專利名稱：負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域中的多肽技術(shù)及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域的疫苗技術(shù)，更具體的說(shuō)，涉及一種新的重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備。
背景技術(shù)：
腫瘤治療仍是世界性的難題，傳統(tǒng)的治療方法難以解決腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移， 1985年美國(guó)國(guó)家癌癥中心把腫瘤生物治療列入腫瘤治療的第四大模式。近年來(lái)腫瘤疫苗發(fā)展迅速，尤其是樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)疫苗被認(rèn)為是最具發(fā)展前景的治療技術(shù)。制備理想的腫瘤疫苗首先要選擇合適的腫瘤抗原。Ki-67是在增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原，與細(xì)胞的有絲分裂有關(guān)。Ki-67在多種腫瘤組織中高表達(dá)，使其已成為檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖活性最可靠的指標(biāo)。近年發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)與腫瘤的惡性程度及預(yù)后有關(guān)，在惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中起重要作用，是腫瘤治療新的靶點(diǎn)。鑒于Ki-67是一理想的腫瘤抗原，前期研究中我們運(yùn)用BIMAS和SYFPEITHI抗原表位預(yù)測(cè)軟件，對(duì)人Ki_67抗原片段的CTL表位綜合評(píng)分，得出分值較高的7個(gè)Ki-67候選肽，通過(guò)T2結(jié)合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，位于 Ki-67的280-288位置的LQGETQLLV多肽與HLA_A*0201分子具有高親和力。用候選肽刺激HLA-A*0201陽(yáng)性人外周血單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)IFN-Y分泌，證實(shí)該肽可以誘導(dǎo)特異性 CTL活化，免疫原性良好。在DC疫苗的設(shè)計(jì)過(guò)程中，佐劑的應(yīng)用、抗原的免疫原性及抗原負(fù)載體系是影響疫苗療效的重要參數(shù)。研究表明單純抗原多肽的自身穩(wěn)定性差，以及其與MHC I類分子的親和力低是影響DC疫苗的重要因素，直接導(dǎo)致其不能有效激發(fā)特異性免疫應(yīng)答。近年來(lái)gp96作為一種天然的免疫佐劑在腫瘤疫苗的研究中備受關(guān)注。 gp96 (glycoprotein 96，gp96)是熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)家族中研究和應(yīng)用最廣泛的一員，廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。研究發(fā)現(xiàn)其在免疫反應(yīng)中參與交叉激活，并起到佐劑作用。通過(guò)生化技術(shù)在體外觀察到，與gp96結(jié)合的抗原肽可由抗原遞呈細(xì)胞表面的通用受體CD91遞呈給MHC I分子，并引起抗原肽特異性CTL活化；誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；促進(jìn) T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和DC向腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，刺激Thl細(xì)胞因子(IFN- y、TNF- α和IL-12)表達(dá)，以增加腫瘤細(xì)胞的免疫原性。2005 年 6 月，歐洲藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)了 HSPPC-96 (Oncophage, Antigenics 公司) 應(yīng)用于腎細(xì)胞癌治療。HSPPC-96是自體腫瘤來(lái)源的gp96-抗原肽復(fù)合物合成制劑，它是用切除的癌組織制備而得。該制劑皮下注射可以使DC刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞，并引起記憶性免疫應(yīng)答。目前正進(jìn)行腎細(xì)胞癌和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤III期臨床試驗(yàn)。雖然自體腫瘤組織來(lái)源的gp96-抗原肽復(fù)合物疫苗取得了明顯的臨床療效，但在具體制備和應(yīng)用過(guò)程中存在以下問(wèn)題。首先gp96-肽復(fù)合物的純化工序復(fù)雜、產(chǎn)量低，難以滿足臨床免疫治療的需求，而且純度和制劑保存方面存在許多難題；其次，腫瘤組織的獲取、分離、純化在一定程度上限制了疫苗的來(lái)源。
