豬細(xì)小病毒抗原的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法

專利名稱：豬細(xì)小病毒抗原的制備方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)抗原的制備方法，尤其涉及一種利用重組桿狀病毒在昆蟲體內(nèi)表達(dá)豬細(xì)小病毒空衣殼抗原的方法，本發(fā)明還涉及由該方法制備得到的抗原產(chǎn)品以及用該抗原制備預(yù)防或治療豬細(xì)小病毒的口服或注射用疫苗的用途，屬于豬細(xì)小病毒抗原的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
豬細(xì)小病毒(Porcineparvovirus, PPV)由 Mary 和 Mahnel 于 1966 年進(jìn)行豬瘟病毒組織培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，由Cartwright首次分離得到，隨后在歐、美、亞、非及大洋洲很多國(guó)家均有報(bào)道，呈世界性分布。PPV是引起母豬繁殖障礙的重要病原之一，也可以引起胎兒木乃伊、新生仔豬死亡以及仔豬的皮炎和腹瀉等，是危害全球養(yǎng)豬業(yè)重要病原之一。近年來， PPV的感染呈擴(kuò)大上升趨勢(shì)，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失(劉秀芬，中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46(5) :9-11 ；謝巧等，畜牧與獸醫(yī)，2010，42(2) :92_95)。豬細(xì)小病毒屬于細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，其病毒粒子呈圓形或六角形，直徑約20nm，二十面體立體對(duì)稱，衣殼由32個(gè)殼粒組成，無囊膜，是一種自主復(fù)制型病毒(甄洪花等，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，20 (8) :85-88)。豬細(xì)小病毒能夠凝集人、猴、豚、鼠、豬、雞、大鼠、 小鼠的紅細(xì)胞，但血凝試驗(yàn)時(shí)常用豚鼠的紅細(xì)胞(孫紹元等，中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22 214-215)。PPV基因組為單股負(fù)鏈DNA，大小約為5000bp，基因組有兩個(gè)主要的開放閱讀框， 共編碼VP1、VP2、VP3三種結(jié)構(gòu)蛋白和NS1、NS2、NS3三種非結(jié)構(gòu)蛋白。VP2的C端暴露在該蛋白的表面，因此C端的完整性是保持該衣殼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)所必須的，而其N端位于二級(jí)結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，可以利用VP2自我包裝成空殼粒子的特性。結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3都有免疫原性，其中VP2的免疫原性最好，VPl最差(甄洪花等，動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，20 (8) :85_88)。目前用于豬細(xì)小病毒病的疫苗主要有弱毒活疫苗和滅活疫苗兩種，但是這兩種疫苗均有其缺陷或不足，譬如，弱毒疫苗存在發(fā)生重組及毒力反強(qiáng)的潛在威脅，滅活疫苗免疫存在效果不穩(wěn)定等缺陷(周斌等，畜牧與獸醫(yī)，2007，39 (2) 54-56)。任雪楓等將VP2蛋白主要抗原表位基因VP2 I基因插入真核表達(dá)載體pIREShyg轉(zhuǎn)CHO細(xì)胞經(jīng)潮霉素篩選，所有得到的陽性克隆經(jīng)間接免疫熒光鑒定均表達(dá)目的基因，建立了穩(wěn)定表達(dá)VP2蛋白的細(xì)胞株， 可在一定程度上取代全病毒作為抗原應(yīng)用，給PPV的研究帶來較多方便，為探索新的血清學(xué)診斷方法奠定了基礎(chǔ)(任雪楓等，中國(guó)病毒學(xué)，2004，19 (6) :636-638)。豬細(xì)小病毒VP2 蛋白主要抗原域在畢氏酵母中表達(dá)并且具有免疫活性，但是表達(dá)量很低(李斐等，農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2006，14 (6) :988-989)。將豬細(xì)小病毒VP2基因插入干酪乳桿菌細(xì)胞表面表達(dá)載體PPG611. 1中構(gòu)建了重組表達(dá)載體，重組蛋白Lc393-rPPV-VP2在干酪乳酸菌表面獲得表達(dá)，經(jīng)口服免疫Balb/c小鼠后能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)PPV的局部黏膜免疫應(yīng)答和全身免疫應(yīng)答，為進(jìn)行口服疫苗有效預(yù)防PPV的研究奠定了基礎(chǔ)(Xu Y G etal, Appl Environ Microbiol, 2007, 73 (21) 7041-7047)。