專利名稱：一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白、試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種診斷登革病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，以及以該抗原蛋白作為包被抗原的登革病毒檢測試劑盒。
背景技術：
登革病毒(Dengue virus, DV)隸屬黃病毒科，包括1 4個血清型，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全世界超過100個國家的25億人正受登革病毒威脅，每年感染人口多達5000 萬 1億，其中有25 50萬人屬于嚴重的登革出血熱，平均死亡率為5 %，是僅次于瘧疾的重要熱帶病。我國南方各省為登革熱高發(fā)區(qū)，監(jiān)測表明，1990 2010年間我國每年都有登革熱流行，種種跡象表明我國已成為登革病毒的疫源地。因此，登革病毒的預防與控制日益緊迫。而該類病毒防制的關鍵在于及時發(fā)現(xiàn)，并盡早隔離，故而對登革病毒及時、有效地檢測對于該病的檢疫和防止具有非常重要的意義。目前國內(nèi)外關于登革病毒檢測方法一般采取病毒分離、核酸檢測及免疫學檢測。其中病毒分離及核酸雜交法操作都較繁瑣，對儀器要求較高，而且其周期都較長，且病毒分離還受標本抽取時間、臨床用藥等因素的影響，達不到早期快速診治的目的，很難在實踐中得到應用；建立在PCR基礎上的快檢方法近年進展較快，但對設備及操作人員的要求較高，容易產(chǎn)生假陽性、假陰性結(jié)果。免疫學檢測主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及膠體金等方法，速度快，對實驗要求不高，不需要無菌操作，可以自動化、高通量的檢測大量樣品，同時也比較靈敏、可靠，并且已經(jīng)在不同的病原檢測中得到廣泛應用，其操作已被廣大基層衛(wèi)生防疫人員熟練掌握，有其他方法無法代替的優(yōu)勢。從現(xiàn)有技術中公開的登革病毒血清學診斷方面的資料來看，主要存在以下方面的問題(1)不同黃病毒之間存在嚴重的血清學交叉反應，在那些存在多種黃病毒流行的區(qū)域，由于混合感染，患者體內(nèi)存在交叉抗體，使得免疫學診斷及鑒別診斷十分困難。(2)由于IgG抗體可以在宿主體內(nèi)存在很長時間，有的還會超過10個月，甚至終生攜帶，使得鑒別過去、最近還是現(xiàn)在感染登革病毒十分困難。( 登革病毒為小RNA病毒，具有較高的突變率，因此采用單抗原檢測時其覆蓋面往往受到限制。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的所解決的技術問題在于提供一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白及其制備方法，該重組抗原蛋白具有特異性強、親和力高的優(yōu)點，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學交叉反應，而與登革病毒抗體具有極高親和力。本發(fā)明的所解決的技術問題在于提供一種登革病毒的檢測試劑盒，利用所制備的重組抗原蛋白，建立登革病毒抗體的ELISA快速檢測技術。為了解決上述技術問題，一方面，本發(fā)明提供一種檢測登革病毒的重組抗原蛋白， 所述重組抗原蛋白包括具有如SEQ ID而.6所示氨基酸序列的0611-六85。優(yōu)選地，所述Den-Ag5的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
優(yōu)選地，所述重組抗原蛋白還包括具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的Den-Agl 和/或具有SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列Den-Ag2 ；所述Den-Agl的編碼基因序列具有如 SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列。進一步優(yōu)選地，所述重組抗原蛋白為Den-Ag5、Den-AgU Den-Ag2等量混合而成。該重組抗原蛋白是通過選擇登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，并將相應的目的基因片段通過原核表達載體導入宿主細胞中進行表達而制備得到，而目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊。另一方面，本發(fā)明具體實施方式
