專利名稱：從蛇葡萄屬植物中同時分離二氫楊梅素和楊梅素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及葡萄科蛇葡萄屬植物化學成分提取分離技術領域，可用于蛇葡萄屬植物莖葉及其加工品藤茶中楊梅素和二氫楊梅素的同時分離。
背景技術：
葡萄科蛇葡萄屬的植物中均含有黃酮成分楊梅素和二氫楊梅素，其中以顯齒蛇葡萄Umpelopsis-grossedenteida)含量最高，顯齒蛇葡萄莖葉的加工品俗稱藤茶，藤茶有多種生理活性，主要有效成分為黃酮類化合物，并以二氫楊梅素含量為最高，主要活性成分黃酮含量可高達40%以上。此外，還含有楊梅素、兒茶素、沒食子酸、氨基酸、微量元素等多種成分；藤茶黃酮的主要成分二氫楊梅素和楊梅素，美國FDA已將楊梅素廣泛應用于醫(yī)藥、食品、保健品和化妝品；而二氫楊梅素具有清除自由基、抗氧化、抗血栓、抗腫瘤、消炎等多種功效，廣泛應用于治療呼吸道感染、酒精中毒的中成藥制劑并已在制備抗白血病及鼻咽癌藥物的應用領域取得了發(fā)明專利；是保肝護肝，解酒醒酒的良品，可作為醫(yī)藥原料藥。但是由于二氫楊梅素和楊梅素均屬多羥基黃酮醇類化合物，結構和理化性質相近，且楊梅素和二氫楊梅素在貴州藤茶中的含量差異較大，楊梅素含量在廣3%，二氫楊梅素含量可達 If 25%，所以藤茶中楊梅素和二氫楊梅素成分的高效分離一直是阻礙其應用于工業(yè)產(chǎn)業(yè)化的技術難題。據(jù)目前的文獻及專利報道，采用經(jīng)典的提取分離方法如乙醇回流法，煎煮法等多是單一的對含量較高的二氫楊梅素進行分離純化，如中國專利-一種從藤茶中提取二氫楊梅素的方法(專利號20051003^18. 5)提出了對藤茶干葉溶劑浸泡，濕藤茶葉微波輻射處理，水浴加熱提取，然后用冷水重結晶分離純化二氫楊梅素的方法。該法操作簡單，雜質少，成本低，但是不能同時分離楊梅素。目前涉及二氫楊梅素或楊梅素的高效的分離純化方法則配合了各種近代分離技術，主要是各種色譜技術。發(fā)表的文獻主要有中國民族醫(yī)藥雜志的“瑤族藤茶中楊梅素的分離和結構鑒定”；《現(xiàn)代化工》的“利用高速逆流色譜法同時純化藤茶中的二氫楊梅素和楊梅素”；《天然產(chǎn)物開發(fā)》的“增溫溶解，保溫過柱，溫水解吸” 提制二氫楊梅素(一)”；《哈爾濱醫(yī)科大學學報》的“藤茶中楊梅素和二氫楊梅素的分離及抗心肌細胞凋亡作用”。此類技術主要是采用水提或醇提法，加以微波或超聲輔助提取技術得到高含量的總黃酮，然后配合各種色譜技術如硅膠柱色譜，聚酰胺柱色譜，大孔樹脂吸附色譜，高速逆流色譜等，根據(jù)目的需要采用適當?shù)牧鲃酉嘞到y(tǒng)和適宜的操作條件分離得到楊梅素或二氫楊梅素。此類方法分離效率高，純度高，但是此法在生產(chǎn)上投資大，制備規(guī)模小，且操作要求高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。國內也有對采用溶劑提取法同時分離楊梅素和二氫楊梅素的報道?！吨袊F(xiàn)代應用藥學》的“廣西藤茶中黃酮類成分的提取工藝研究”提出， 利用楊梅素和二氫楊梅素在丙酮中的溶解性差異，可將提取得到的黃酮粗品用丙酮回流提取，提取液濃縮后用水重結晶得到二氫楊梅素，不溶性殘渣再用乙醇-水混合溶劑提取，濃縮，靜置數(shù)日后可得楊梅素結晶。此法雖簡便易操作，但提取得到的楊梅素含雜質較多，且獲得率低。參閱國內外文獻，迄今尚未見到一種能用簡單溶劑法高效同時分離楊梅素和二氫楊梅素，并可有望運用于工業(yè)化生產(chǎn)的分離方法。