之后，又構(gòu)建了另一種表達(dá)載體分泌型重組表達(dá)載體PPG612. 1，將這兩種不同的重組菌以口服方式免疫小鼠比較發(fā)現(xiàn)，兩種重組菌免疫的小鼠均能產(chǎn)生針對(duì)VP2的特異性免疫應(yīng)答，口服免疫46d后IgA和IgG達(dá)到最高水平(Xu Y Getal, Immunology, 2008,124(1) :68_75)。隨著生物技術(shù)、基因工程等高新技術(shù)的發(fā)展，人們意識(shí)到通過基因工程的手段，利用生物反應(yīng)器來高效表達(dá)豬細(xì)小病毒基因，可望達(dá)到大幅度提高豬細(xì)小病毒抗原產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的。動(dòng)物疾病的免疫疫苗和治療藥物的研究和開發(fā)隨著家蠶生物反應(yīng)器的成熟也越來越受到重視。如口蹄疫病毒的空衣殼表達(dá)、狂犬病的N、P、N-P的聯(lián)合表達(dá)均已獲得了中國(guó)農(nóng)業(yè)部遺傳工程安 全生產(chǎn)委員會(huì)頒發(fā)的商品化生產(chǎn)許可證。1997年，田鄂等在家蠶細(xì)胞和幼蟲中成功表達(dá)了日本血吸蟲中國(guó)大陸株28KD谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶基因，在家蠶培養(yǎng)細(xì)胞(IO6個(gè)/mL)中的表達(dá)產(chǎn)量為0.77mg，在家蠶幼蟲中則超過5mg/條蠶(田鄂等，生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào)，1997，29(1) :33-38)。日本國(guó)家動(dòng)物衛(wèi)生研究所的研究人員利用家蠶表達(dá)體系對(duì)豬的細(xì)胞因子，包括IL系列、GM-CSF, TNF及其受體、Caspase等進(jìn)行了系統(tǒng)深入的基礎(chǔ)和開發(fā)研究，用BmNPV體系生產(chǎn)的寵物(貓和狗)的預(yù)防重組IL制劑 (Intercat)最近已由日本“T0RAY”株式會(huì)社生產(chǎn)并投入市場(chǎng)(木村滋，昆蟲生物工廠[M]， 日本工業(yè)調(diào)查會(huì)，2000，124-127)?，F(xiàn)有的采用基因工程的手段制備豬細(xì)小病毒抗原的方法不同程度的存在著表達(dá)效率較低、生產(chǎn)成本高、所表達(dá)的抗原免疫活性低等缺陷，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的豬細(xì)小病毒空衣殼抗原的制備方法，該制備方法利用重組桿狀病毒在昆蟲體內(nèi)表達(dá)豬細(xì)小病毒空衣殼抗原，具有表達(dá)效率高、所表達(dá)的蛋白免疫活性高、生產(chǎn)成本低、可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種豬細(xì)小病毒空衣殼抗原的制備方法，包括將豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白VP2基因或優(yōu)化后的VP2基因克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體中，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)移表達(dá)載體；將所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體與桿狀病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，獲得重組桿狀病毒；用重組桿狀病毒感染昆蟲宿主或細(xì)胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主或昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白；收獲并純化所表達(dá)的重組豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白，即得。其中，所述的豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白基因VP2的堿基為SEQ ID NO :1所示，所述優(yōu)化后的豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白VP2基因的堿基為SEQ ID N0:2所示。