中還提供了一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，包括如下步驟一、選擇登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段， 該目的基因片段包含如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；二、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質(zhì)粒；四、將所述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的表達宿主細胞中，培養(yǎng)所述表達宿主細胞使其產(chǎn)生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ ID N0. 6所示氨基酸序列。優(yōu)選地，所述目的基因片段還包括如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列編碼具有如SEQ ID N0. 2所示氨基酸序列的Den-Agl ；如SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列編碼具有如SEQ ID N0. 4所示氨基酸序列的Den-Ag2。優(yōu)選地，所述步驟二中采用的PCR擴增引物序列如下擴增SEQ ID NO. 1核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQID NO. 7>反向引物ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT<SEQID NO. 8> ；
擴增SEQ ID N0. 3核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQID N0. 9>，反向引物ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQID NO. 10> ；擴增SEQ ID N0. 5核苷酸序列的引物正向引物CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQID Ν0· 11 >，反向引物ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQID Ν0· 12>。優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個具體實施例中所述原核表達載體選用pET3h或pMAL c2x原核表達載體，所述表達宿主細胞為大腸桿菌。對于本發(fā)明的重組抗原蛋白，其具有特異性強、親和力高的優(yōu)點，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學交叉反應，而與登革病毒抗體具有極高親和力。在本發(fā)明的實施例中，
5通過將表達獲得的抗原蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，用病毒抗血清進行ffestern-blot，驗證了本發(fā)明的重組抗原蛋白具有極高的特異性，并獲取了能高效表達登革病毒特異性重組抗原的基因工程菌株，同時結(jié)合采用了該重組抗原蛋白的登革病毒檢測試劑盒在其靈敏度試驗、特異性試驗和對具體臨床標本的測試試驗結(jié)果，更進一步地說明了本發(fā)明的重組抗原蛋白在用于檢測登革病毒時表現(xiàn)出的高靈敏度、高特異性的優(yōu)勢。對于本發(fā)明的重組抗原蛋白制備方法，由于其選擇了登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，而目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊，同時結(jié)合上述方案中涉及的專用引物，有效地獲取了該目的基因，同時結(jié)合該方法中采用的原核表達載體和表達宿主菌，使重組抗原蛋白具備高效的表達效果。另外，在本發(fā)明的實施例中，通過將表達獲得的抗原蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后，用病毒抗血清進行ffestern-blot，同時結(jié)合采用了該重組抗原蛋白的登革病毒檢測試劑盒在其靈敏度試驗、特異性試驗和對具體臨床標本的測試試驗結(jié)果，更進一步地說明了本發(fā)明的重組抗原蛋白的制備方法在高效表達重組抗原蛋白、以及保證本發(fā)明重組抗原蛋白的高靈敏度、高特異性方面表現(xiàn)出的優(yōu)勢。另外，本發(fā)明還提供了一種登革病毒的檢測試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應液，所述抗體檢測板上包被有檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，而所述重組抗原蛋白即為本發(fā)明上述方案中揭示的重組抗原蛋白。其中，試劑盒中ELISA反應液包括酶結(jié)合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液，酶結(jié)合物工作液，陽性對照為登革病毒抗體標準品，陰性對照為登革病毒抗體陰性血清。優(yōu)選地，在本發(fā)明具體實施例中所述酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標記的抗人 IgG0優(yōu)選地，所述抗體檢測板的制備過程包括如下步驟一、按照本發(fā)明上述方案中揭示的重組抗原蛋白制備方法制備重組抗原蛋白；二、將純化后的重組抗原蛋白固定于酶聯(lián)板，該過程包括將步驟一中純化得到的重組抗原蛋白分別以梯級濃度包被酶聯(lián)板，每孔50-200ul，4°C包被過夜，而后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1-2分鐘；將其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封閉1-3小時，晾干后即得到所述抗體檢測板；而所述重組抗體為即為本發(fā)明上述方案中揭示的檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白。