專利名稱：用羥胺切割法制備天蠶素AD和蛙Buforin II融合抗菌肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。具體涉及復(fù)合抗菌肽天蠶素AD和蛙Buforin II的制備方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽可通過干擾、阻斷多條細(xì)菌代謝途徑，發(fā)揮胞內(nèi)殺傷作用，從而抑制、殺滅細(xì)菌。不同種類、結(jié)構(gòu)的抗菌肽可以攻擊不同的胞內(nèi)靶點(diǎn)發(fā)揮其抗菌作用，某些種類的抗菌肽亦可兼具胞膜攻擊作用和胞內(nèi)殺傷作用，且存在多個(gè)作用靶點(diǎn)。由于抗菌肽作用機(jī)制及靶點(diǎn)的多樣化，使細(xì)菌不易通過變異產(chǎn)生耐藥性。并且，某些抗菌肽與傳統(tǒng)抗菌藥物聯(lián)合使用時(shí)還具有協(xié)同作用。因此，抗菌肽有望成為新一代抗菌藥物或輔助治療藥物。天蠶素(Cecropins)是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物抗菌肽，1980年，由Boman等從天蠶蛹中分離得到。該類多肽抗生素一般含有37 39個(gè)氨基酸殘基，不含半胱氨酸，其N端區(qū)域具有強(qiáng)堿性，可形成近乎完美的雙親螺旋結(jié)構(gòu)，而在C端區(qū)域可形成疏水螺旋，兩者之間有甘氨酸和脯氨酸形成的鉸鏈區(qū)，N端在生理濃度下帶正電，C端均被酰胺化，酰胺化對(duì)其抗菌活性具有重要作用。所有天蠶素類抗菌肽其2位均為Try，這是該類抗菌肽最保守結(jié)構(gòu)， 天蠶素B、D分別與A有65%和62%同源性，表明天蠶素在分子結(jié)構(gòu)上具有同源性，上述結(jié)構(gòu)是抗菌肽破壞菌膜的基礎(chǔ)。天蠶素類抗菌肽的作用機(jī)制與其電荷數(shù)和中間的柔性部位有直接關(guān)系是天蠶素類抗菌肽的作用機(jī)制假說?？咕腃ecropin AD是人工合成的由Cecropin A的N端1 11肽段和Cecropin D的C端12 37肽段組成的雜合肽。Chen等在枯草芽孢桿菌中成功地表達(dá)了高抗菌活性的抗菌肽Cecropin AD，且表達(dá)產(chǎn)物具有良好的生物學(xué)穩(wěn)定性?？咕腂uforin II是韓國學(xué)者Park等從亞洲蟾蜍的胃組織中分離純化的有21 個(gè)殘基的抗菌肽，其抗菌活性很強(qiáng)，抗菌譜廣，在不破壞細(xì)胞膜的前提下，高效穿過細(xì)胞膜后進(jìn)入胞質(zhì)強(qiáng)烈結(jié)合DNA，從而抑制微生物的生長(zhǎng)。Buforin II雖然理化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)和其他α螺旋多肽類似，但其作用機(jī)制已被提出和多數(shù)作用于膜的多肽有所不同，Buforin II和Pyrrhocoricin、indolicidin，以及富含 Pro, Arg的抗菌肽PR-39作用機(jī)制相似，但也有區(qū)別。Buforin II在不引起細(xì)胞膜溶解的情況下，能快速穿透質(zhì)膜，并于胞內(nèi)累積，通過與核酸分子結(jié)合，殺滅細(xì)菌。Buforin II的C 端區(qū)域是組蛋白H2ADNA結(jié)合基序的一部分，在于DNA的相互作用中有重要作用，是Buforin II的殺菌基礎(chǔ)。進(jìn)一步研究Buforin II及其氨基酸突變體與DNA分子的相互作用時(shí)發(fā)現(xiàn)， Buforin II類抗菌肽與DNA分子的親合能力與其抗菌能力呈正相關(guān)。同時(shí)，Buforin II與 DNA分子結(jié)合不僅存在靜電相互作用，而且存在著特異性結(jié)合位點(diǎn)。由于從動(dòng)物或微生物中提取抗菌肽的產(chǎn)量少，成本高，所以用現(xiàn)代生物技術(shù)表達(dá)抗菌肽成為目前研究的熱點(diǎn)。目前抗菌肽基因工程表達(dá)主要在大腸桿菌和酵母菌系統(tǒng)中進(jìn)行。酵母菌表達(dá)體系具有直接分泌表達(dá)抗菌肽的潛力，但酵母菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，含較多堿性氨基酸的抗菌肽易被降解，表達(dá)效率并不高；該表達(dá)系統(tǒng)還存在N端信號(hào)肽剪切不完全，直接影響到抗菌肽的活性；同時(shí)還存在對(duì)表達(dá)的抗菌肽進(jìn)行修飾的潛在問題，如糖基化、甲基化等。