專利名稱：納他霉素片狀晶體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種從菌絲體中制備納他霉素片狀晶體的方法。
背景技術(shù)：
納他霉素(Natamycin)又稱匹馬霉素(Pimaricin)是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，它能夠抑制酵母菌和霉菌的生長，且不作用于人體腸道內(nèi)的正常菌群。自1996年起我國食品添加劑委員會(huì)就對(duì)納他霉素進(jìn)行了應(yīng)用方面的跟蹤研究與評(píng)價(jià)，2011年正式出臺(tái)了納他霉素的國家標(biāo)準(zhǔn)，作為食品防霉劑用于奶酪、糕點(diǎn)、肉腸等食品的加工過程中。納他霉素分子式為C33H47N013 ；分子量為665. 75道爾頓；是兩性化合物，等電點(diǎn)為 6. 5。納他霉素由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，發(fā)酵液經(jīng)液固分離后，收集菌絲體，通過添加有機(jī)溶媒和調(diào)節(jié)PH的方法，最終可以得到納他霉素的晶體。納他霉素的晶習(xí)有片狀與針狀兩種， 它們都屬于α-納他霉素晶系。在納他霉素的分離純化過程中，納他霉素的不同晶習(xí)會(huì)影響納他霉素晶體的過濾速度和干燥時(shí)間。針狀晶習(xí)易于聚結(jié)成團(tuán)，在聚結(jié)時(shí)又易于包裹雜質(zhì)而影響純度，同時(shí)增加過濾、洗滌及干燥的難度。采用中國專利CN101062934A公布的提取方法制得的納他霉素晶體是短針狀的或無定形的，不利于納他霉素晶體的過濾及干燥，過濾和干燥時(shí)間都較長。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種納他霉素片狀晶體的制備方法，它可制得均一的納他霉素片狀晶體，從而降低后續(xù)晶體洗滌與干燥的難度，縮短晶體的過濾和干燥時(shí)間。本發(fā)明技術(shù)方案是這樣構(gòu)成的一種納他霉素片狀晶體的制備方法，其特征在于 它包括以下步驟a、取納他霉素菌絲體加入甲醇與水的混合液中；所述的甲醇與水的混合液中，甲醇與水的體積比為60-90 40-10 ；每IL甲醇與水的混合液添加90_110g納他霉素菌絲體；b、用堿性物質(zhì)均勻攪拌調(diào)節(jié)步驟a獲得的溶液的pH值至10-12，使納他霉素溶解于混合溶液中；C、將步驟b獲得的溶液進(jìn)行液固分離，收集濾液得到納他霉素的提取液；d、濃縮步驟c獲得的納他霉素的提取液至納他霉素含量在18 ^mg/ml之間，并絮凝去除在此過程中析出的不溶物，得到納他霉素精提取液；e、分兩階段酸化步驟d獲得的納他霉素精提取液第一階段一邊攪拌納他霉素精提取液一邊緩慢滴加酸，使納他霉素精提取液的PH 值逐步降低到8-9，在pH值不再回升的情況下，再攪拌1小時(shí)以上；第二階段繼續(xù)一邊攪拌納他霉素精提取液一邊緩慢滴加酸，使納他霉素精提取液的pH值逐步降低到6-7，在pH值不再回升的情況下，再攪拌3小時(shí)以上，得到片狀的納他霉素晶體的結(jié)晶液；f、將步驟e獲得的納他霉素晶體的結(jié)晶液進(jìn)行液固分離，然后真空干燥得到片狀納他霉素晶體。本發(fā)明的制備原理說明如下本發(fā)明的申請(qǐng)人通過研究發(fā)現(xiàn)納他霉素提取液中甲醇的含量對(duì)晶習(xí)有很大的影響，并且在納他霉素的結(jié)晶過程中養(yǎng)晶工藝可以改善片狀晶體的顆粒分布，提高納他霉素晶體的純度。根據(jù)以上兩點(diǎn)，本發(fā)明采用一定比例的甲醇與水的混合液從納他霉素菌絲體中提取并純化納他霉素，然后通過結(jié)晶和養(yǎng)晶工藝，分階段酸化納他霉素精提取液，從而制備獲得片狀的純度較高的納他霉素晶體。分階段酸化納他霉素精提取液的目的在于在第一階段，通過滴加酸使納他霉素精提取液的PH值緩慢而有控制的下降，即緩慢而有控制的降低納他霉素的溶解度，防止納他霉素爆發(fā)成核的現(xiàn)象出現(xiàn)；此時(shí)結(jié)晶與溶解趨向平衡，利于晶體的長大，但此時(shí)溶解度較大，直接過濾的話收率低，所以平穩(wěn)后繼續(xù)調(diào)節(jié)PH到第二階段，此時(shí)達(dá)到納他霉素的等電點(diǎn)，溶解度最小，收率高。