所述的桿狀病毒運(yùn)載載體優(yōu)選自AcRP23-lacZ，AcRP6_SC，AcUffl-IacZ, BacPAK6, Bac to Pac, Bacmid, BlucBacII (pETL)，p2Bac, p2Blue, p89B310, pAc360、pAc373，pAcAB3、 pAcAB 4，PAcAS3, pAcC129, pAcC4, DZI，pAcGP67, pAcIEl, pAcJPl, pAcMLF2, pAcMLF 7， pAcMLF 8， pAcMPl, pAcMP2, pAcRP23, pAcRP 25， pAcRW4, pAcsMAG, pAcUffl, pAcUW21, pAcUW2A, pAcUW2B, pAcUW3, pAcUW31, pAcUW41, pAcUW42, pAcUW43, pAcUW51, pAcVC2, pAcVC 3， pAcYMl, pAcJcC5, pBacl、 pBac2, pBlueBacIII, pBlueBacHis, pEV55, mXIV, pIEINeo, ρJVETL, ρJVNhe 1, ρJVP10, pJVrsMAG, pMBac, pPIO, pPAKl, pPBac, ρSHONEX 1. 1，pSYN XIV VI+, pSYNVI+wp, pSYNXIV VI-, pVL1391, ρVL 1392，ρVL 1393，pVL941, ρVL 945，pVL985, pVTBac,pBM030,pUAC-5或其它類似的桿狀病毒同源重組或轉(zhuǎn)座載體中的任一種，更優(yōu)選為 PVL1393。
所述的桿狀病毒優(yōu)選自BmNPV、AcMNPV, ApNPV, HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV, SIMNPV, SeMNPV或SpltNPV，更優(yōu)選為家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV_ZJ8。所述的 重組桿狀病毒選自以下任意一種重組病毒(1)重組家蠶核型多角體病毒 rBmNPV (PPV-VP2), (2)重組家蠶核型多角體病毒 rBmNPV (PPV-VP2-M)。所述的昆蟲宿主選自家蠶(Bombyx mori)、野蠶(Bombyx mandarina)、蓖麻蠶 (Philosamia cynthia ricim)(Dictyoplocajapanica)(Philosamia cynthia pryeri)、昨香(Antheraea pernyi)、曰本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea polyphymus)、苜猜尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、斜紋夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜娥(Trichoplusia ni)、tf軍蟲(Thaumetopoea wilkinsoni)、豐帛鈴蟲 (Heliothis armigera)、美國(guó)棉鈴蟲(Heliothis zea)、煙青蟲(Heliothis assulta)、煙草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等；更優(yōu)選為家蠶(Bombyx mori)。所述的感染是指重組桿狀病毒通過口食或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體(更優(yōu)選為將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞或?qū)⒅亟M家蠶桿狀病毒穿刺接種1-5 齡的家蠶幼蟲或蛹，在感染3-6天后收集含豬細(xì)小病毒抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿)；其中，所述的蛹體最優(yōu)為1-2天的早期嫩蛹。本發(fā)明在不改變豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白VP2的氨基酸序列前提下，根據(jù)家蠶密碼子偏好性對(duì)豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白基因原始序列VP2(SEQ ID NO :1)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的序列(VP2-M)如SEQ ID NO :2所示。VP2原始序列中含有串聯(lián)的稀有密碼子，這減少了翻譯序列或者甚至解除翻譯裝置，優(yōu)化后的序列中CAI值由0. 86提高為0. 89，調(diào)整了 GC含量及不宜峰以延長(zhǎng)mRNA的半衰期，GC含量由38. 32%調(diào)整為48. 70%，原有的影響mRNA穩(wěn)定性及其與核糖體結(jié)合的莖環(huán)結(jié)構(gòu)均被破壞。