優(yōu)選地，在本發(fā)明的一個具體實施例中，所述重組抗原蛋白為Den-Ag5、Den-AgU Den-Ag2等量混合而成。結(jié)合本發(fā)明的優(yōu)選實施例中揭示的實驗內(nèi)容可以看出，實驗中在保證反應原性的基礎上，盡量縮短了抗原片段長度，確保所篩選的原核表達抗原具備良好的特異性，與所測試的流行性乙型腦炎、黃熱、西尼羅河、基孔肯亞、辛德畢斯、西門利克、馬雅羅、羅斯河、鷺山及蓋塔病毒均無交叉反應。同時，所建立的制備方法及登革病毒的檢測試劑盒均具備較高靈敏度及檢出范圍，以登革病毒小鼠免疫血清進行的實驗表明，在血清1 1 1 1觀00倍稀釋范圍內(nèi)，均可獲得陽性結(jié)果，而且無非特異性結(jié)果。以登革病毒患者血清進行的實驗表明，在血清1 50 1 200倍稀釋范圍內(nèi)，均可獲得陽性結(jié)果，檢測OD值在0. 25以上，S/N比值在15以上。另外，還需要說明的是，本發(fā)明的優(yōu)選實施例中包被于抗體檢測板上的重組抗原蛋白由三段登革病毒原核表達抗原混合而成，既包括病毒NSl早期蛋白，可用于早期診斷，也包括病毒E包膜蛋白，具備較高的敏感性，并且多檢測位點也提高了檢測方法的覆蓋面。但本發(fā)明的所要求保護的內(nèi)容并不僅限于該技術方案，實驗數(shù)據(jù)表明，僅含有Den-Ag5 的重組抗原蛋白即可實現(xiàn)該檢測，而該實施例中的方式通過等量的三種混合抗原，保證了試劑盒較高的敏感性和有效性。另一方面，結(jié)合本發(fā)明的重組抗原蛋白用于登革病毒的檢測試劑盒的具體實施方式
，充分說明了本發(fā)明的重組抗原蛋白在制備診斷登革病毒試劑盒中的運用，并能夠保證登革病毒診斷過程中的靈敏度和特異性。相對于全病毒抗原，重組抗原蛋白純度高、特異性強，便于質(zhì)量控制，可以去掉不與抗體結(jié)合的無關區(qū)段，將使得檢測靈敏度和特異性增加， 并且成本也較低，在病毒檢測中具有較大優(yōu)勢。
圖1是本發(fā)明實施例1中登革1-4型病毒、黃熱病毒、流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體與原核表達抗原的western blot雜交結(jié)果。a =SDS PAGE電泳圖；b 登革1型病毒多克隆抗體^festern blot結(jié)果；c 登革2型病毒多克隆抗體flfestern blot結(jié)果；d 登革3型病毒多克隆抗體^fester blot結(jié)果；e 登革4型病毒多克隆抗體flfestern blot結(jié)果；f 黃熱病毒多克隆抗體Astern blot結(jié)果；g 流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體flfestern blot 結(jié)果。1.未誘導對照；2. pMAL c2x 空載體誘導；3. Den-Ag 1+pMAL c2x ；4. Den_Ag2+pET32a ； 5. Den-Ag3+pMAL c2x ；6. Den-Ag4+pMAL c2x ；Μ.蛋白分子量 Marker (分子量由上至下分別為 170、130、95、72、55、43、34、26、17kDa) ；7.Den_Ag5+pET32a。圖2是本發(fā)明實施例中ELISA方法及其應用；其中，a 抗原包被濃度實驗，Al A2，Bl B2，Cl C2，Dl D2，El E2，F(xiàn)l F2，Gl G2分別為三種重組抗原等量混合后 20ug/ml、10ug/ml、5ug/ml、2. 5ug/ml、l. 25ug/ml、0. 625ug/ml、0. 3125ug/ml 包被，H1、H2 為未包被對照；b =ELISA敏感性實驗，正交法法將鼠抗登革2型病毒多克隆抗體進行稀釋， 測定ELISA方法敏感性；c =ELISA特異性實驗，Al，A2孔加登革1型病毒多克隆抗體，Bi， B2為登革2型病毒多克隆抗體，Cl，C2為登革3型病毒多克隆抗體，Dl, D2為登革4型病毒多克隆抗體，El, E2為流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體，F(xiàn)l, F2為黃熱病度多克隆抗體， Gl，G2為西尼羅河病毒多克隆抗體；Hl，H2基孔肯雅病毒多克隆抗體；A3，A4為瑪雅羅病毒多克隆抗體；B3，B4為羅斯河病毒多克隆抗體，C3，C4為鷺山病毒多克隆抗體，D3，D4為蓋塔病毒多克隆抗體；E3，E4，辛德畢斯病毒多克隆抗體；F3，F(xiàn)4，西門利克病毒病毒多克隆抗體；G3，G4為陰性血清對照；H3，H4為陽性血清對照；d 臨床標本檢測結(jié)果，Al A4 1號患者血清50、100、400、800倍稀釋后的檢測結(jié)果，Bl B4，2號患者血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果，Cl C4，3號患者血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果，Dl D4，4 號患者血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果，El E4，5號患者血清50、100、200、400 倍稀釋后的檢測結(jié)果，F(xiàn)l F4，6號患者血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果；Gl G4，陰性血清50、100、200、400倍稀釋后的檢測結(jié)果，Hl H4，陽性血清2000、4000、8000、 16000倍稀釋后的檢測結(jié)果。