如果直接調(diào)到等電點(diǎn)，則納他霉素快速結(jié)晶，得到的晶體粒度不均一且包裹雜質(zhì)。第二階段繼續(xù)緩慢而有控制地調(diào)節(jié)pH值至6 7的目的在于使納他霉素的析出主要發(fā)生在已形成的晶核的表面，由此得到的納他霉素片狀晶體顆粒較大、粒度分布較均勻，純度較高。較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明以納他霉素培養(yǎng)物的菌絲體為對(duì)象，通過控制提取液中甲醇與水的比例以及納他霉素的結(jié)晶過程，從而可制得均一的納他霉素片狀晶體，降低后續(xù)晶體過濾與干燥的難度，縮短晶體的過濾和干燥時(shí)間，便于工業(yè)化的生產(chǎn)控制。
圖1是實(shí)施例1所得片狀晶體的顯微照相晶體形貌圖。圖2是實(shí)施例4所得晶體的顯微照相晶體形貌圖。圖3是對(duì)比實(shí)驗(yàn)組的組9所得晶體的顯微照相晶體形貌圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
、實(shí)施例及說明書附圖對(duì)本發(fā)明內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)說明一具體實(shí)施例方式本發(fā)明具體實(shí)施方式
提供了一種納他霉素片狀晶體的制備方法，其特征在于它包括以下步驟a、取納他霉素菌絲體加入甲醇與水的混合液中；所述的甲醇與水的混合液中，甲醇與水的體積比為60-90 40-10 ；每IL甲醇與水的混合液添加90_110g納他霉素菌絲體；本步驟中所述的納他霉素菌絲體為納他霉素發(fā)酵液通過液固分離技術(shù)得到的濕菌絲體或干燥菌絲體，優(yōu)選水分含量的干燥菌絲體。當(dāng)然，也可采用濕菌絲體，如果濕菌絲體的含水量較高，則最好預(yù)先測定一下濕菌絲體的水分含量，這樣在制備甲醇與水的混合液時(shí)可適當(dāng)相應(yīng)減少水的比例。所述的甲醇與水的體積比優(yōu)選為73 27，每IL甲醇與水的混合液優(yōu)選添加IOOg納他霉素菌絲體。b、用堿性物質(zhì)均勻攪拌調(diào)節(jié)步驟a獲得的溶液的pH值至10-12，使納他霉素溶解于混合溶液中；本步驟所述的堿性物質(zhì)優(yōu)選為氫氧化鈉或氨水等，為工業(yè)上常用的調(diào)節(jié)溶液至堿性的物質(zhì)。C、將步驟b獲得的溶液進(jìn)行液固分離，收集濾液得到納他霉素的提取液；本步驟所述的液固分離方法可采用在抗生素提取過程中常用的液固分離方法，如板框過濾、重力離心、抽濾、錯(cuò)流過濾等，其目的在于去除菌渣，收集濾液以得到納他霉素的提取液。d、濃縮步驟c獲得的納他霉素的提取液至納他霉素含量在18 ^mg/ml之間，并絮凝去除在此過程中析出的不溶物，得到納他霉素精提取液；本步驟所述的濃縮方法可采用常用的真空濃縮法。e、分兩階段酸化步驟d獲得的納他霉素精提取液第一階段一邊攪拌納他霉素精提取液一邊緩慢滴加酸，使納他霉素精提取液的PH 值逐步降低到8-9(最優(yōu)值依據(jù)納他霉素的濃度而定，如當(dāng)納他霉素的濃度為22mg/ml時(shí)， PH值是8. 6)，在pH值不再回升的情況下，再攪拌1小時(shí)以上(優(yōu)選1小時(shí))，使納他霉素的成核與晶體生長達(dá)到平衡；第二階段繼續(xù)一邊攪拌納他霉素精提取液一邊緩慢滴加酸，使納他霉素精提取液的pH值逐步降低到6-7，在pH值不再回升的情況下，再攪拌3小時(shí)以上(優(yōu)選3-5小時(shí))， 得到片狀的納他霉素晶體的結(jié)晶液。本步驟的酸化調(diào)節(jié)過程使用的酸為工業(yè)上常用的酸，如鹽酸、硫酸等。本步驟中攪拌為常規(guī)的勻速攪拌方法，如磁力攪拌、機(jī)械攪拌等，攪拌的目的一方面在于使結(jié)晶液混合均勻，避免局部PH過低引起納他霉素爆發(fā)成核，另一方面可以使納他霉素的晶體充分懸浮于結(jié)晶液中，避免晶體粘結(jié)包裹雜質(zhì)。