本發(fā)明將優(yōu)化后的豬細(xì)小病毒VP2-M基因在家蠶蛹體中進(jìn)行表達(dá)，根據(jù)表達(dá)結(jié)果可見，PPV-VP2-M基因在蠶血或蠶蛹中的表達(dá)量高，比豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白基因原始序列(PPV-VP2)在家蠶中表達(dá)量高出了 2-3倍，達(dá)到每克蛹體2-3 毫克，在12800倍稀釋甚至更高稀釋度下仍能檢測(cè)到所表達(dá)的PPV-VP2-M抗原與抗體的特異性反應(yīng)。血凝實(shí)驗(yàn)檢測(cè)表明，PPV-VP2-M在家蠶中所表達(dá)的含病毒蠶血稀釋到6. 4X IO4 倍時(shí)為仍為陽性。本發(fā)明采用基因重組技術(shù)將豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白的原始序列(SEQ ID NO 1) 或?qū)⒃夹蛄袃?yōu)化后的序列(SEQ ID NO :2)克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體上，在多角體啟動(dòng)子、PlO啟動(dòng)子或別的病毒和真核生物的強(qiáng)啟動(dòng)子控制之下，通過體內(nèi)或體外(in vivo/in vitro)重組，使PPV空衣殼蛋白的原始序列或優(yōu)化后的序列整合到桿狀病毒的基因組上， 得到重組病毒；重組病毒可通過經(jīng)口食下或采用各種手段透過表皮感染1-5齡(最優(yōu)時(shí)間為四或五齡)的昆蟲幼蟲或蛹體(最優(yōu)時(shí)間為1-2天的早期嫩蛹)，表達(dá)生產(chǎn)豬細(xì)小病毒空衣殼抗原。本發(fā)明的最優(yōu)選的一個(gè)整體技術(shù)方案如下將空衣殼蛋白的原始序列VP2(SEQID N0:1所示)或優(yōu)化后的序列VP2-M(SEQ ID NO :2所示)分別克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體 PVL1393上，再通過體內(nèi)重組將豬細(xì)小病毒衣殼蛋白基因的原始序列VP2或密碼子優(yōu)化后的序列VP2-M分別轉(zhuǎn)移到家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJS的基因組上，替代基因組上的Polyhedrin基因，通過空斑篩選技術(shù)和PCR檢測(cè)技術(shù)，分別獲得攜帶豬細(xì)小病毒衣殼蛋白基因VP2的重組家蠶桿狀病毒rBmNPV(PPV-VP2)以及rBmNPV(PPV-VP2-M)；再將所獲的重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞系或穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹，大量繁殖 rBmNPV (PPV-VP2)、rBmNPV (PPV-VP2-M)；當(dāng) rBmNPV (PPV-VP2)、rBmNPV (PPV-VP2-M)在蠶體內(nèi)復(fù)制時(shí)，VP2及VP2-M基因在多角體蛋白基因(polh)啟動(dòng)子控制下表達(dá)，并自我組裝成為豬細(xì)小病毒空衣殼抗原；在感染3-6天(最佳為5天，25°C飼養(yǎng)或保護(hù)溫度)后收集含豬細(xì)小病毒空衣殼抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液(或整體勻漿)，經(jīng)過輻射照射殺滅桿狀病毒、 將蛋白純化后便得到安全、高效的豬細(xì)小病毒空衣殼抗原，此抗原可直接用于制備預(yù)防豬細(xì)小病毒病的注射用或口服疫苗。本發(fā)明還提供了一種用于預(yù)防或治療豬細(xì)小病毒病的疫苗，該疫苗由有效量的本發(fā)明方法所制備的豬細(xì)小病毒空衣殼抗原與藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成；其中，所述的載體或輔料可以是各種常用的佐劑、稀釋劑或表面活性劑等；可以按照疫苗制劑中常用的方法將所述的疫苗制備成口服或注射用疫苗，這些制備方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所習(xí)知本發(fā)明方法采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器中安全、高效的生產(chǎn)豬細(xì)小病毒抗原空衣殼顆粒，其生產(chǎn)成本顯著低于傳統(tǒng)的制備豬細(xì)小病毒抗原方法(例如通過細(xì)胞繁殖病毒制備豬細(xì)小病毒抗原)，無需投資建廠，無三廢，電力和水資源等能源消耗極少。 由于家蠶已經(jīng)我國(guó)衛(wèi)生部批準(zhǔn)為食藥兼用昆蟲，所以將本發(fā)明方法所制備的抗原純化后， 安全性極高，可直接制作疫苗免疫動(dòng)物。本發(fā)明方法可以大幅度降低豬細(xì)小病毒抗原空衣殼顆粒的生產(chǎn)成本，具有表達(dá)效率高、所表達(dá)的蛋白免疫活性高、生產(chǎn)成本低、可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。