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生長(zhǎng)快、表達(dá)量高、對(duì)表達(dá)抗菌肽不存在修飾等優(yōu)點(diǎn)，但抗菌肽在大腸桿菌中直接表達(dá)、對(duì)大腸桿菌本身具有毒性，一般采用融合表達(dá)策略。然而現(xiàn)在通用的大腸桿菌融合表達(dá)方式是采用大腸桿菌自身蛋白作為融合蛋白對(duì)抗菌肽進(jìn)行表達(dá)。如采用兩種不同抑菌機(jī)制的抗菌肽融合表達(dá)，產(chǎn)物在未形成正確結(jié)構(gòu)時(shí)不會(huì)對(duì)宿主菌產(chǎn)生毒性，并且能夠提高表達(dá)效率，兩種抗菌肽切割成獨(dú)立后便具有抑菌效果，兩種協(xié)同作用能夠增強(qiáng)抑菌效果。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)含兩種不同抑菌機(jī)制的抗菌肽融合蛋白，并在融合蛋白的N端與his標(biāo)簽之間以及在兩種抗菌肽之間引入了羥胺切割位點(diǎn)Asn-Gly，羥胺是一種廉價(jià)的化學(xué)試劑可以專一性的切割蛋白和多肽中的Asn-Gly肽鍵。從而使生產(chǎn)成本降低，純化工藝簡(jiǎn)化。本發(fā)明提供了高效表達(dá)含兩種不同抑菌機(jī)制的抗菌肽融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒 pET-Trx-CAD-Buforin II，其包N端有3個(gè)His形成立體His-patch，序列中有2個(gè)羥胺切割位點(diǎn)，有利于表達(dá)純化。本發(fā)明提供的宿主細(xì)胞是E. coli BL21(DE3)plysS，具有氯霉素抗性。本發(fā)明提供表達(dá)pET-Trx-CAD-Buforin II的工程菌株！"rx-PCe/BI^l，是由表達(dá)質(zhì)粒pET-Trx-CAD-Buforin II轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)plysS細(xì)胞獲得的最高表達(dá)量的菌株。該菌株為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)Trx_PC6/BL21，已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏；保藏號(hào)為CGMCC No. 4588，保藏時(shí)間為2011年1月觀日， 保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所。本發(fā)明提供了使用羥胺切割法制備CAD和Buforin II的方法，并在此基礎(chǔ)上提供了完整的表達(dá)、分離純化CAD-Buforin II融合蛋白的方法。
圖ICAD-Buforin II人工合成電泳圖M DL2000 DNA Marker(2000,1000,750,500,250,100)bp1人工合成的CAD-Buforin II基因2人工合成的CAD-Buforin II基因圖2 重組質(zhì)粒pET-I^rx-CAD-Buforin II酶切電泳圖M DL2000 DNA Marker (2000，1000，750，500，250，100)bp1 重組質(zhì)粒 pET-Trx-CAD-Buforin II 酶切(BamH I 和 EcoR I)2 質(zhì)粒 pET-Trx 酶切(BamH I 和 EcoR I)圖 3SDS-PAGE 電泳分析 CAD-Buforin II 表達(dá)M 高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(116,66. 2，45，35，25，18，14. 4) KD1 表達(dá)質(zhì)粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E. coli BL21 (DE3)plysS 細(xì)胞中的表達(dá) (誘導(dǎo)前)
2 表達(dá)質(zhì)粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E.coli BL21 (DE3)plysS 細(xì)胞中的表達(dá) (誘導(dǎo)后)有表達(dá)3 表達(dá)質(zhì)粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E.coli BL21 (DE3) plysS 細(xì)胞中的表達(dá) (誘導(dǎo)后)有表達(dá)4 表達(dá)質(zhì)粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E.coli BL21 (DE3) plysS 細(xì)胞中的表達(dá) (誘導(dǎo)后)有表達(dá)5 表達(dá)質(zhì)粒 PET-iTrx-CAD-Buforin II 在 E.coli BL21 (DE3) plysS 細(xì)胞中的表達(dá) (誘導(dǎo)后)無表達(dá)圖4SDS-PAGE電泳檢測(cè)羥胺切割后分離得到的CAD和Buforin IIM 高分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)(116,66. 