固定化生物分子用穩(wěn)定組合物的制作方法

專利名稱：固定化生物分子用穩(wěn)定組合物的制作方法
固定化生物分子用穩(wěn)定組合物本發(fā)明涉及一種組合物在使固定在固體載體上的生物分子穩(wěn)定中的應(yīng)用，所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸，(b)至少兩種不同氨基酸和皂苷，或者(C)至少一種二肽或三肽。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)被穩(wěn)定的生物分子的方法，所述方法包含將生物分子包埋在本發(fā)明的組合物中，并涉及一種生產(chǎn)其上附著有生物分子的固體載體的方法。本發(fā)明還涉及一種通過(guò)本發(fā)明的方法可生產(chǎn)的或者生產(chǎn)出的固體載體，和一種利用本發(fā)明的載體診斷疾病的方法。在本說(shuō)明書(shū)中，引用了包含專利申請(qǐng)和制造商手冊(cè)在內(nèi)的許多文件。這些文件的公開(kāi)內(nèi)容應(yīng)被認(rèn)為與本發(fā)明的專利性無(wú)關(guān)，通過(guò)引用將其整體并入本說(shuō)明書(shū)中。更具體而言，對(duì)所有參考文件通過(guò)弓丨用并入的程度等同于具體且單獨(dú)地指明各份單獨(dú)文件通過(guò)弓I用并入。在診斷和治療應(yīng)用中利用固定化生物分子(例如蛋白，如抗體)時(shí)的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是保留生物分子的活性。然而，由于生物功能分子的化學(xué)、物理或生理學(xué)性質(zhì)通常會(huì)因化合物周圍環(huán)境的變化而顯著改變，因而保留生物分子的活性是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。例如，PH、 離子強(qiáng)度、溫度或存儲(chǔ)的改變會(huì)導(dǎo)致化合物性質(zhì)的可逆或不可逆改變。特別是，受到例如長(zhǎng)期存儲(chǔ)、運(yùn)輸或滅菌程序等逆境的生物分子必須被穩(wěn)定以防止活性喪失。對(duì)于臨床免疫診斷而言，診斷化驗(yàn)中所使用的固定的生物分子的充分穩(wěn)定，是“歐洲體外診斷指南(EU In Vitro Diagnostics Guideline) ”(IVDD 98/79/EC)中所規(guī)定的產(chǎn)品市場(chǎng)準(zhǔn)入所要求的。根據(jù)植入物在人體中的位置，含有固定化生物分子的可植入的醫(yī)療裝置例如會(huì)暴露于多種存在于人體組織中的生物試劑，例如酸、堿和離子等。這些試劑中有一些可以降解裝置的生物分子，導(dǎo)致?lián)p壞甚至裝置失效。因此，含有固定化生物分子制劑的市售載體或裝置含有如糖(例如海藻糖)和/ 或血清蛋白(例如白蛋白)等穩(wěn)定劑，以保護(hù)生物分子使其免于降解(Polifke T.和Rauch P, Laborwelt (2007)第 6 卷，第 1 4 頁(yè))。含有血漿蛋白的穩(wěn)定劑的優(yōu)點(diǎn)在于除其穩(wěn)定作用外，還充當(dāng)防止非特異性結(jié)合的封閉劑。然而，因?yàn)榘椎鞍椎仁侨嘶騽?dòng)物來(lái)源的，所以它們可能含有例如病毒或朊病毒之類的病原體等。因此，必須采用復(fù)雜的成本和時(shí)間密集的凈化方法以除去這些病原體。防止如滅菌或長(zhǎng)期存儲(chǔ)等逆境中對(duì)于固定化生物分子損壞的常規(guī)方法的另一缺點(diǎn)在于，這些方法要求將所述生物分子冷凍(US 5, 730,933 ；Cleland J. L.等，Journal of Pharmaceutical Sciences (2001)，第 90 卷，第 3 號(hào)，第 310 321 頁(yè))。例如，US 5，730，933 公開(kāi)了一種用于對(duì)抗體滅菌的方法，這些抗體的活性可以通過(guò)在滅菌過(guò)程中冷凍它們而得到保留。然而，冷凍會(huì)導(dǎo)致生物分子的構(gòu)象改變，這會(huì)影響它們的生物功能，并且冷凍構(gòu)成固定化生物分子的制備中的另一步驟，導(dǎo)致成本增加。此外，穩(wěn)定組合物含有動(dòng)物來(lái)源的血清蛋白如白蛋白等，因此具有將于其中溫育的生物分子污染的風(fēng)險(xiǎn)。因此，需要穩(wěn)定和保護(hù)在治療和診斷中所使用的固定化生物分子的改進(jìn)的方法和要素。因此，本發(fā)明的目的是提供可以避免現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)的穩(wěn)定生物分子的方法和要素。