圖IPPV血凝試驗(yàn)結(jié)果(稀釋倍數(shù)為103) ；A :VP2 ；B :VP2_M ；C 陰性蠶血。圖2本發(fā)明方法所表達(dá)的豬細(xì)小病毒空衣殼粒子的電鏡觀察結(jié)果。圖3免疫電鏡觀察所表達(dá)的豬細(xì)小病毒空衣殼粒子結(jié)果(樣品40X稀釋)。
具體實(shí)施例方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明，下面給出一系列實(shí)施例。這些實(shí)施例完全是例證性的，它們僅用來對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體描述，不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。試驗(yàn)材料1.大腸桿菌株E. coli DH5a購自Promega公司；克隆載體pEASY_T3購自全式金公司；克隆載體PMD18-T購自TaKaRa公司；原核表達(dá)載體pET_28a+、受體菌E. coliTOPIO 和BL21(DE3)均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所分子微生物實(shí)驗(yàn)室保存；運(yùn)載載體 PVL1393購自于Invitrogen公司；豬細(xì)小病毒衣殼蛋白基因的原始序列VP2是自發(fā)病動(dòng)物病變組織中提取并克隆到載體上得到；密碼子優(yōu)化后的序列VP2-M直接生物合成；家蠶細(xì)胞BmN、家蠶核型多角體病毒親本株Bm-NPV-ZJS由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所分子微生物實(shí)驗(yàn)室保存(也可向中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所或中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所購買獲得)；高表達(dá)家蠶品種JYl由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存(也可向中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所或中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所購買獲得)。2.酶與試劑所用限 制性內(nèi)切酶和配套的緩沖液均購自Promega公司。 T4DNALigase及緩沖液為Promega公司產(chǎn)品。LA Taq聚合酶及緩沖液購自TaKaRa公司。 RnaseA、dNTPs購自Sigma公司。各種規(guī)格的DNA和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)為TranGen Biotech 公司產(chǎn)品。3.生化試劑:bisacrylamide, acrylamide、IPTG、X-Gal 購自 Promega 公司； Tris, Ampicillin, Kanamycin, IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100, TEMED(N, N，N ‘， N ‘ -Tetramethylethylene diamine)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate)、卡那霉素 (Kanamycin)購自Sigma公司，細(xì)胞培養(yǎng)基TC-100購自GIBCO公司。瓊脂糖為Sunbiotech 公司產(chǎn)品；酵母抽提物(Yeast Extract)、胰蛋白胨均購自英國(guó)OXOID公司；0. 2um、0. 45um 濾器購自GelmanSciences公司；溴化乙錠(EB)、考馬斯亮蘭R-250購自Fluka公司。瓊脂粉為日本進(jìn)口分裝。Ni-NTA樹脂、Proteinase K和胎牛血清購自Invitrogen公司。4.培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B(1%蛋白胨、0. 5%酵母提取物、NaCl， pH7. 0)；家蠶細(xì)胞培養(yǎng)基為TC-100。實(shí)施例1豬細(xì)小病毒抗原的制備、純化及動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)及病毒攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)1.有關(guān)溶液和培養(yǎng)基的配制溶液I :50mmol/L 葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl (ρΗ8· 0)，10mmol/L EDTA。溶液II :0. 2mol/L NaOH, 1 % SDS(現(xiàn)配現(xiàn)用)。溶液III IOOmL 體系，5mol/L 醋酸鉀 80mL，冰乙酸 12mL, ddH208mL。