f、將步驟e獲得的納他霉素晶體的結(jié)晶液進(jìn)行液固分離，然后真空干燥得到片狀納他霉素晶體。本步驟中所述的結(jié)晶液的液固分離選用任意常規(guī)的固液分離方法皆可，如抽濾、 離心過濾等。本步驟經(jīng)液固分離得到的納他霉素晶體，可用50%乙醇-水(V V)溶液洗滌3次，于50°C、-0. 09MI^條件下真空干燥至恒重，即可得到白色微帶淡黃色的片狀納他霉素晶體，純度約90%。二、具體實(shí)施例實(shí)施例1取納他霉素的干燥菌絲體100g，其中納他霉素含量為11. 2% (w/w)，加入IL甲醇與水的混合液(甲醇與水的體積比為75 25)，攪拌使菌絲體充分懸浮。用lOmol/L的NaOH 調(diào)節(jié)PH值至11. 35后攪拌1小時(shí)。抽濾分離菌渣，收集濾液，得到黃棕色的納他霉素提取液。濃縮納他霉素的提取液至納他霉素的含量為22. 6mg/ml，并絮凝去除在此過程中析出的不溶物，得到納他霉素的精提取液。隨后一邊攪拌一邊緩慢滴加lOmol/L的HC1，使納他霉素精提取液的PH值逐步降低至8. 65，在pH值不再回升的情況下，再攪拌1小時(shí)。接著繼續(xù)一邊攪拌一邊緩慢滴加lOmol/L的HC1，使納他霉素精提取液的pH值逐步降低到6. 61， 在PH值不再回升的情況下，再攪拌4小時(shí)。之后抽濾結(jié)晶液，得到片狀納他霉素晶體，用 50%乙醇-水溶液洗滌晶體3次后，于50°C、-0. 09MPa條件下真空干燥至恒重，即得到白色微帶淡黃色的片狀納他霉素晶體7. llg，純度92. 1%。將晶體涂在載波片上，用Olympus VANOX-S型顯微鏡在100倍下顯微照相得晶體形貌如圖1所示，晶習(xí)為片狀，較厚，大小均一，沒有包裹雜質(zhì)。實(shí)施例2取納他霉素的干燥菌絲體90g,其中納他霉素含量為12. 1% (w/V),加入IL甲醇與水的混合液(甲醇與水的體積比為60 40)，攪拌使菌絲體充分懸浮。用lOmol/L的NaOH 調(diào)節(jié)PH值至10后攪拌1. 5小時(shí)。抽濾分離菌渣，收集濾液，得到黃棕色的納他霉素提取液。濃縮納他霉素的提取液至納他霉素的含量為18mg/ml，并絮凝去除在此過程中析出的不溶物，得到納他霉素的精提取液。隨后一邊攪拌一邊緩慢滴加lOmol/L的HC1，使納他霉素精提取液的PH值逐步降低至8，在pH值不再回升的情況下，再攪拌1. 5小時(shí)。接著繼續(xù)一邊攪拌一邊緩慢滴加lOmol/L的HC1，使納他霉素精提取液的pH值逐步降低到6，在pH 值不再回升的情況下，再攪拌3小時(shí)。之后抽濾結(jié)晶液，得到片狀納他霉素晶體，用50%乙醇-水溶液洗滌晶體3次后，于50°C、-0. 09MPa條件下真空干燥至恒重，即得到白色微帶淡黃色的片狀納他霉素晶體^g，純度M』％。顯微鏡觀察下的片狀晶體形狀同實(shí)施例1。實(shí)施例3取納他霉素的干燥菌絲體110g，其中納他霉素含量為10.3% (w/V),加入IL甲醇與水的混合液(甲醇與水的體積比為90 10)，攪拌使菌絲體充分懸浮。用lOmol/L的NaOH 調(diào)節(jié)PH值至12后攪拌1小時(shí)。抽濾分離菌渣，收集濾液，得到黃棕色的納他霉素提取液。 濃縮納他霉素的提取液至納他霉素的含量為^mg/ml，并絮凝去除在此過程中析出的不溶物，得到納他霉素的精提取液。隨后一邊攪拌一邊緩慢滴加lOmol/L的HC1，使納他霉素精提取液的PH值逐步降低至9，在pH值不再回升的情況下，再攪拌2小時(shí)。接著繼續(xù)一邊攪拌一邊緩慢滴加lOmol/L的HC1，使納他霉素精提取液的pH值逐步降低到7，在pH值不再回升的情況下，再攪拌5小時(shí)。之后抽濾結(jié)晶液，得到片狀納他霉素晶體，用50%乙醇-水溶液洗滌晶體3次后，于50°C、-0. 09MPa條件下真空干燥至恒重，即得到白色微帶淡黃色的片狀納他霉素晶體7. 27g，純度90. 3%0顯微鏡觀察下的片狀晶體形狀同實(shí)施例1。實(shí)施例4 (對(duì)照組)如同實(shí)施例1的方法，僅將分階段酸化的步驟改為在納他霉素精提取液中直接滴加lOmol/L的HCl調(diào)節(jié)pH值至6. 