具體實施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實施手冊中所述的條件。本發(fā)明的下列實施例中，選用的登革病毒為登革病毒1型(Hawaii株，DVl)，登革病毒2型(NGC株，DV2)，登革病毒3型(H87株，DV3)，登革病毒4型(H241株，DV4)，申請人實驗室內(nèi)有毒株樣本；而實驗中用的內(nèi)切酶、連接酶、T載體購自大連TaKaRa公司。凝膠純化回收及質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖匈徸設MEGA公司。Trizol及反轉(zhuǎn)錄試劑購自^witrogen 公司。pET3h表達載體及其重組蛋白純化試劑購自Novagen公司，pMAL-Ch表達載體購自New England Biolabs公司，Amylose Resin親和層析試劑購自NEB公司，表達宿主菌 Rosetta (DE3)由本實驗室傳代保存。實施例1、檢測登革病毒的重組抗原蛋白的制備按照如下步驟制備檢測登革病毒的重組抗原蛋白步驟一、選擇登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊。其中，目的基因片段包括Den-Ag5的編碼序列、Den-Agl的編碼序列和Den_Ag2的編碼序列，Den-Agl的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；所述Den-Ag5的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。步驟二、設計PCR擴增引物，并通過PCR分別擴增步驟一種三個不同的目的基因片段。其中，所述步驟二中采用的PCR擴增引物序列如下擴增SEQ ID NO. 1核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQID NO. 7>
反向引物ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT<SEQ ID NO. 8> ；擴增SEQ ID N0. 3核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQID N0. 9>，反向引物ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQID NO. 10> ；擴增SEQ ID N0. 5核苷酸序列的引物正向引物CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQID Ν0· 11 >，反向引物ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQID Ν0· 12>。步驟三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質(zhì)粒；步驟四、將所述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的表達宿主細胞中，培養(yǎng)所述表達宿主細胞使其產(chǎn)生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白。具體實現(xiàn)實現(xiàn)時，上述步驟一中，參考登革病毒登革2型病毒NGC株基因組序列， 利用DNAstar及ANTHEPR0T軟件對其編碼蛋白疏水性、抗原性、可及性及可塑性進行詳細分析，并參考Genbank中的序列信息，對預測的抗原表位進行比對，初步篩選可能的抗原性片段5段。步驟二中，根據(jù)步驟一種所選的抗原性片段，并結(jié)合多肽結(jié)構中需要的延伸區(qū)段， 并通過優(yōu)化設計與各區(qū)段對應的引物，通過PCR擴增相應的目的基因片段，從而使由延伸區(qū)段編碼柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊。為此，在本步驟的優(yōu)選過程中，設計PCR擴增引物5對，如表一所示表一抗原片段克隆所用引物序列
引物名稱序列(5’to3’)_
DenAgl-R ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAT DenAg2-F
CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT
DenAg2-R
ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG
DenAg3-F
CGGAATTCAAAACGGAAGCCAAACAGCCTG
DenAg3-R