2，45，35，25，18，14. 4) KD1羥胺切割后分離得到的CAD和Buforin II圖5羥胺切割后分離得到的CAD和Buforin II對(duì)大腸桿菌的抑菌活性1對(duì)照(蛋白純化緩沖液)2 天蠶素 AD (16mm)3 娃 Buforin II (16mm)4天蠶素AD和蛙Buforin II復(fù)合溶液QOmm)5天蠶素AD和蛙Buforin II復(fù)合溶液(19mm)實(shí)施例1 合成天蠶素AD和蛙Buforin II融合基因CAD-BuforinII1人工合成天蠶素AD和蛙Buforin II融合基因，設(shè)計(jì)4對(duì)引物FlGGATCC AACGGT AAATGGAAACTGTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGCGTGTTCGTRlAGCAGAGATAACAGCGTCACGAACACGCTGACCAACTTTTTCGAF2GACGCTGTTATCTCTGCTGGTCCGGGTGTTGCTACCTTCGR2TTAGCCAGAGCGGTAGCCTGAGCGAAGGTAGCAACACCCGGACCF3CTCAGGCTACCGCTCTGGCTAAA AACGGT ACCCGTTCTTCTCGTGCTR3ACCAACCGGGAACTGCAGACCAGCACGAGAAGAACGGGT ACCGTT TF4GGTCTGCAGTTCCCGGTTGGTCGTGTTCACCGTCTGCTGCGTAAAGAATTCR4GAATTCTTTACGCAGCAGACGGTGAACACG通過3輪PCR合成天蠶素AD和蛙Buforin II的融合基因一 CAD-Buforin II基因，該融合基因的5’端和3’端分別添加了 BamH I和EcoR I限制性酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)，5’端BamHI酶切位點(diǎn)后添加有羥胺切割位點(diǎn)(加粗部分)，并且在天蠶素AD和蛙 Buforin II兩段基因間隔處也添加羥胺切割位點(diǎn)，該位點(diǎn)在第三對(duì)引物對(duì)中(加粗部分)；以上述引物作為自身引物和模板，經(jīng)雙重不對(duì)稱PCR(Dual asymmetric PCR，DA PCR)、重疊延伸PCR(0verlap extension PCR,OE PCR)得到包含完整基因長(zhǎng)度及部分基因序列的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)過稀釋后作為模版，以左右兩端的引物序列進(jìn)行全長(zhǎng)基因的擴(kuò)增，利用Pfu高保真 DNA聚合酶確保人工合成的CAD-Buforin II融合蛋白基因序列的完整與正確。DA PCR反應(yīng)體系每管50μ1反應(yīng)體系，2組相鄰的4個(gè)引物一管，其中上游弓I 物 2μ l(10ymol/L),下游引物 1μ 1 (10 μ mol/L)，5 μ 1 dNTP Mixture (2. 5mmol/L), 5 μ IlOXTaq DNABuffer，0. 5 μ 1 Taq酶，加滅菌的去離子水補(bǔ)足到50 μ 1，充分混勻并離心。DA PCR反應(yīng)條件94°C變性20s，43°C退火15s，72°C延伸30s，20個(gè)循環(huán)。OE PCR反應(yīng)體系取上述DA PCR產(chǎn)物各5 μ 1，加入等體積酚氯仿異戊醇 (體積比25 24 1)抽提，3倍體積無水乙醇沉淀，溶于等出發(fā)體積的去離子水，加入 5 μ IlOXTaq DNABuffer,5y 1 dNTP Mixture (2. 5mmol/L), 0. 5 μ 1 Taq酶，加滅菌的去離子水補(bǔ)足到100 μ 1，充分混勻并離心。OE PCR反應(yīng)條件94°C變性30s，68°C退火延伸2min，15個(gè)循環(huán)。第三輪PCR反應(yīng)體系上游引物1μ αθμπιοΙ/L)，下游引物1μ αθμπιοΙ/L)， 5μ 1 dNTPMixture (2. 5mmol/L), 5 μ 1 IOx Taq Buffer, 0. 5 μ 1 Taq 酶，加滅菌的去離子水補(bǔ)足到50 μ 1 ；PCR反應(yīng)條件94°C變性20s，43°C退火15s，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖1)。