5。之后抽濾、洗滌晶體后真空干燥至恒重，得到聚結(jié)并包有雜質(zhì)的納他霉素片狀晶體7. 51g，純度85.5%。按實(shí)施例1中顯微鏡照相的方法得到晶體形貌如圖2所示，晶體大小不均一,聚結(jié)并包裹雜質(zhì)，形貌較實(shí)施例1差。通過實(shí)施例1-3與實(shí)施例4的對(duì)比說明納他霉素的結(jié)晶過程中，采用分階段酸化納他霉素精提取液的養(yǎng)晶工藝可以改善片狀晶體的顆粒分布，提高納他霉素晶體的純度。對(duì)比實(shí)驗(yàn)組如實(shí)施例1方法，僅改變甲醇與水的混合溶液中甲醇與水的比例，分組提取菌絲體中的納他霉素，制得的納他霉素晶體的結(jié)晶液的過濾時(shí)間(液固分離)與干燥時(shí)間如表 1所示表1不同比例混合溶液過濾時(shí)間與干燥時(shí)間對(duì)比
權(quán)利要求
1.一種納他霉素片狀晶體的制備方法，其特征在于它包括以下步驟a、取納他霉素菌絲體加入甲醇與水的混合液中；所述的甲醇與水的混合液中，甲醇與水的體積比為60-90 40-10 ；每IL甲醇與水的混合液添加90_110g納他霉素菌絲體；b、用堿性物質(zhì)均勻攪拌調(diào)節(jié)步驟a獲得的溶液的pH值至10-12；c、將步驟b獲得的溶液進(jìn)行液固分離，收集濾液得到納他霉素的提取液；d、濃縮步驟c獲得的納他霉素的提取液至納他霉素含量在18 ^mg/ml之間，并絮凝去除在此過程中析出的不溶物，得到納他霉素精提取液；e、分兩階段酸化步驟d獲得的納他霉素精提取液第一階段一邊攪拌納他霉素精提取液一邊緩慢滴加酸，使納他霉素精提取液的PH值逐步降低到8-9，在pH值不再回升的情況下，再攪拌1小時(shí)以上；第二階段繼續(xù)一邊攪拌納他霉素精提取液一邊緩慢滴加酸，使納他霉素精提取液的PH 值逐步降低到6-7，在pH值不再回升的情況下，再攪拌3小時(shí)以上，得到片狀的納他霉素晶體的結(jié)晶液；f、將步驟e獲得的納他霉素晶體的結(jié)晶液進(jìn)行液固分離，然后真空干燥得到片狀納他霉素晶體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納他霉素片狀晶體的制備方法，其特征在于步驟a所述的納他霉素菌絲體為水分含量< 5%的干燥菌絲體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納他霉素片狀晶體的制備方法，其特征在于步驟a所述的甲醇與水的體積比為73 27，每IL甲醇與水的混合液添加IOOg納他霉素菌絲體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納他霉素片狀晶體的制備方法，其特征在于步驟e中，第一階段，在PH值不再回升的情況下，再攪拌1小時(shí)；第二階段，在pH值不再回升的情況下，再攪拌3-5小時(shí)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種納他霉素片狀晶體的制備方法，它包括以下步驟①取納他霉素菌絲體加入體積比為60-90∶40-10的甲醇與水的混合液中；②用堿性物質(zhì)調(diào)節(jié)pH值至10-12；③液固分離，收集濾液得納他霉素提取液；④濃縮提取液至納他霉素含量在18～26mg/ml之間，絮凝去除不溶物，得納他霉素精提取液；⑤分兩階段酸化納他霉素精提取液先緩慢滴加酸，使pH值降到8-9后再攪拌1小時(shí)以上；接著繼續(xù)緩慢滴加酸，使pH值降到6-7后再攪拌3小時(shí)以上，得片狀的納他霉素晶體的結(jié)晶液；⑥液固分離，真空干燥得片狀納他霉素晶體。本發(fā)明可制得均一的納他霉素片狀晶體，降低后續(xù)晶體洗滌與干燥的難度，縮短晶體的過濾和干燥時(shí)間。
文檔編號(hào)C07H17/08GK102286044SQ20111024248
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月22日
發(fā)明者姜獻(xiàn)民, 李俊輝, 賴潭平 申請(qǐng)人:浦城綠康生化有限公司