ACGTGTCGACCTTCTTGGGATCCTAAAACAAC
DenAg4-F
CGGAATTC ATGCATACAGCACTCACAGG
DenAg4-R
ACGTGTCGACCTGTGCACATGGAGTATGAC
DenAg5-F
CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA DenAg5-R ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC其中，引物設計過程為根據(jù)抗原性分析結(jié)果設計表一中所述的引物5對，并分別于引物5’末端及3’末端導入BamH I及Hind III酶切位點。作為獲取目的基因片度的預先步驟，還需反轉(zhuǎn)錄登革病毒的基因組，該反轉(zhuǎn)錄過程為登革2型病毒NGC株經(jīng)C6/36細胞培養(yǎng)傳代培養(yǎng)，采用hvitrogen的Trizol試劑提取病毒RNA，采用常規(guī)方法進行反轉(zhuǎn)錄獲得其cDNA。而后按如下條件進行PCR:取cDNA2 μ 1，10XPCR緩沖液5 μ 1，正向引物、反向引物各2μ l、dNTP 8 μ l.Taq 2U，補水至總體積50 μ 1進行PCR擴增。反應參數(shù)為:95°C 5min， 然后94°C 30s, 55°C 40s, 72°C 60s，共32次循環(huán)，最后一次循環(huán)后72°C延伸7min，擴增片段經(jīng)純化、回收后，-20°C保存?zhèn)溆?。步驟三中、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有目的基因片段的重組表達質(zhì)粒。在本發(fā)明實施例中，所述原核表達載體為PET3M或 PMAL ch原核表達載體，所述表達宿主細胞為大腸桿菌。本步驟具體如下酶切各取IOul經(jīng)純化的擴增產(chǎn)物，分別加入Buffer K 3ul，BamH I及Hind III 各1111(10扔，滅菌去離子水15111，371酶切過夜。另取pET3h或pMAL dx表達載體質(zhì)粒 2ug JnABuffer K 3ul，BamH I 及 Hind III 各 Iul (IOU)，滅菌去離子水補至 30ul，37°C酶切過夜。酶切產(chǎn)物分別用TaKaRa公司凝膠回收試劑盒純化回收。連接取2ul經(jīng)以上處理的ρΕΤ3^ι或pMAL c2x載體(約130ng)，5ul酶切目的片段(約40ng)，45°C加熱5min，以使退火的粘端解鏈，立即冰浴lOsec，加入T4DNA連接酶 0.5U，連接酶Buffer Iul，用滅菌四餾水補至IOul，16°C連接過夜。取重組質(zhì)粒5ul轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌Dffia，加入無抗生素的LB液體培養(yǎng)基300ul，37°C復蘇45min后，取IOOul涂氨芐青霉素(100ug/ml)平皿，37°C培養(yǎng) 18h。重組子鑒定挑取白色菌落進行菌落PCR鑒定，PCR反應體10XPCR緩沖液2 μ 1， 正向引物、反向引物各1μ l、dNTP 0.4 μ l.Taq 2U，補水至總體積20 μ 1進行PCR擴增。PCR 反應條件同步驟二，陽性克隆送生物工程(上海)有限公司測序確認。經(jīng)測序確認獲正確重組表達質(zhì)粒5組，并提取質(zhì)粒，并-20°C保存?zhèn)溆?。步驟四中、將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的表達宿主細胞中，培養(yǎng)表達宿主細胞， 并檢測其重組蛋白表達情況，在本實施例中本步驟具體為挑經(jīng)轉(zhuǎn)化重組表達載體的表達宿主菌單菌落分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)4h，當OD值達0. 6時，吸取未誘導對照菌1ml，并向剩余菌中加入誘導物IPTG使其終濃度為0. 5mmol/L，于37°C振蕩培養(yǎng) 4h，冰浴5min后，4°C、12000g離心^iin收菌，并進行SDS-PAGE檢測，參照分子克隆實驗指南，配制好反應液體，積層膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，積層膠恒流10mA，分離膠恒流 25mA電泳，電泳完畢后，考馬斯亮藍染色，驗證重組蛋白表達情況。經(jīng)本步實驗，所構建的5 個重組表達載體均獲高效表達。而后、對所獲重組表達抗原進行western blot分析，以驗證其免疫反應原性及免疫學反應的特異性，在本實施例中本步驟具體為=SDS-PAGE電泳同步驟四，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，登革1型病毒、登革2型病毒、登革3型病毒、登革4型病毒、黃熱病毒、流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體1 5000稀釋，進行蛋白質(zhì)印跡(western-blot)，驗證表達抗原的反應特異性，獲能高效表達登革病毒特異性重組抗原的基因工程菌株五株，結(jié)果如圖一所示。