獲得純度及收率較高的活性蚯蚓多肽；證明蚯蚓多肽對(duì)I-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶離子(MPP+)所致大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞(PC12)損傷的保護(hù)作用。對(duì)提取物蚯蚓多肽理化性質(zhì)分析檢測(cè)用Lowry法測(cè)定蚯蚓多肽的蛋白含量；SDS-PAGE、激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜、HPLC法對(duì)蚯蚓多肽進(jìn)行分析檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明提取的蚯蚓多肽對(duì)I-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶離子(MPP+)所致大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞(PC12)損傷具有明顯的保護(hù)作用，并初步探討了其作用機(jī)制是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和線粒體膜電位來(lái)保護(hù)PC12細(xì)胞的，蚯蚓多肽對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，可以顯著提高受損細(xì)胞的活力。
圖I為L(zhǎng)owry法測(cè)定多肽含量標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為蚯蚓多肽的SDS-PAGE圖譜；圖3為蚯蚓多肽激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜圖；圖4為蚯蚓多肽HPLC檢測(cè)圖譜；圖5為MPP+作用48h后的PC12細(xì)胞活力測(cè)定比較圖6為Α0/ΕΒ熒光染色PC12細(xì)胞的形態(tài)改變圖；圖7為蚯蚓多肽對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞周期的影響；圖8為蚯蚓多肽對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞線粒體膜電位的影響。
具體實(shí)施例方式本實(shí)施例的蚯蚓提取物，由以下方法提取獲得(I)粗多肽的制備新鮮冰凍蚯蚓(赤子愛(ài)勝艇蝴，Eisenia foetida) Ikg,切成小段,用預(yù)先冷卻的蒸懼水(3_5°C )沖洗,至完全無(wú)血色為止；絞肉機(jī)絞成肉泥，加入預(yù)冷的勻衆(zhòng)液(pH為4的甘氨酸水溶液5000ml)用膠體磨反復(fù)勻漿；所得勻漿液離心(4°C，5500rpm，IOmin)，取上清，加入95%こ醇使其終濃度達(dá)到60%，4°C放置并攪拌，4h后離心(4°C，5500rpm，15min)，取上清；所得上清真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(55°C )回收こ醇至濃縮液體積為500ml ;濃縮液冷凍干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，_20°C保存為凍干品待用；以上操作除回收こ醇外均應(yīng)在低溫4°C條件下進(jìn)行；
(2)粗多肽的脫鹽純化取上述凍干品2. 5g,用IOml蒸懼水溶解，以SephadexG-25為介質(zhì)裝填層析柱(柱規(guī)格ct35mmX30Cm)，層析柱用蒸餾水充分平衡，將樣品加入柱內(nèi)，用蒸餾水洗脫，流速為2. 5ml/min，至出峰時(shí)起用自動(dòng)餾分收集器收集，每管IOml ；采用電導(dǎo)率儀測(cè)定各管的電導(dǎo)率，將峰前部分收集，凍干得凍干品即為蚯蚓多肽，凍干品在-20°C保存。提取物——蟲(chóng)丘蚓多肽相關(guān)試驗(yàn)如下蚯蚓多肽對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用(I)細(xì)胞培養(yǎng)PC12細(xì)胞置于含5%新生牛血清，10%馬血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中，并在含5%CO2的37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞每2d更換一次培養(yǎng)液，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)到85%即可傳代培養(yǎng)。(2) MPP+損傷的離體帕金森細(xì)胞模型的建立 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以I X IO5 ι Γ1接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μ I。24h細(xì)胞貼壁后去掉培養(yǎng)液，加入含不同濃度MPP+的培養(yǎng)液100 μ 1，設(shè)陰性對(duì)照組(加入不含MPP+的培養(yǎng)液100 μ I)和空白對(duì)照組(在無(wú)細(xì)胞孔中加入不含MPP+的培養(yǎng)液100 μ I)。培養(yǎng)48h后，每孔加入Smgir1MTT 20 μ 1，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后去掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μ I的ニ甲基亞砜(DMSO)，振蕩5min后，用酶標(biāo)儀在570nm處檢測(cè)每孔的吸光度(OD)值。