并經(jīng)上海生工測(cè)序確認(rèn)。序列如下(序列1)CAD-Buforin II 序列AACGGTGGATCCAAATGGAAACTGTTCAAAAAAATCGAAAAAGTTGGTCAGCGTGTTC GTGACGCTGT TATCTCTGCTGGTCCGGGTGTTGCTACCTTCGCTCAGGCTACCGCTCTGGCTAAAAACGGTACCCGTTCTTCTCGTG CTGGTCTGCAGTTCCCGGTTGGTCGTGTTCACCGTCTGCTGCGTAAAGAATTC實(shí)施例2 CAD-Buforin II基因克隆表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建2.1 CAD-Buforin II基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建提取質(zhì)粒pET-Trx，用BamH I和EcoR I雙酶切，回收3. 3kb的線性質(zhì)粒；將所述步驟1中人工合成的CAD-Buforin II基因片段用BamH I和EcoR I雙酶切，加入等體積酚氯仿異戊醇(體積比25 24 1)抽提，3倍體積無水乙醇沉淀回收酶切片段；將上述回收酶切產(chǎn)物片段，用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接反應(yīng)體系為25 μ 1
IOx Τ4 DNA Ligase Buffer2.5 μ
CAD-Buforin II5 μ
pET-Trx2.5 μ
T4 DNA Ligase1 μ
ddH2014 μ
Total25 μ 于16°C連接過夜，連接產(chǎn)物為pET-Trx-CAD-Buforin II重組質(zhì)粒。
2. 2 重組質(zhì)粒pET-Trx-CAD-Buforin II轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10驗(yàn)證重組結(jié)果取pET-Trx-CAD-BuforinII 重組質(zhì)粒 1 μ 1，稀釋 10倍后直接轉(zhuǎn)化Ε. coli Top 10 感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Amp平板，37°C倒置過夜培養(yǎng)。從上述LB平板上挑取全部單克隆菌落， 接種到5ml LB+Amp液體培養(yǎng)基，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，次日提取質(zhì)粒，BamH I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒，電泳檢測(cè)，得到3. 3kb的質(zhì)粒片段和180bp左右的CAD-Buforin融合基因片段，表明重組質(zhì)粒pET-Trx-CAD-Buforin II構(gòu)建成功(圖2)。實(shí)施例3表達(dá)CAD-Buforin II工程菌株的構(gòu)建和篩選3.1 重組質(zhì)粒 pET-Trx-CAD-Buforin II 轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株 BL21取上述2. 1中構(gòu)建的pET-Trx-CAD-Buforin II質(zhì)粒1 μ 1，稀釋10倍后直接轉(zhuǎn)化 Ε. coli表達(dá)菌株BL21 (DE3)plysS感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB+Amp平板，37°C倒置過夜培養(yǎng)。3. 2篩選表達(dá)CAD-Buforin II的工程菌株從上述LB平板上挑取4個(gè)單克隆菌落，2ml LB+Amp液體培養(yǎng)基37°C振蕩過夜培養(yǎng)，次日，取20μ 1過夜培養(yǎng)液加入到aiil YTA+Amp液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37°C振蕩培養(yǎng) 3h，至0D600在0. 5 0. 7之間，然后加入IPTG至終濃度為0. 3mM，30°C振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)表達(dá) 3_8h。誘導(dǎo)前，隨機(jī)從一個(gè)樣品中取出0. 5ml菌液，電泳檢測(cè)時(shí)作為誘導(dǎo)對(duì)照。誘導(dǎo)表達(dá)完后，各取0. 5ml菌液(視表達(dá)細(xì)菌的量多少而變化，一般在0. 2 0. 