TAE (50X) 242gTris 堿，57. ImL 冰乙酸，IOOmL 0. 5mol/L EDTA (pH8. 0)，無菌水容至 IOOOmL0TER 溶液胰 RNAse(RNAse Α)溶解于 IOmM Tris-HCl U 5mMNaCl 中，配成 10mg/mL 的儲(chǔ)存液_20°C凍存，用IXTE buffer稀釋成20yg/mL的工作液4°C保存。PPt Buffer 異丙醇 22mL ；5mol/mL KAc ImL ；ddH202mLoIXTE buffer :10mmol/L Tris · Cl (ρΗ8· 0)，lmmol/L EDTA (ρΗ8· 0)，121 °C高溫高壓蒸汽滅菌20min后儲(chǔ)存于4°C。溴化乙錠(EB)溶液母液將EB配成濃度為10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器儲(chǔ)存
于室溫即可。6mol/L NaI 將 0. 75g Na2SO3溶于 40mL ddH20 中，加入 45gNaI 并攪拌至完全溶解， 4°C儲(chǔ)存。玻璃奶(Glassmilk)將IOg (100mg/mL，Sigma S-5631)的 Silica 溶于 IOOmL PBS 中，沉淀2h，棄上清，重復(fù)該步驟2 3次；2000g離心2min，將沉淀物溶于3mol/L的NaI 中，終濃度為100mg/mL，4°C下避光保存。New Wash 洗液=Tris-HCl (pH 7. 4)20mmol/L ；EDTA lmmol/L ；NaCl 1 OOmmo 1/L ；與等體積的無水乙醇配制而成。蛋白表達(dá)誘導(dǎo)物IPTG為lmol/L，超純水配制后用0. 2mm濾器過濾除菌。蛋白上樣緩沖液(2X):100mmol/L Tris-HCl (ρΗ6· 8)、20(kimol/L 二硫蘇糖醇 (DTT)、4% SDS、0. 2%溴酚藍(lán)、10%甘油。30%丙烯酰胺溶液29g 丙烯酰胺，IgN, N'-亞甲叉丙烯酰胺，溶于IOOmL水，過
濾ο
考馬斯亮藍(lán)染液0. 24g考馬斯亮藍(lán)R250溶于90mL甲醇水(1 l,v/v)和IOmL 冰乙酸中。 脫色液90mL甲醇水(1 1，ν/ν)和IOmL冰乙酸。裂解緩沖液(pH8.0):50mmol/L Tris_Base、0· IM NaCl。包涵體洗滌液I (ρΗ8· 0) :20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaClU % TritonX-100。包涵體洗滌液II (ρΗ8· 0) :20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaCl、2M 尿素包涵體蛋白溶解液(ρΗ8·0):20mmol/L Tris_Base、0. 2M NaCl、8M 尿素II NTA-OBuffer :20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5MNaCl, 10% Glycerol, 8M Urea ；脲NTA-500Buffer:20mM Tris-HCl pH7. 9,0. 5MNaCl, 10% Glycerol, 8M UreaO. 5M Imidazole。Bradford 試劑為 Bio-Rad 公司 Protein Assay Dye-Reagent Concentrate。ELISA 所需試劑包被液(ρΗ9· 6) 1. 59g Na2CO3,2. 93g NaHCO3, ddH20 定容至 1L，保存于4°C;臨用前配制封閉液，BSA溶于PBS中至終濃度為1%;洗滌液為含0. 05% Tween-20 的PBS ；底物緩沖液為1. 84g Na2P04 ·12Η20、0. 51g檸檬酸、ddH20定容至IOOmL ；OPD顯色液是4mg OPD溶于IOmL底物緩沖液，加15 μ L 30% H2O2，臨用前配制；終止液為2mol/L H2S04。Western blotting試劑半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)膜緩沖液是14. 41g甘氨酸、12. Ilg Tris-Base,50ml 甲醇、ddH20 定容至 1L、4°C保存；IXPBS 加 Tween-20 至終濃度為 0. 1% 配成洗滌液；BSA溶于PBS中至終濃度為3%為封閉液；純化的多克隆抗體用封閉液按 1 1000稀釋；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體用封閉液按1 1000稀釋；臨用前配制DAB顯色液，4mg DAB 溶于 IOmL IOOmmol/L ρΗ7· 5 的 Tris-Cl 中，力口 15 μ L 30% H2O20LB培養(yǎng)基胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，調(diào)整pH值到7. 0 (固體培養(yǎng)基含1. 5%瓊脂)。液體培養(yǎng)基中加入1. 5%瓊脂粉，121°C高溫高壓蒸汽滅菌15min，在溫度低于45°C且還未凝固時(shí)，加入相應(yīng)抗生素溶液，混勻后倒入平板，為L(zhǎng)B固體培養(yǎng)基4°C 保存?zhèn)溆谩?豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白基因的原始序列VP2的獲得和載體構(gòu)建2. 1病毒基因組的提取2. 1. 1取發(fā)病樣品(豬流產(chǎn)胎兒)1克左右磨碎，反復(fù)凍融3次后，取5000rpm離心10分鐘后的上清液，加入等體積的裂解緩沖液(20mmol Tris, 20mmolEDTA, 1 % SDS)，然后加入蛋白酶K至終濃度為200 μ g/ml，56°C水浴30min。2. 1. 2用等體積的Tris-cl飽和酚、酚/氯仿(1 1)、氯仿各抽提一次，12000rpm, 離心5min。 2· 1. 3取上清加入1/10體積的3mol/L醋酸鈉(ρΗ5· 2)，2倍體積的無水乙醇，-20°C放置30min，12000rpm, lOmin，棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌1次，自然干燥后， 加入50 μ 1 TER (含RNase)溶解。2. 2設(shè)計(jì)引物，通過PCR的方法擴(kuò)增出豬細(xì)小病毒VP2基因。所設(shè)計(jì)的VP2基因擴(kuò)增引物為VP2 上游5，-GATAGGATCCATGAGTGAAAATGTGGAACAAC3，，BamH I酶切位點(diǎn)VP2 下游5，-CGCTCTAGACTAGTATAATTTTCTTGGTATAAG-3’。
Xba I酶切位點(diǎn)PCR反應(yīng)體系如下表IPCR反應(yīng)條件
權(quán)利要求
1.一種豬細(xì)小病毒空衣殼抗原的制備方法，其特征在于，包括將豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白VP2基因或優(yōu)化的豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白VP2基因克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體中，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)移表達(dá)載體；將所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體與桿狀病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，獲得重組桿狀病毒；用重組桿狀病毒感染昆蟲宿主或昆蟲細(xì)胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主或昆蟲細(xì)胞表達(dá)重組豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白；收獲并純化所表達(dá)的重組豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白，即得。
2.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白基因廠松的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1所示；所述優(yōu)化的豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白VP2基因的核苷酸序列為SEQ ID N0:2所示。
3.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的桿狀病毒運(yùn)載載體選 自 AcRP23-lacZ, AcRP6_SC, AcUffl-IacZ, BacPAK6, Bac to Pac, Bacmid, BlucBacII(pETL)， p2Bac, p2Blue, p89B310, pAc360,pAc373, pAcAB3，pAcAB 4，PAcAS3, pAcC129，pAcC4，DZI, pAcGP67, pAcIEl, pAcJPl, pAcMLF2，pAcMLF 7，pAcMLF 8， pAcMPl, pAcMP2, pAcRP23, pAcRP 25， pAcRW4, pAcsMAG, pAcUffl, pAcUW21, pAcUW2A, pAcUW2B, pAcUW3, pAcUW31, pAcUW41, pAcUW42, pAcUW43, pAcUW51, pAcVC2, pAcVC 3， pAcYMl, pAcJcC5, pBacl、pBac2, pBlueBacIII, pBlueBacHis, pEV55, mXIV, pIEINeo, pJVETL, pJVNhel, pJVPIO, pJVrsMAG, pMBac, pPIO, pPAKl, pPBac, pSHONEX 1. 1，pSYN XIV VI+, pSYNVI+wp, pSYNXIV VI-, pVL1391,pVL 1392,pVL 1393,pVL941,pVL 945,pVL 985， pVTBac, pBM030 或pUAC-5。