細(xì)胞存活率=(陰性組OD值-空白OD值)/(加藥組OD值-空白組OD值)X 100%(3)不同濃度蚯蚓多肽對(duì)PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)細(xì)胞接種同上。待細(xì)胞貼壁后去掉培養(yǎng)液，加入含250 μ mo I ·じ1MPP+和含有不同濃度蚯蚓多肽的培養(yǎng)液100 μ 1，設(shè)模型對(duì)照組(加入含250 μ mo I ·じ1MPP+和10%血清的培養(yǎng)液100 μ I)和陰性對(duì)照組(加入10%血清的培養(yǎng)液100 μ I)。細(xì)胞培養(yǎng)和檢測(cè)同上。(4)熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)將細(xì)胞消化并調(diào)節(jié)密度為2X IO5 · πιΓ1，接種于12孔板，每孔500μ l，24h細(xì)胞貼壁后去掉培養(yǎng)液，加入含250 μ mo I ·じ1的MPP+和蚯蚓多肽的培養(yǎng)液500 μ 1，設(shè)模型對(duì)照組(加入含250 μ mo I じ1的MPP+和10%血清的培養(yǎng)液500 μ I)和陰性對(duì)照組(加入只含10%血清的培養(yǎng)液500 μ I)。培養(yǎng)48h后去培養(yǎng)液，加入濃度為I μ mo I じ1的吖啶橙(AO)溶液和溴化こ錠(EB)溶液各50μ 1，室溫下染色20min，于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞所發(fā)出的熒光與細(xì)胞形態(tài)并用數(shù)碼相機(jī)拍照。(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及線粒體膜電位調(diào)整細(xì)胞密度為IXlO6 ι Γ1接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后去掉培養(yǎng)液，加入含250 μ mo I ·じ1的MPP+和蚯蚓多肽的培養(yǎng)液2. 5ml，設(shè)模型對(duì)照組(加入含250 μ mo I ·じ1的MPP+和10%血清的培養(yǎng)液2. 5ml)和陰性對(duì)照組(加入含10%血清的培養(yǎng)液2. 5ml)。培養(yǎng)48h后收集6孔板中所有細(xì)胞，用PBS液洗兩次，離心去上清后加入PI染液(含PI50mg · ml-1, RNaselg · L_l, O. I % Tritonx-100) 0. 5ml, 4°C避光染色 30min,上流式檢測(cè)細(xì)胞周期，采用軟件ModFit LTTM3. 0(美國(guó)BD公司)處理，得出細(xì)胞各周期百分比。用同樣的方法收集細(xì)胞，并用PBS液洗細(xì)胞兩次，離心去上清，然后加入含40nmol · L-I的DioC6 (3)熒光探針和O. 5 %新生牛血清的PBS液O. 5ml，避光37°C反應(yīng)15min,上流式細(xì)胞儀分析線粒體膜電位變化情況。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 結(jié)果均以X土S表示，數(shù)據(jù)用SPSS 19. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。3.結(jié)果(I)本發(fā)明首次建立了蚯蚓多肽系統(tǒng)的提取方法并對(duì)所得蚯蚓多肽進(jìn)行了初步理化性質(zhì)的研究，結(jié)果如下①新鮮冰凍蚯蚓(赤子愛(ài)勝蚯蝴，Eisenia foetida)經(jīng)上述エ藝處理后，得到的凍干品外觀呈白色絮狀，有粘性，極易溶于水，最終收率可達(dá)18. 64%，蛋白含量測(cè)定為94. 7% (附圖 I)。②從SDS_PAGE(附圖2)和激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜圖(附圖3)上可以看到，上述エ藝所得到的蚯蚓多肽主要是分子量小于IOkDa的多肽類物質(zhì)。經(jīng)HPLC(附圖4)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)此蚯蚓多肽主要由4 6個(gè)組分組成。(2)本發(fā)明首先證明了上述エ藝所得蚯蚓多肽對(duì)I-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶離子(MPP+)所致大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞(PC12)損傷具有明顯的保護(hù)作用，并初步探討了其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和線粒體膜電位來(lái)保護(hù)PC12細(xì)胞的。結(jié)果如下①M(fèi)PP+對(duì)PC12細(xì)胞活力的影響分別在25，50，100，200，400，800 μ mo I ·じ1 MPP+作用下，PC12細(xì)胞的活力逐漸降低，其IC50為247μπιο1 じ1 (見(jiàn)附圖5)。取其整數(shù)值，本實(shí)驗(yàn)選擇250 μ mol じ1的MPP+構(gòu)建PC12細(xì)胞損傷模型。②蚯蚓多肽對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞活力的影響結(jié)果表明，蚯蚓多肽對(duì)MPP+損傷的PC12細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，可以顯著提高受損細(xì)胞的活力，且呈一定的劑量依賴性。表I不同劑量蚯蚓多肽對(duì)MPP+損傷PC12細(xì)胞活力的影響。η = 5，