Blachere研究證實(shí)，在體內(nèi)和體外組裝形成的gp96多肽復(fù)合物均能被抗原遞呈細(xì)胞攝取、加工，并通過(guò)MHC I類途徑提呈給腫瘤特異性的CTL。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種負(fù)載重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種負(fù)載重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，以腫瘤普遍表達(dá)的Ki-67作為抗原，將人工合成的Ki-67抗原的CTL表位肽與重組人gp96肽體外結(jié)合，制備gp96抗原肽復(fù)合物；將此復(fù)合物與體外誘導(dǎo)的樹(shù)突狀細(xì)胞共孵育，從而獲得負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。該樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗具有腫瘤治療和預(yù)防復(fù)發(fā)作用。該樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備包括如下步驟(1)重組人 gp96 蛋白(rhGrp94)合成；(2)采用固相合成法制備Ki-67抗腫瘤CTL表位肽；(3)重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物的制備；(4)體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞；(5)重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物與樹(shù)突狀細(xì)胞共同孵育培養(yǎng)，獲得樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗；(6)樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗功能驗(yàn)證。本發(fā)明技術(shù)方案的理論基礎(chǔ)如下1、gp96介導(dǎo)Ki67抗原肽高效進(jìn)入DC細(xì)胞DC表達(dá)HSP通用受體CD91，gp96通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞機(jī)制高效提呈Ki67抗原肽進(jìn)入DC。受體介導(dǎo)的抗原提呈效率比吞噬介導(dǎo)的提呈高IO4倍。2、gp96作為佐劑能活化DC :gp96本身具有誘導(dǎo)DC活化作用，gp96與DC的相互作用可以使炎癥因子含量增加，同時(shí)協(xié)同刺激因子如CD80和CD86的表達(dá)大幅升高。3、gp96_肽結(jié)合模型gp96肽結(jié)合口袋由200個(gè)氨基酸殘基組成，在反向β片層構(gòu)成的表面上，有一個(gè)由α螺旋組成的溝，肽配體即位于這個(gè)溝內(nèi)。肽結(jié)合口袋與gp96 二聚化結(jié)構(gòu)域毗連，與gp96_肽復(fù)合物的高度穩(wěn)定性，及其被傳遞給MHC-I類分子進(jìn)行抗原提呈有關(guān)。本發(fā)明將人工合成的腫瘤特異性Ki-67抗原的CTL表位肽與重組人gp96體外結(jié)合，制備gp96-抗原肽復(fù)合物。將此gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物與體外誘導(dǎo)的DC細(xì)胞共孵育， 從而獲得負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的DC疫苗。這種疫苗將有效避免采用腫瘤組織來(lái)源抗原帶來(lái)的將傳染性或其它毒性分子帶給病人的潛在危險(xiǎn)，以及避免因多種未知多肽混合物注入體內(nèi)而引發(fā)自身免疫疾病的可能。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述1、重組人gp96蛋白及Ki67抗原CTL表位肽的制備重組人gp96蛋白(rhGrp94)購(gòu)于ENZO公司，目錄號(hào)SPP-766，純度> 90%，用PBS 溶解，濃度為lpmol/ μ 1，所述的Ki67抗原CTL表位肽的制備方法，采用固相合成法，上海生
4工提供。首先將一個(gè)氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體王氏樹(shù)脂上， 然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接到固相載體上；然后將氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的第二個(gè)氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，最后切割得到目的肽。其序列為 Leu-Gln-Gly-Glu-Thr-Gln-Leu-Leu-Val。經(jīng) HPLC 純化后，其純度> 90%， 質(zhì)譜分析證實(shí)。用DMSO溶解，濃度為lOpmol/μ 1，分裝凍存。2、重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物的制備分別取IOpmol (10 μ 1)重組人gp96和IOOpmol (10 μ 1) Κ 67抗原CTL表位肽加入 1.5ml EP 管中，加 500 μ 1 肽結(jié)合緩沖液(含 20mM H印es、20mM NaCl、2mM MgCl2)于 50°C 共孵育lOmin，然后置于室溫30min。最后將結(jié)合液轉(zhuǎn)入microcon 50 (Amicon)中通過(guò)超濾除去未結(jié)合的游離肽，最后得到重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物3、體外誘導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞采集新鮮肝素抗凝的健康成人(HLA_A*0201)外周血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，生理鹽水清洗兩次，低速離心后得到細(xì)胞沉淀，用RPMI1640 重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 X 106/ml，按每孔3ml接種細(xì)胞于6孔板中，置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育使單核細(xì)胞貼壁，2小時(shí)后小心吸去未貼壁細(xì)胞，用生理鹽水輕輕沖洗，最后每孔力口 3ml DC培養(yǎng)基(為含 10% 自身滅活血漿，1000U/ml GM-CSF及 500U/ml IL-4 的 RPMI1640 培養(yǎng)基)。