4.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的桿狀病毒選自BmNPV、AcMNPV、 ApNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SIMNPV、SeMNPV 或 SpltNPV ；優(yōu)選的，所述桿狀病毒為家蠶桿狀病毒親本株Bm-NPV-ZJ8。
5.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的昆蟲宿主選自家蠶 (Bombyx mori)、野香(Bombyx mandarina)、蓖麻香(Philosamia cynthia ricim)、樟 ^(Dictyoploca japanica)、 _ ^(Philosamia cynthia pryeri)、豐乍 ^(Antheraea pernyi)、日本昨香(Antheraea yamamai)、野天香(Antheraea poIyphymus)、苜猜尺蠖 (Atographa califorica)、荼尺蠖(Ectropis obliqua)、甘蘭夜蛾(Mamestra brassicae)、 斜紋夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘蟲(Spodoptera frugiperda)、粉紋夜蛾 (Trichoplusia ni)、行軍蟲(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉鈴蟲(Heliothis armigera)、 美國(guó)棉鈴蟲(Heliothis zea)、煙青蟲(Heliothis assulta)、煙草夜蛾(Heliothis virescens)、東方粘蟲(Pseudaletia separata)或舞毒蛾(Lymantria dispar)。
6.按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的感染是將重組桿狀病毒通過口食來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體或透過表皮來感染1-5齡的昆蟲幼蟲或蛹體；優(yōu)選的， 所述的感染是將重組家蠶桿狀病毒感染家蠶細(xì)胞或?qū)⒅亟M家蠶桿狀病毒穿刺接種1-5齡的家蠶幼蟲或蛹體，在感染3-6天后收集含豬細(xì)小病毒抗原的家蠶幼蟲或蛹的體液或組織勻漿；其中，所述的蛹體優(yōu)選為1-2天的早期嫩蛹。
7.由權(quán)利要求1-6任何一項(xiàng)方法所制備得到的豬細(xì)小病毒空衣殼抗原。
8.一種預(yù)防或治療豬細(xì)小病毒的疫苗，其特征在于由有效量的權(quán)利要求7所述的豬細(xì)小病毒空衣殼抗原和藥學(xué)上可接受的輔料組成。
9.優(yōu)化的豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白VP2基因，其特征在于其核苷酸序列為SEQID NO:2所示。
10.權(quán)利要求9所述的優(yōu)化的豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白VP2基因在制備預(yù)防或治療豬細(xì)小病毒疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種豬細(xì)小病毒空衣殼抗原的制備方法及其產(chǎn)品。本發(fā)明方法包括將豬細(xì)小病毒衣殼蛋白VP2基因或優(yōu)化后的VP2基因克隆到桿狀病毒運(yùn)載載體中，構(gòu)建得到轉(zhuǎn)移表達(dá)載體；將所構(gòu)建的轉(zhuǎn)移表達(dá)載體與桿狀病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，獲得重組桿狀病毒；將重組桿狀病毒感染昆蟲宿主或細(xì)胞；培養(yǎng)被感染的昆蟲宿主表達(dá)相應(yīng)的豬細(xì)小病毒空衣殼蛋白；收獲并純化所表達(dá)的抗原，即得。本發(fā)明方法采用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在家蠶生物反應(yīng)器中安全、高效的生產(chǎn)豬細(xì)小病毒抗原空衣殼顆粒，所制備的抗原純化后，安全性極高，可直接制備成疫苗免疫動(dòng)物。本發(fā)明抗原制備方法具有表達(dá)效率高、所表達(dá)的抗原免疫活性高、生產(chǎn)成本低、可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C07K14/015GK102382845SQ20111031076
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月14日
發(fā)明者劉慧芬, 張志芳, 易詠竹, 李軼女, 沈桂芳, 王國(guó)增, 王金輝 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所