權(quán)利要求
1.ー種蚯蚓提取物，其特征在干由以下方法提取獲得 (1)粗多肽的制備、將冰凍蚯蚓1kg，切成小段，用預(yù)先冷卻的蒸餾水沖洗，至完全無(wú)血色為止；絞成肉泥，加入預(yù)冷的勻漿液，用膠體磨反復(fù)勻漿；所得勻漿液離心，取上清，カロ入95%こ醇使其終濃度達(dá)到60%，4°C放置并攪拌，4h后離心，取上清；所得上清真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收こ醇至濃縮液體積為500ml ;濃縮液冷凍干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20°C保存為凍干品待用； (2)粗多肽的脫鹽純化取步驟⑴所得的凍干品2.5g，用IOml蒸餾水溶解，以Sephadex G-25為介質(zhì)裝填層析柱、，層析柱用蒸餾水充分平衡，將樣品加入柱內(nèi)，用蒸餾水洗脫，流速為2. 5ml/min，至出峰時(shí)起用自動(dòng)餾分收集器收集，每管IOml ;測(cè)定各管的電導(dǎo)率，將峰前部分收集，凍干得凍干品即為蚯蚓多肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蚯蚓提取物，其特征在于步驟(I)所述的蚯蚓為赤子愛(ài)勝蟲(chóng)丘蟲(chóng)引，Eisenia foetida。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蚯蚓提取物，其特征在干步驟(I)中預(yù)先冷卻的蒸餾水的溫度為3-5で。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蚯蚓提取物，其特征在于步驟⑴中勻漿液為PH= 4的甘氨酸水溶液5000ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蚯蚓提取物，其特征在于步驟(I)中離心的條件為溫度4°C，轉(zhuǎn)速 5500rpm，時(shí)間 15min。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蚯蚓提取物，其特征在于步驟(I)中蒸發(fā)的溫度為55°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蚯蚓提取物，其特征在于步驟(I)中操作除回收こ醇外均應(yīng)在低溫4°C條件下進(jìn)行。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的蚯蚓提取物，其特征在于步驟(I)中步驟(2)得到的凍干品在-20°C保存。
9.ー種蚯蚓提取物的提取方法，其特征在于包括以下步驟(I)粗多肽的制備新鮮冰凍蚯蚓1kg，切成小段，用預(yù)先冷卻的蒸餾水(3-5°C )沖洗，至完全無(wú)血色為止；絞肉機(jī)絞成肉泥，加入預(yù)冷的勻漿液，PH為4的甘氨酸水溶液5000ml，用膠體磨反復(fù)勻漿；所得勻漿液離心(4°C，5500rpm, IOmin)，取上清，加入95 %こ醇使其終濃度達(dá)到60 %，4°C放置并攪拌，4h后離心(4°C,5500rpm, 15min),取上清；所得上清真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收こ醇至濃縮液體積為500ml ;濃縮液冷凍干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20°C保存為凍干品待用；以上操作除回收こ醇外均應(yīng)在低溫4°C條件下進(jìn)行； (2)粗多肽的脫鹽純化取上述凍干品2. 5g，用IOml蒸餾水溶解，以S印hadex G-25為介質(zhì)裝填層析柱(柱規(guī)格<t35mmX30Cm)，層析柱用蒸餾水充分平衡，將樣品加入柱內(nèi)，用蒸餾水洗脫，流速為2. 5ml/min，至出峰時(shí)起用自動(dòng)餾分收集器收集，每管IOml ;采用電導(dǎo)率儀測(cè)定各管的電導(dǎo)率，將峰前部分收集，凍干得凍干品即為蚯蚓多肽。
10.ー種蚯蚓提取物蚯蚓多肽在構(gòu)建對(duì)帕金森病離體細(xì)胞模型保護(hù)方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蚯蚓提取物及其提取方法和應(yīng)用，其中，提取物由以下方法提取獲得(1)粗多肽的制備將冰凍蚯蚓1kg，切成小段，用預(yù)先冷卻的蒸餾水沖洗，至完全無(wú)血色為止；絞成肉泥，加入預(yù)冷的勻漿液，用膠體磨反復(fù)勻漿；所得勻漿液離心，取上清，加入95％乙醇使其終濃度達(dá)到60％，4℃放置并攪拌，4h后離心，取上清；所得上清真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇至濃縮液體積為500ml；濃縮液冷凍干燥，得到蚯蚓多肽粗提物，-20℃保存為凍干品待用；(2)粗多肽進(jìn)行脫鹽純化，得到的凍干品即為蚯蚓多肽。本發(fā)明建立系統(tǒng)的蚯蚓多肽提取方法，通過(guò)該方法可以獲得純度及收率較高的活性蚯蚓多肽；證明蚯蚓多肽對(duì)1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶離子(MPP+)所致大鼠嗜鉻神經(jīng)瘤細(xì)胞(PC12)損傷具有保護(hù)作用。
文檔編號(hào)C07K1/14GK102675468SQ20121001465
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者崔朝初, 李瑞芳, 段冷昕, 辛吉樂(lè) 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)