第7天收獲細(xì)胞，生理鹽水清洗3次后，重懸于PBS溶液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為 5X106/ml。4、重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物負(fù)載DC取200 μ 1上述制備的重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物加入至上述誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC 懸液中，混勻后加入6孔板中37°C共同孵育4小時(shí)。收集DC，生理鹽水清洗兩次，最后重懸于含(V/V)自身血漿的生理鹽水中，獲得負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。5、負(fù)載重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的質(zhì)量檢測(cè)及方法細(xì)菌、真菌檢測(cè)陰性，培養(yǎng)法支原體檢測(cè)陰性，PCR法內(nèi)毒素< lEU/ml，鱟試劑凝膠基質(zhì)顯色法(廈門鱟試劑廠)細(xì)胞活力及計(jì)數(shù)> 95%，Auto T4自動(dòng)計(jì)數(shù)儀(Cellometer)細(xì)胞純度LIN-> 80%，流式細(xì)胞儀細(xì)胞表面標(biāo)記鑒定及成熟度⑶la、⑶11c、⑶80、⑶86、HLA-DR結(jié)果重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物能夠促進(jìn)DC的成熟，這種DC能有效地刺激自體T細(xì)胞的增殖，為誘導(dǎo)Ki67特異性CTL的產(chǎn)生奠定了基本的物質(zhì)基礎(chǔ)。6、重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物對(duì)人DC分泌IL-12的刺激作用按照人IL-12ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，用ELISA方法檢測(cè)重組人gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物刺激DC的培養(yǎng)上清中IL-12的含量。對(duì)照組包括gp96組、Κ 67抗原肽組、PBS組。 根據(jù)細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線和酶標(biāo)儀450nm測(cè)得的OD值，計(jì)算出培養(yǎng)上清中IL-12的含量。結(jié)果顯示，gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物能顯著刺激DC分泌IL-12。IL-12能有效刺激ThO細(xì)胞向Thl細(xì)胞發(fā)育，調(diào)節(jié)機(jī)體Thl/Th2平衡，并進(jìn)一步刺激T細(xì)胞的增殖反應(yīng)及特異性CTL的誘導(dǎo)。 7,3H-TdR摻入法檢測(cè)人體外Ki67特異性CTL的殺傷活性效應(yīng)細(xì)胞利用全自動(dòng)免疫磁珠分選儀(Miltenyi,Germany)從人(HLA_A*0201陽(yáng)性)PBMC中分選⑶8+T淋巴細(xì)胞，然后用荷載gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的DC與⑶8+T細(xì)胞共培養(yǎng)3個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)7天，從而將所獲得的細(xì)胞作為CTL殺傷實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)細(xì)胞。靶細(xì)胞用同位素3H-TdR標(biāo)記的荷載Ki67表位肽的T2細(xì)胞作為靶細(xì)胞，進(jìn)行CTL 殺傷實(shí)驗(yàn)。我們的CTL殺傷實(shí)驗(yàn)分別設(shè)立了兩種不同的對(duì)照。其中一組是同一效應(yīng)細(xì)胞(gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物DC刺激的⑶8+T細(xì)胞)對(duì)不同的靶細(xì)胞的殺傷情況，靶細(xì)胞分別為荷載Ki67表位肽的T2靶細(xì)胞、荷載無(wú)關(guān)表位肽 (HIV-Ipol 476_484)的T2細(xì)胞、未荷載表位肽的T2細(xì)胞。第二組是不同組效應(yīng)細(xì)胞，包括DCgp96_Ki67刺激的T細(xì)胞、DCgp96刺激的T細(xì)胞、 DCKi67刺激的T細(xì)胞、DCpbs刺激的T細(xì)胞，對(duì)同一組靶細(xì)胞(荷載Ki67表位肽的T2細(xì)胞) 的殺傷情況。結(jié)果二組實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物DC刺激的⑶8+T細(xì)胞能特異性地殺傷荷載Ki67表位肽的T2細(xì)胞。結(jié)果表明gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物進(jìn)入DC后能夠被有效切割，并將表位肽分子運(yùn)送給MHC I類分子，形成MHCI-Ki67表位肽復(fù)合物被遞呈到細(xì)胞表面，從而刺激初始T細(xì)胞分化成為Ki67表位肽特異性CTL。