因此，本發(fā)明涉及一種包含至少兩種不同氨基酸的組合物在使固體載體上固定的生物分子穩(wěn)定中的應(yīng)用。具體而言，本發(fā)明涉及一種組合物在使固體載體上的生物分子穩(wěn)定方面的應(yīng)用， 所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸，(b)至少兩種不同氨基酸和一種皂苷，和/或 (C)至少一種二肽。取決于預(yù)期的應(yīng)用或狀態(tài)，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物可以是液體或固體。如下所述的本發(fā)明的包被和/或包埋附著于載體的生物分子的組合物通常是固體，而在如下所述的本發(fā)明的載體的生產(chǎn)方法中組合物通常是液體。在除去組合物的液體部分和/或干燥后，如下所述的本發(fā)明的包被和/或包埋附著于載體的生物分子的組合物又成為固體。如果組合物是液體，則其優(yōu)選為水性的。氨基酸被定義為具有羧基和氨基官能團(tuán)的有機(jī)分子。它們是蛋白的基本構(gòu)建單元。關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指游離氨基酸，它們未彼此結(jié)合形成寡聚物或聚合物，如二肽、三肽、寡肽或蛋白。穩(wěn)定組合物中所含的氨基酸可以選自天然氨基酸和人工氨基酸或其衍生物。天然氨基酸是例如20種構(gòu)成蛋白的氨基酸甘氨酸、脯氨酸、精氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸(關(guān)于本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“天冬氨酸”和“谷氨酸”也包括這些氨基酸的鹽)、谷氨酰胺、半胱氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、纈氨酸、酪氨酸、蘇氨酸和色氨酸。其他天然氨基酸是例如肉堿、鳥(niǎo)氨酸、羥脯氨酸、高半胱氨酸、瓜氨酸、羥賴氨酸或β-丙氨酸。氨基酸衍生物為例如η-乙?；?色氨酸、膦?；z氨酸、膦?；K氨酸、膦?；野彼?、麥拉寧(melanin)、精氨琥珀酸及其鹽或D0PA。人工氨基酸是具有不同側(cè)鏈長(zhǎng)度和/ 或側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和/或在不同于α "C原子的位置具有氨基的氨基酸。本發(fā)明的上下文中的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定”涉及根據(jù)本發(fā)明使用的組合物所引起的任何下述作用(固定化)生物分子的結(jié)構(gòu)和/或活性的穩(wěn)定、生物分子儲(chǔ)存期的延長(zhǎng)和/或生物分子抵抗逆境的保護(hù)。這將使生物分子的生物活性得到極大程度的保留。關(guān)于本發(fā)明使用并可與術(shù)語(yǔ)“應(yīng)激損傷”互換使用的術(shù)語(yǔ)“逆境”是指引起生物分子活性喪失的任何環(huán)境影響。示例性逆境因素是熱、干旱或輻射，如通過(guò)下述滅菌方法而引起的輻射等。另一種逆境因素是化學(xué)環(huán)境。例如，用于滅菌的環(huán)氧乙烷等氣體會(huì)促進(jìn)生物分子活性的喪失。術(shù)語(yǔ)“生物活性”是指生物分子的天然活性。生物活性取決于具體分子，并包括對(duì)于其他(生物)分子的親合力或催化活性。例如，抗體的生物活性需要與其抗原的特異性結(jié)合。核酸探針的生物活性例如需要其和與其互補(bǔ)的核酸靶特異性地雜交的能力。關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語(yǔ)“極大程度的保留”是指，使已暴露于逆境的(固定化)生物分子的生物活性與未暴露于逆境的(固定化)生物分子相比保留至少50%，更優(yōu)選至少60%，更優(yōu)選至少70%， 最優(yōu)選至少80%。術(shù)語(yǔ)“生物分子”描述了可由活體產(chǎn)生或由活體產(chǎn)生的任何有機(jī)分子，包括優(yōu)選生物可降解性聚合分子如蛋白或肽、糖類和核酸，以及小分子，如初級(jí)代謝物、次級(jí)代謝物和天然產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“生物分子”不僅包含從活體中分離的天然分子，還包含通過(guò)合成、半合成或重組而產(chǎn)生的天然或人造分子。