另外，通過此高效表達菌株進行上述重組抗原蛋白的表達純化實驗，獲取適合用于ELISA實驗的重組抗原蛋白，本實施例中本步驟具體為表達菌過夜培養(yǎng)物IOml接種 IL LB培養(yǎng)基(含100 μ g/ml氨芐青霉素)，37°C振蕩培養(yǎng)2 3小時，待OD值達0.6時， 加入IPTG至終濃度0. 5mM,繼續(xù)37°C振蕩培養(yǎng)4小時后，離心收獲細菌，并用PBS洗滌兩次，50mlPBS重懸，超聲波破碎細菌后，采用NEB公司Amylose Resin親和層析柱純化純化重組蛋白，核酸蛋白分析儀測定其濃度分別為Den-Agl3523l·! g/ml、Den-Ag21627 μ g/ml, Den-Ag51872y g/ml。如圖1所示，進行SDS-PAGE實驗和蛋白質(zhì)印跡，參照分子克隆實驗指南，配制好反應液體，積層膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，積層膠恒流10mA，分離膠恒流25mA 電泳，電泳完畢后，電轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，登革1型病毒、登革2型病毒、登革3型病毒、登革4型病毒、黃熱病毒、流行性乙型腦炎病毒多克隆抗體1 5000稀釋，進行蛋白質(zhì)印跡 (western-blot)，驗證表達抗原的反應特異性，，并獲得能高效表達登革病毒特異性重組抗原的基因工程菌株。而后通過此高效表達菌株進行上述重組抗原蛋白的表達純化實驗，獲取適合用于ELISA實驗的重組抗原蛋白。實施例2、重組抗原蛋白的包被實驗在本實施例中需要對本發(fā)明的重組抗原蛋白的包被條件和濃度進行優(yōu)化 ’為了達到此目的還需要先對試劑盒中ELISA反應液成分進行說明酶結(jié)合物工作液辣根過氧化物酶標記的抗人IgG多克隆抗體；陽性對照登革熱患者血清。
陰性對照登革病毒抗體陰性人血清。樣品稀釋液10mmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中含有1 % BSA，0. 05%Tween_20和 lmg/L慶大霉素；濃縮洗滌液0. lmol/L pH7. 4的磷酸鹽緩沖液中含有1 %胎牛血清，0. 5 % Tween-20和20mg/L慶大霉素；顯色液A :0. 02% H202 ；用0. IM檸檬酸_0. 2M磷酸氫二鈉，PH4. 5 5. 0稀釋。顯色液B 0. 4%o TMB-HCl 用50mM檸檬酸鈉，濃HCl調(diào)PH值為2. 8的溶液溶解。終止液2MH2SO4將上述實施例1中獲取的純化重組抗原蛋白Den-Agl、Den_Ag2、Den_Ag5純化抗原等量混合后，抗原分別以20、10、5、2. 5,1.25,0. 625,0. 3125ug/ml濃度(指3種蛋白混合后的總濃度)包被酶聯(lián)板，每孔用量100ul，4°C包被過夜，PBST洗滌3分鐘，拍干，5% BSA 37°C封閉2小時，鼠抗登革病毒多克隆抗體1 5000倍稀釋后取IOOul加入反應孔，37°C 反應1小時，PBST洗滌4次，每次1分鐘，拍干，HRP標記抗鼠二抗1 10000倍稀釋后，每孔加入IOOul，37°C反應40分鐘，PBST洗滌4次，每次1分鐘，拍干，每孔加入TMB底物溶液 lOOul，37°C反應15分鐘，加入50ul 2M H2S04終止反應，用酶標儀在450nm波長下測定OD 值，如表二所示，結(jié)果顯示在包被濃度2. 5 20ug/ml范圍內(nèi)，實驗OD值無明顯差別，最終選擇抗原包被濃度為10ug/ml。表二抗原包被濃度實驗
權利要求
1.一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于所述重組抗原蛋白包括具有如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列的Den-Ag5，所述Den_Ag5的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于所述重組抗原蛋白還包括具有SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的Den-Agl和/或具有SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列Den-Ag2 ；所述Den-Agl的編碼基因序列具有如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；所述Den-Ag2的編碼基因序列具有如SEQID NO. 3所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求2所述的檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，其特征在于所述重組抗原蛋白為Den-Ag5、Den-Agl、Den-Ag2等量混合而成。