5mL之間)，5000rpm 5min離心收集細(xì)胞，包括未誘導(dǎo)的樣品，重懸于100 μ 1去離子水中，以此為電泳樣品作10%的Tricine-SDS-PGAE。根據(jù)電泳結(jié)果(圖3)，得到有表達(dá)的菌株。將LB+Amp培養(yǎng)基中的菌液加入30%甘油后_70°C保存菌種。3.3 融合抗菌肽CAD-Buforin II的大規(guī)模表達(dá)挑取表達(dá)菌株單克隆在LB+Amp液體培養(yǎng)基中37°C過夜振蕩培養(yǎng)，次日，按照體積比1 100加入到100ml YTA+Amp培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)培養(yǎng)，37°C振蕩培養(yǎng)3h后，再加入IPTG至終濃度為ImM，再30°C振蕩誘導(dǎo)培養(yǎng)3-8h。誘導(dǎo)前取出0. 5ml的菌液，作為誘導(dǎo)前對(duì)照樣品。以下操作在冰浴或4°C中進(jìn)行。誘導(dǎo)培養(yǎng)完后，取出0.5ml的菌液作為誘導(dǎo)后對(duì)照，剩下的菌液在合適的離心管中5000rpm離心IOmin收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸于5ml預(yù)冷的 1XPBS，加入50μ1 20%的Triton X-100，充分混勻后冰浴30min。超聲波破碎細(xì)胞，超聲循環(huán)為超聲Is ；間隔Is ；全程40s。重復(fù)4次，每次間隙時(shí)將菌液在冰浴中混勻，避免局部溫度太高，使蛋白質(zhì)變性。最后，將破碎后的菌液IOOOOrpm離心15min，收集上清液和沉淀， 上清液和沉淀分別留樣、備用。3.4 融合抗菌肽CAD-Buforin II的純化和裂解將NTA樹脂在原包裝中充分混勻，裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的 NTA-OBuffer (20mM Tris-HCl ρΗ7·9，0·5Μ NaCl，10 % Glycerol)洗。將樣品加到 NTA 層析柱中，流速控制在0. 3ml/min左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。層析用5倍NTA體積的NTA-O Buffer洗，流速控制在0. 5，用的NTA-10 Buffer (20mM Tris-HCl ρΗ7·9，0·5Μ NaCl, 10% Glycerol, 20mM Imidazole)洗 5 倍 NTA 體積，流速控制在 0. 5ml/min 左右，去除未結(jié)合雜蛋白。最后用 NTA-500 Bufffer (20mM Tris-HCl pH7. 9， 0.5M NaCl,10% Glycerol, 500mM Imidazole)洗脫，直到檢測(cè)不到蛋白為止，流速控制在 0. 3ml/min 左右。CAD-Buforin II的裂解取上述經(jīng)過NTA樹脂純化的融合蛋白溶液，加入鹽酸羥胺至1-4M，調(diào)pH值至7-9. 5，在35_50°C下切割1_12個(gè)小時(shí)，釋放出完整的CAD和Buforin II多肽。透析后再次利用NTA樹脂回收帶有His標(biāo)簽的Trx蛋白，流通液中所含蛋白則是天蠶素AD和蛙Buforin II抗菌肽，Tricine-SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白(圖4)。分別將天蠶素AD、蛙Buforin II以及的天蠶素AD和蛙Buforin II復(fù)合溶液， 各30yL(含量約10yg)，以E.coli DH5 α為實(shí)驗(yàn)菌株，采用標(biāo)準(zhǔn)瓊脂孔穴擴(kuò)散法，測(cè)定其抑菌活性。結(jié)果顯示，天蠶素AD和蛙Buforin II復(fù)合溶液抑菌圈有所增大，直徑可達(dá)到 20mm，均大于天蠶素AD、蛙Buforin II溶液相應(yīng)的抑菌直徑(圖5)。表明，天蠶素AD和蛙 Buforin II復(fù)合溶液對(duì)E.coli DH5 α有良好的殺菌活性，并且活性較單一抗菌肽增強(qiáng)。通過上述方法，我們可以得到具有雙重抑菌機(jī)制的天蠶素AD和蛙Buforin II復(fù)合抗菌肽，增強(qiáng)了抑菌效率。本發(fā)明提供了不同抑菌機(jī)制的兩種抗菌肽融合基因的合成以及相應(yīng)的表達(dá)方式和化學(xué)切割制備的方法。它具有以下優(yōu)點(diǎn)1、將兩種不同抑菌機(jī)制的抗菌肽構(gòu)建入同一表達(dá)載體，表達(dá)純化后兩種抗菌肽以1 1的比例存在，依其各自不同的抑菌作用機(jī)制，提高抑菌效率；2、使用廉價(jià)的化學(xué)試劑鹽酸羥胺作為融合蛋白的切割劑，同時(shí)避免了使用異源蛋白切割造成的污染；3、由上述兩個(gè)特點(diǎn)決定了本工藝純化方便且成本低廉，產(chǎn)品活性高穩(wěn)定性好。所以，本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新和工藝先進(jìn)性，適用于工業(yè)化生產(chǎn)?？蓱?yīng)用于抗菌藥物以及飼料添加劑等生產(chǎn)。