人造分子例如為由天然分子衍生的引入了變化的那些分子。除屬于上述種類的那些分子之外的生物可降解性聚合分子有木質(zhì)素和多羥基脂肪酸酯 (polyhydroxylalcanoates)(天然聚合物)和聚亞烷基酯(polyalcylene ester)、聚乳酸及其共聚物、聚酰胺酯、聚乙烯酯、聚乙烯醇和聚酐(人造聚合物)。優(yōu)選的生物分子發(fā)揮與藥物、診斷和/或科學(xué)應(yīng)用有關(guān)的性質(zhì)。換言之，適用于本發(fā)明的生物分子優(yōu)選發(fā)揮以下生物活性，所述生物活性使它們優(yōu)選可用作或適合用作藥物活性劑、診斷試劑和/或研究工具。 對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以理解的是，本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“生物分子”也包括包含在如真核或原核細(xì)胞、組織、病毒及其片段(例如細(xì)胞器官、膜或衣殼)等結(jié)構(gòu)之中或之上的如上所述的生物分子。在本發(fā)明的該實(shí)施方式中，生物分子可以以分離的形式或者以包含在所述真核或原核細(xì)胞、組織、病毒或其片段之中或之上的形式附著于固體載體。 作為另外一種選擇，包含生物分子(優(yōu)選在其表面上包含生物分子)的結(jié)構(gòu)體可以充當(dāng)本發(fā)明的載體。 可與此處所使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白”互換使用的術(shù)語(yǔ)“多肽”描述的是一類分子，其包含一類由超過(guò)30個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽。與其相反的是，由至多30個(gè)氨基酸構(gòu)成的分子被稱為“肽”。同樣，根據(jù)該定義，術(shù)語(yǔ)“肽”描述的是長(zhǎng)度為30個(gè)氨基酸以下的蛋白的片段。 多肽或肽還可以形成二聚體、三聚體和更高級(jí)的低聚物，即由超過(guò)一個(gè)多肽或肽分子構(gòu)成。 形成這種二聚體、三聚體等的多肽或肽分子可以是相同的，也可以是不同的。相應(yīng)的高階結(jié)構(gòu)體因此而稱作同源或異源二聚體、同源或異源三聚體等。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“蛋白”和“肽”也指天然修飾的多肽/蛋白和肽，其中所述修飾例如通過(guò)糖基化、乙?；土姿峄冗M(jìn)行。所述修飾在本領(lǐng)域中是公知的。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“核酸”或“核酸分子”包括如cDNA或基因組DNA等DNA，和如反義RNA或siRNA等RNA。還包含的是本領(lǐng)域已知的核酸模擬分子，如DNA或RNA的合成或半合成衍生物和混合的聚合物。所述核酸模擬分子或核酸衍生物包含硫代膦酸酯核酸 (phosphorothioate nucleic acid)、氨基憐酸酉旨核酸(phosphoramidate nucleic acid)、 2’-0-甲氧基乙基核糖核酸、嗎啉代核酸、己糖醇核酸(HNA)、鎖核酸(LNA)和肽核酸(PNA) (參見(jiàn)Braasch和Corey，Chem Biol 2001，8:1)。LNA是其中核糖環(huán)受到2，-氧和4，-碳之間的亞甲基鍵的約束的RNA衍生物。如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解的那樣，核酸分子可以含有另外的非天然或衍生的核苷酸堿基。核酸分子還包括核酶、適體、質(zhì)粒和染色體。本發(fā)明的核酸分子可以以分離的形式或者以與其他生物分子(如蛋白等，例如組蛋白或核糖體的蛋白)復(fù)合的形式使用。術(shù)語(yǔ)“糖類”是指作為具有多羥基的醛或酮的有機(jī)化合物，通常在每個(gè)不作為醛或酮官能團(tuán)的一部分的碳原子上附加有一個(gè)羥基。根據(jù)分子的長(zhǎng)度，糖類被稱為單糖、寡糖或多糖。糖類一旦與非糖類分子結(jié)合，所獲得的分子即被稱作糖苷。經(jīng)修飾的糖類具有例如 N-乙酰酯、羧基或硫酸酯測(cè)量，并可含有葡萄糖醛酸、艾杜糖醛酸、半乳糖胺、葡萄糖胺。優(yōu)選的生物分子為蛋白、肽、核酸及其衍生物、糖類及其衍生物以及脂質(zhì)和脂肪酸、多元醇及其組合或修飾物。蛋白的實(shí)例為抗體或其保留有其結(jié)合特異性的片段、酶、受體、膜蛋白(可選的是不具有其跨膜域)、生長(zhǎng)因子、白蛋白、球蛋白、細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、 凝血因子和蛋白激素。示例性糖類為支鏈淀粉、糖原、淀粉、α-和葡聚糖、右旋糖苷和糖胺聚糖，如透明質(zhì)酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素及其衍生物如糖苷。