發(fā)明內容
本發(fā)明是為了解決楊梅素和二氫楊梅素分離難，而難于運用于工業(yè)化的問題，特提出一種從蛇葡萄屬植物中同時分離二氫楊梅素和楊梅素的方法。本發(fā)明的目的是通過下述技術方案實現(xiàn)的。1、從蛇葡萄屬植物中同時分離二氫楊梅素和楊梅素的方法，包括(1)從蛇葡萄屬植物粗碎樣品中水提醇溶精制總黃酮的步驟， (2)用丙酮回流提取總黃酮初分離二氫楊梅素的步驟，(3)用乙醇-水提取不溶性殘渣分離楊梅素的步驟，(4)采用水重結晶純化二氫楊梅素和楊梅素的步驟。其特征在于在采用水重結晶純化二氫楊梅素時，通過加熱過濾操作將初分離得到的二氫楊梅素中的楊梅素和二氫楊梅素分離。2.根據(jù)權利要求1所述的同時分離楊梅素和二氫楊梅素的方法，其特征在于所述的乙醇-水提取不溶性殘渣分離楊梅素的步驟(3)，乙醇-水的比例為1:1。3.根據(jù)權利要求1所述的同時分離楊梅素和二氫楊梅素的方法，其特征在于所述的重結晶純化二氫楊梅素和楊梅素的步驟(4)，加熱過濾操作溫度應為85-95°C，并且直至過濾溶液加熱為黃綠色為止。4.如權利要求1所述的同時分離楊梅素和二氫楊梅素的方法，其特征在于所述的重結晶純化二氫楊梅素的步驟(4)，二氫楊梅素的重結晶次數(shù)應> 3次。本發(fā)明對比以往分離方法具有以下創(chuàng)新點
1.首次通過重結晶加熱過濾操作獲得楊梅素；
2.可由兩個途徑獲得楊梅素；
3.單純采用溶劑法同時分離出高純度楊梅素和二氫楊梅素。本發(fā)明對比以往分離方法具有以下優(yōu)點
1.操作簡單，污染少；
2.產(chǎn)品純度高，產(chǎn)量高；
2.設備簡單，費用低，適于工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
1
1.顯齒蛇葡萄(^^WoAsis-^roMet/efliai/a (Hand-Mazz) W. Τ· Wang)中總黃酮提取與
精制
稱取干燥粗粉碎顯齒蛇葡萄莖葉樣品100g，分兩次沸水提取，第一次加水IOOOmL,加熱煮沸5 10分鐘，傾出煎煮液，再加入50(Tl000mL水，加熱煮沸5 10分鐘，合并提取液， 趁熱抽濾，濾液在0°C、°C靜置析出白色沉淀，抽濾，濾沉淀用IOOmL無水乙醇溶解，靜置抽濾，濾液減壓濃縮至溶液呈濃稠狀時，傾出濃稠液，揮干乙醇，得黃色塊狀物(總黃酮)，在 50°C 65°C干燥，干燥后用研缽研細，稱重，然后倒入紙筒中用于分離。2. 二氫楊梅素分離