權(quán)利要求
1.一種含天蠶素AD和蛙Buforin II的融合蛋白，其特征在于天蠶素AD和蛙Buforin II的之間引入羥胺切割位點(diǎn)，并直接相連。
2.如權(quán)利要求1所述含天蠶素AD和蛙BuforinII的融合蛋白，其特征在于在天蠶素 AD和蛙Buforin II之間以及天蠶素AD和蛙Buforin II的融合蛋白N端序列之前各引入一個(gè)羥胺位點(diǎn)Asn-Gly，從而使大腸桿菌表達(dá)融合蛋白可以使用羥胺來切割釋放天蠶素AD 和蛙 Buforin II。
3.如權(quán)利要求1所述含天蠶素AD和蛙BuforinII的融合蛋白的制備方法，其特征在于設(shè)計(jì)人工合成四對(duì)引物，通過3輪PCR，合成天蠶素AD和蛙Buforin II的融合基因-CAD-Buforin II 基因。
4.如權(quán)利要求3所述含天蠶素AD和蛙BuforinII的融合蛋白的制備方法，其特征在于所說的四對(duì)引物的序列如序列2-8所示。
5.如權(quán)利要求1所述含天蠶素AD和蛙BuforinII的融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于由質(zhì)粒PET-Trx與人工合成的CAD-Buforin II基因片段，用BamH I和EcoR I雙酶切， 連接而成的質(zhì)粒pET-Trx-CAD-Buforin II，其N端有3個(gè)His形成立體His-patch，序列中有2個(gè)羥胺切割位點(diǎn)，有利于表達(dá)純化。
6.如權(quán)利要求1所述含天蠶素AD和蛙BuforinII的融合蛋白的表達(dá)工程菌株，其特征是由表達(dá)質(zhì)粒pET-Trx-CAD-Buforin II轉(zhuǎn)化Ε. coli BL21細(xì)胞獲得的最高表達(dá)量的菌株，該菌株為已在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏；名稱為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)Trx_PC6/BL21，保藏號(hào)為 CGMCC No. 4588。
7.應(yīng)用權(quán)利要求1所述含天蠶素AD和蛙BuforinII的融合蛋白，制備天蠶素AD和蛙Buforin II復(fù)合抗菌肽的方法，其特征在于包括融合抗菌肽CAD-Buforin II的大規(guī)模表達(dá)、提取、分離純化、羥胺切割裂解各步驟，制得含有天蠶素AD和蛙Buforin II的復(fù)合抗菌肽。
8.如權(quán)利要求7所說的準(zhǔn)備復(fù)合抗菌肽的方法，其特征在于所說的羥胺切割條件為 加入鹽酸羥胺濃度至1-4M，調(diào)pH值至7. 0-9. 5，在35-50°C下，切割1_12個(gè)小時(shí)。
9.如權(quán)利要求7所準(zhǔn)備的天蠶素AD和蛙BuforinII復(fù)合抗菌肽的用途，其特征在于用于藥物和飼料添加劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種將兩個(gè)不同殺菌機(jī)制的抗菌肽(CAD和Buforin II)融合表達(dá)以及使用羥胺切割形成兩種抗菌肽復(fù)合制劑的工藝方法。利用羥胺可以專一性地切割蛋白中Asn-Gly肽鍵，我們?cè)谌诤系鞍缀透郊有蛄?His標(biāo)簽)的連接部引入Asn-Gly位點(diǎn)，并用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)高效表達(dá)上述融合蛋白，經(jīng)親和層析純化后，獲得重組的CAD-Buforin II，再使用羥胺進(jìn)行切割，繼續(xù)經(jīng)分離純化后獲得純化的CAD和Buforin II復(fù)合抗菌肽。本發(fā)明的融合蛋白可以作為動(dòng)物飼料添加劑部分替代現(xiàn)有的抗生素添加劑。
文檔編號(hào)C07K14/46GK102532325SQ20111036458
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者周紅姿, 扈進(jìn)冬, 李紅梅, 李紀(jì)順, 楊合同, 鄭凱, 魏艷麗 申請(qǐng)人:山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心