特別優(yōu)選的蛋白是抗體或其保留有結(jié)合特異性的片段。適用于本發(fā)明的抗體可以是例如多克隆抗體或單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)“抗體”也包含依然保留有其結(jié)合特異性的抗體的衍生物。抗體的片段包含但不限于Fab片段、F(ab' )2或？￥片段。生產(chǎn)抗體及其片段的技術(shù)在本領(lǐng)域中是公知的，并描述于例如Harlow和Lane的“Antibodies，A Laboratory Manual，，(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988)禾口 Harlow 禾口 Lane 的“Using Antibodies :A Laboratory Manual，，(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1998)中。 這些抗體例如可以用于所關(guān)注的分子的免疫沉淀反應(yīng)或者用于從患者體液中除去不想要的分子。術(shù)語(yǔ)“抗體”也包括如合成的、嵌合的、單鏈的和人源化的抗體或其仍保留有其結(jié)合特異性的衍生物或片段等實(shí)施方式?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的各種程序來(lái)生產(chǎn)所述抗體和/或片段。此外，為生產(chǎn)單鏈抗體而描述的技術(shù)適于生產(chǎn)特異性地結(jié)合于所關(guān)注的分子或其片段的單鏈抗體。此外，可使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)人源化抗體。最優(yōu)選的是，抗體是單克隆抗體。對(duì)于單克隆抗體的制備，可以使用任何提供通過(guò)連續(xù)細(xì)胞系溫育產(chǎn)生的抗體的方法。這種技術(shù)的實(shí)例包括雜交瘤技術(shù)(:K0hler和Milstein Nature 256 (1975)，495-497)、 三源雜交瘤技術(shù)、人類B-細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor，Immunology Today 4(1983),72)和 EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole 等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. (1985),77-96)來(lái)產(chǎn)生人類單克隆抗體?？梢允褂萌鏐IAcore系統(tǒng)中所采用的表面等離子體共振來(lái)提高與所關(guān)注的生物分子的表位結(jié)合的噬菌體抗體的功效(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996),97-105 ；Malmborg, J. Immunol.Methods 183(1995), 7-13)。根據(jù)本發(fā)明的上下文，術(shù)語(yǔ)“抗體”還包含可以在細(xì)胞中表達(dá)的抗體構(gòu)建體，例如可通過(guò)例如病毒或質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體構(gòu)建體。一旦獲得抗體或其片段，抗體自身或?yàn)槠渚幋a的DNA可以進(jìn)行測(cè)序以提供用于小或大規(guī)模地重組產(chǎn)生抗體或其片段的信息。生產(chǎn)重組抗體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知道的。如本領(lǐng)域中所公知的，抗體或其衍生物或片段還可以化學(xué)修飾?？贵w可以是任何種類的抗體。最優(yōu)選的是，抗體是單克隆抗體，并屬于IgG、IgM或 IgY類。IgY抗體表示IgG抗體在雞中的類似物?？膳c術(shù)語(yǔ)“附著的”或“附著”互換使用的術(shù)語(yǔ)“固定化”或“固定”涉及生物分子在載體上的固著。