4.一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白的制備方法，其特征在于，包括如下步驟一、選擇登革病毒蛋白中呈現(xiàn)病毒高特異性肽段的編碼基因作為目的基因片段，該目的基因片段包含如SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，該目的基因片段中包括編碼重組抗原蛋白柔性臂的延伸區(qū)段，所述柔性臂能夠消除表達載體的融合蛋白對多肽表位的掩蓋，使表達的重組抗原蛋白正確折疊；二、設計PCR擴增引物，并通過PCR擴增所述目的基因片段；三、通過限制性酶切和連接，將目的基因片段體連接到原核表達載體中，構建含有所述目的基因片段的重組表達質(zhì)粒；四、將所述重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)的表達宿主細胞中，培養(yǎng)所述表達宿主細胞使其產(chǎn)生重組抗原蛋白，并通過純化獲取重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白具有如SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列。
5.根據(jù)權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述目的基因片段還包括如SEQID NO. 1所示的核苷酸序列和/或如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；如SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列編碼具有如SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的Den-Agl ；如SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列編碼具有如SEQ ID而.4所示氨基酸序列的0611-六82。
6.根據(jù)權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述步驟二中采用的PCR擴增引物序列如下擴增SEQ ID NO. 1核苷酸序列的引物 正向引物CGGAATTCGTAGAAGGGGTTTCAGGAGGA<SEQ ID NO. 7> 反向引物ACGTGTCGACCTAACCAACACAACAACAGAAIXSEQ ID NO. 8> ； 擴增SEQ ID NO. 3核苷酸序列的引物正向引物CGGAATTCAACATCTTGAATAGGAGACGCAGAT<SEQ ID NO. 9>， 反向引物ACGTGTCGACTGTCAGTAGGATGAAAATCAG<SEQ ID NO. 10> ； 擴增SEQ ID NO. 5核苷酸序列的引物 正向引物CGGGATCCGGGGTCTTAGAGCAAGGGAA<SEQ ID NO. 11>， 反向引物ACGCAAGCTTTGCTCTTGAGGCACTTGGAC<SEQ ID NO. 12>。
7.一種登革病毒的檢測試劑盒，包括抗體檢測板和ELISA反應液，其特征在于所述抗體檢測板上包被有檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白為權利要求1-3 中任意一項中所述的重組抗原蛋白。
8.根據(jù)權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，試劑盒中ELISA反應液包括酶結(jié)合物工作液，陽性對照，陰性對照，樣品稀釋液，濃縮洗滌液，顯色液A，顯色液B和終止液， 酶結(jié)合物工作液，陽性對照為登革病毒抗體標準品，陰性對照為登革病毒抗體陰性血清，所述酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標記的抗人IgG。
9.根據(jù)權利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述抗體檢測板的制備過程包括如下步驟一、以權利要求4-6中任意一項所述的制備方法制備重組抗原蛋白；二、將純化后的重組抗原蛋白固定于酶聯(lián)板，該過程包括將步驟一中純化得到的重組抗原蛋白分別以梯級濃度包被酶聯(lián)板，每孔50-200ul，4°C包被過夜，而后用磷酸鹽吐溫緩沖液洗滌1-2分鐘；將其拍干后，用5%牛血清白蛋白溶液于37°C封閉1-3小時，晾干后即得到所述抗體檢測板；所述重組抗體為如權利要求1-4中任意一項中所述的重組抗原蛋白。
10.如權利要求1-3中任意一項所述的重組抗原蛋白在制備診斷登革病毒試劑盒中的運用。
全文摘要
一種檢測登革病毒抗體的重組抗原蛋白，所述重組抗原蛋白是以登革病毒的原核表達抗原Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2等量混合而成。本發(fā)明還公開了該重組抗原蛋白的制備方法。另外，本發(fā)明公開的登革病毒的檢測試劑盒中包括抗體檢測板和ELISA反應液，該抗體檢測板上包被有以登革病毒的原核表達抗原Den-Ag5、Den-Ag1和Den-Ag2等量混合而成重組抗原蛋白。本發(fā)明的重組抗原蛋白具有特異性強、親和力高的優(yōu)點，與其它相近的蟲媒傳播病毒無血清學交叉反應，而與登革病毒抗體具有極高親和力，能夠快速、準確地檢測登革病毒抗體，從而診斷登革病毒的感染情況。
文檔編號C07K14/18GK102432676SQ201110300230
公開日2012年5月2日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權日2011年9月30日
發(fā)明者于德憲, 任瑞文, 唐博恒, 張培, 洪文艷 申請人:中國人民解放軍廣州軍區(qū)疾病預防控制中心