取上述提取得到的總黃酮，用200mL丙酮作為溶劑索氏回流提取，回流提取至紙筒中浸提液不再出現(xiàn)黃色為止。提取液直接上旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮呈濃稠狀時，傾出液體，放入通風櫥中，揮干丙酮，將塊狀物轉至燒杯中，加入一定量的蒸餾水，用玻璃棒攪拌后立即析出大量黃白色沉淀。3.楊梅素分離取上述濾紙筒中不溶性殘渣，用乙醇-水(1 1) IOOmL作為溶劑進行索氏回流提取廣3 小時，水浴溫度85 95°C。混合溶劑提取液顏色呈棕黃色。將提取液減壓濃縮至小體積時，溶液呈紅色。將溶液倒入錐形瓶中，放于0 4°C環(huán)境中靜置數(shù)日，析出黃褐色沉淀，用漏斗過濾，沉淀干燥保存。4.重結晶純化
將分離后得到的加入蒸餾水的大量黃白色沉淀用水浴加熱溶解，水浴溫度在85 950C。待溶液徹底呈黃綠色時，趁熱抽濾，濾液為黃色透明溶液，濾紙上有大量黃綠色物質， 將其收集干燥。抽濾后的濾液倒入錐形瓶中，貼上標簽，在0-4°C溫度下靜置。溶液析出白色沉淀，呈絮狀。將沉淀抽濾，棄去黃綠色濾液，沉淀繼續(xù)用蒸餾水重結晶，收集濾紙上黃綠色物質，繼續(xù)將濾液在0-4°C靜置結晶，照此操作在第三次和第四次重結晶時均得到白色針晶，將針晶在抽濾操作中不斷用冰水反復沖洗，然后干燥保存得二氫楊梅素，干燥溫度 60^65 0C ο上述操作中得到的黃褐色沉淀和黃綠色物質由薄層色譜鑒定為楊梅素，白色針晶薄層色譜鑒定為二氫楊梅素。經(jīng)高效液相色譜進行含量檢測，由此方法得到的楊梅素1(黃褐色沉淀)純度較低，楊梅素2 (黃綠色物質)純度為87. 37% ，二氫楊梅素(白色針晶)純度為 92. 87%。
具體實施方式
2
1.廣東蛇葡萄Uffl/^WoAsis canton i ens is Planch)中二氫楊梅素及楊梅素的提取與精制
稱取干燥粗粉碎廣東蛇葡萄莖葉樣品100g，分兩次沸水提取，第一次加水IOOOmL,加熱煮沸5 10分鐘，傾出煎煮液，再加入50(Tl000mL水，加熱煮沸5 10分鐘，合并提取液， 趁熱抽濾，濾液在0°C、°C靜置析出白色沉淀，抽濾，濾沉淀用IOOmL無水乙醇溶解，靜置抽濾，濾液減壓濃縮至溶液呈濃稠狀時，傾出濃稠液，揮干乙醇，得黃色塊狀物(總黃酮)，在 500C 65°C干燥，干燥后用研缽研細，稱重，然后倒入紙筒中用于分離。2. 二氫楊梅素分離
取上述提取得到的總黃酮，用200mL丙酮作為溶劑索氏回流提取，回流提取至紙筒中浸提液不再出現(xiàn)黃色為止。提取液直接上旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮呈濃稠狀時，傾出液體，放入通風櫥中，揮干丙酮，將塊狀物轉至燒杯中，加入一定量的蒸餾水，用玻璃棒攪拌后立即析出大量黃白色沉淀。3.楊梅素分離
取上述濾紙筒中不溶性殘渣，用乙醇-水(1 1) IOOmL作為溶劑進行索氏回流提取廣2 小時，水浴溫度85 95°C?；旌先軇┨崛∫侯伾首攸S色。將提取液減壓濃縮至小體積時，溶液呈紅色。將溶液倒入錐形瓶中，放于0 4°C環(huán)境中靜置數(shù)日，析出黃褐色沉淀，用漏斗過濾，沉淀干燥保存得楊梅素。4.重結晶純化