8、CFSE/PI熒光染料標(biāo)記法檢測(cè)Ki67特異性CTL的殺傷活性利用全自動(dòng)免疫磁珠分選儀從人PBMC中分選CD8+T淋巴細(xì)胞，然后將荷載 gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的DC與CD8+T細(xì)胞共培養(yǎng)，所獲得的細(xì)胞作為特異性CTL殺傷的效應(yīng)細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎癌細(xì)胞786-0作為靶細(xì)胞。用CFSE標(biāo)記靶細(xì)胞，當(dāng)效應(yīng)細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞后，標(biāo)記有CFSE熒光染料的靶細(xì)胞膜受損，通透性發(fā)生改變，PI滲透到細(xì)胞內(nèi)使其著色，據(jù)此可用流式檢測(cè)CFSE/PI雙陽(yáng)性細(xì)胞占靶細(xì)胞的比例，從而反映細(xì)胞毒活性。結(jié)果顯示荷載gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物的DC與⑶8+T細(xì)胞共培養(yǎng)獲得的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)786-0細(xì)胞的殺傷率明顯高于對(duì)照組9、ELISP0T法原位檢測(cè)分泌IFN- γ的細(xì)胞CTL活化后可產(chǎn)生大量IFN- γ，IFN- γ又可刺激更多CTL的活化。將IFN- γ的捕獲抗體包被在貼有PVDF膜的微孔板上，加入細(xì)胞；若細(xì)胞分泌了 IFN-γ，IFNy則分布在細(xì)胞的周圍被捕獲抗體結(jié)合；洗去未結(jié)合的細(xì)胞，先后加入生物素標(biāo)記的IFN-Y檢測(cè)抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)連接的親和素、顯色液。若曾存在IFN-Y產(chǎn)生細(xì)胞，就會(huì)在相應(yīng)的位置出現(xiàn)著色的斑點(diǎn)，因此，IFN- y ELISP0T方法可以檢測(cè)IFN- γ產(chǎn)生細(xì)胞的頻率。我們采用ELISP0T方法檢測(cè)了荷載各組蛋白的DC刺激純化的⑶8+Τ細(xì)胞分泌IFN- γ的情況。結(jié)果顯示荷載gp96_Ki67抗原肽復(fù)合物的DC刺激⑶8+T細(xì)胞分泌IFN- γ的頻率明顯高于對(duì)照組。
權(quán)利要求
1.一種負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的制備方法，其特征在于將Ki67抗原肽與熱休克蛋白gp96形成復(fù)合物，然后負(fù)載于樹(shù)突狀細(xì)胞制備。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，其特征在于所述的Ki67抗原肽是HLA-A*0201限制性的Ki67抗原CTL表位< >肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，其特征在于Ki67抗原CTL表位肽，其長(zhǎng)度為9個(gè)氨基酸，其序列為L(zhǎng)eu-Gln-Gly-Glu-Thr-Gl n-Leu-Leu-Val。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗，其特征在于所述Ki67抗原CTL表位肽，是采用固相合成法合成制備的，其純度大于90%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗， 其特征在于所述的gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物是Ki67抗原CTL表位肽與重組人熱休克蛋白 gp96結(jié)合的復(fù)合物。
6.如權(quán)利要求1所述的gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗的用途，gp96-Ki67 抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗能用于治療Ki67陽(yáng)性腫瘤疾病。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種負(fù)載重組人gp96-Ki67抗原肽復(fù)合物的樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗。包括1.篩選、鑒定、合成Ki67抗原CTL表位肽；2.將合成的表位肽與重組人熱休克蛋白gp96形成復(fù)合物；3.制備樹(shù)突狀細(xì)胞，并將該復(fù)合物負(fù)載于樹(shù)突狀細(xì)胞，最終得到該疫苗。Ki67抗原肽在gp96的協(xié)助下能通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞被提呈給樹(shù)突狀細(xì)胞，并引起CTL活化，從而殺傷表達(dá)Ki67抗原的腫瘤細(xì)胞。由于Ki67抗原在腫瘤細(xì)胞廣泛表達(dá)，因此該疫苗具有適用范圍廣、制備簡(jiǎn)單高效等優(yōu)勢(shì)。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102552902SQ20111045944
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者劉俊杰, 張寶福, 張青, 李慧忠, 李連濤, 楊潔, 章龍珍, 裴冬生, 鄭駿年 申請(qǐng)人:鄭駿年