將分離后得到的加入蒸餾水的大量黃白色沉淀用水浴加熱溶解，水浴溫度在85 950C。待溶液徹底呈黃綠色時，趁熱抽濾，濾液為黃色透明溶液，濾紙上有大量黃綠色物質， 將其收集干燥。抽濾后的濾液倒入錐形瓶中，貼上標簽，在0-4°C溫度下靜置。溶液析出白色沉淀，呈絮狀。將沉淀抽濾，棄去黃綠色濾液，沉淀繼續(xù)用蒸餾水重結晶，收集濾紙上黃
5綠色物質，繼續(xù)將濾液在0_4°C靜置結晶，照此操作在第三次和第四次重結晶時均得到白色針晶，將針晶在抽濾操作中不斷用冰水反復沖洗，然后干燥保存得二氫楊梅素，干燥溫度 60^65 0C ο 上述操作中得到的黃褐色沉淀和黃綠色物質由薄層色譜鑒定為楊梅素，白色針晶薄層色譜鑒定為二氫楊梅素。經(jīng)高效液相色譜進行含量檢測，由此方法得到的楊梅素1(黃褐色沉淀)純度較低，楊梅素2 (黃綠色物質)純度為85. 3%，二氫楊梅素(白色針晶)純度為 90. 1%。
權利要求
1.一種從蛇葡萄屬植物莖葉中同時分離楊梅素和二氫楊梅素的方法，包括如下步驟(1)蛇葡萄屬植物莖葉的粗碎，水提醇溶精制總黃酮的步驟；(2)用丙酮回流提取總黃酮初分離二氫楊梅素的步驟；(3)用乙醇-水提取不溶性殘渣分離楊梅素的步驟；(4)采用水重結晶純化二氫楊梅素和楊梅素的步驟。
2.其特征在于在采用水重結晶純化二氫楊梅素時，通過加熱過濾操作將初分離得到的二氫楊梅素中的楊梅素和二氫楊梅素分離。
3.根據(jù)權利要求1所述的同時分離楊梅素和二氫楊梅素的方法，其特征在于所述的乙醇-水提取不溶性殘渣分離楊梅素的步驟(3)，乙醇-水的比例為1:1。
4.根據(jù)權利要求1所述的同時分離楊梅素和二氫楊梅素的方法，其特征在于所述的重結晶純化二氫楊梅素和楊梅素的步驟(4)，加熱過濾操作溫度應為85-95°C，并且直至過濾溶液加熱為黃綠色為止。
5.如權利要求1所述的同時分離楊梅素和二氫楊梅素的方法，其特征在于所述的重結晶純化二氫楊梅素的步驟(4)，二氫楊梅素的重結晶次數(shù)應> 3次。
6.本發(fā)明方法不僅適用于蛇葡萄屬植物中楊梅素和二氫楊梅素的分離，對于含有楊梅素和二氫楊梅素成分的其它屬植物均適用。
全文摘要
本發(fā)明樣品干燥粗碎(20-40目)，兩次沸水提取，合并提取液，趁熱抽濾，濾液在0-4℃靜置析出白色沉淀，抽濾或離心，濾沉淀用無水乙醇溶解，靜置抽濾，濾液減壓濃縮得濃稠液，揮干乙醇，控溫干燥，得總黃酮。用丙酮回流提取總黃酮，提取液濃縮得粗二氫楊梅素，用乙醇-水(1:1)回流提取不溶性殘渣，提取液濃縮得粗楊梅素1。用水重結晶純化二氫楊梅素(重結晶次數(shù)≥3)時，通過加熱(溫度為85-95℃)過濾，濾液為黃色透明溶液，濾紙上有大量黃綠色物質(楊梅素2)，將其收集干燥得楊梅素2。經(jīng)HPLC檢測，楊梅素2純度87.37%，二氫楊梅素(白色針晶)純度為89.87%。
文檔編號C07D311/40GK102584766SQ20111045834
公開日2012年7月18日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權日2011年12月31日
發(fā)明者伍貴祥, 樊靜靜, 范家佑, 郁建平, 郁浩翔 申請人:郁建平