所述固定或附著或固著可以是不可逆的，也可以是可逆的。固著可以是載體的材料與生物分子之間所形成的共價(jià)或非共價(jià)鍵造成的。示例性非共價(jià)相互作用包括引起吸附的那些作用。生物分子對(duì)于載體的固著可以通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何技術(shù)來(lái)進(jìn)行(參見(jiàn)例如 Hermanson，G. Τ. ，Bioconjugate Technique (2008)，第 2 版)固著可以例如通過(guò)生物分子與固體載體的直接結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。作為另外一種選擇， 固著可以通過(guò)間接結(jié)合實(shí)現(xiàn)，所述間接結(jié)合通過(guò)包被固體載體的如隔離和連接分子等第三化合物(例如，硅烷或如生物素、抗生物素蛋白或鏈親和素等蛋白)來(lái)進(jìn)行。在整個(gè)本發(fā)明中使用的術(shù)語(yǔ)“包被”包含對(duì)固體載體的完全包被和部分包被。在這兩種供選方案中，結(jié)合可以是通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)鍵的結(jié)合。共價(jià)鍵可以例如通過(guò)生物分子與載體材料之間的或者隔離/連接分子與生物分子之間的化學(xué)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。非共價(jià)結(jié)合的實(shí)例包含弱鍵，如范德華鍵或其他極性鍵。所述非共價(jià)鍵出現(xiàn)在例如多肽或肽與具有聚乙烯表面的固體載體之間。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，生物分子可逆地附著在所述固體載體上。術(shù)語(yǔ)“可逆地附著”限定了當(dāng)生物分子附著于載體時(shí)可以通過(guò)適當(dāng)要素從所述載體上釋放下來(lái)。根據(jù)附著的種類(例如附著是否為共價(jià)或非共價(jià))，可以采用不同的釋放生物分子的要素。實(shí)例是通過(guò)蛋白酶切割(在蛋白作為生物分子的情況下)、改變PH或改變溫度。生物分子附著于載體，直至到了需要的時(shí)候并且只有在那時(shí)才從載體上釋放下來(lái)。上述技術(shù)只是將生物分子固定或可逆地附著在固體載體上的實(shí)例。但是，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明并不限于這些實(shí)例。相反，可以采用現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何常用方法來(lái)將生物分子固定或可逆地附著在固體載體上。選擇生物分子的可逆附著，從而使生物分子能夠從載體上迅速釋放下來(lái)。關(guān)于這一點(diǎn)，術(shù)語(yǔ)“迅速”是指超過(guò)50 %、如60 %、70 %或80 %的所述生物分子可以在2小時(shí)以內(nèi)、 如在1小時(shí)、30分鐘或20分鐘內(nèi)釋放，其可以為任意組合，如60%在30分鐘或20分鐘釋放、70%在30分鐘或20分鐘釋放或者80%在30分鐘或20分鐘釋放、優(yōu)選超過(guò)85%在10 分鐘以下釋放、最優(yōu)選超過(guò)98%在1分鐘內(nèi)釋放。這可以通過(guò)例如應(yīng)用下述方法之一來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，選擇生物分子的可逆附著，優(yōu)選使在臨床應(yīng)用之前立時(shí)釋放生物分子。可逆附著與不可逆附著相似，可以是共價(jià)的或非共價(jià)的。優(yōu)選的是，非共價(jià)鍵是具有高親合力和特異性的非共價(jià)鍵。所述非共價(jià)鍵的實(shí)例是鏈親和素-生物素或抗生物素蛋白-生物素系統(tǒng)形成的那些非共價(jià)鍵。在此實(shí)例中，鏈親和素/抗生物素蛋白共價(jià)偶聯(lián)于適當(dāng)?shù)妮d體。然后生物素化的生物分子非共價(jià)但具有高親合力地結(jié)合于鏈親和素/抗生物素蛋白。通過(guò)添加過(guò)量的生物素，結(jié)合得到競(jìng)爭(zhēng)性的抑制，并且生物素化的生物分子得到釋放。生物分子可以通過(guò)連接體、優(yōu)選可切割的連接體而連接。適當(dāng)?shù)倪B接體可以選自但不限于a)具有二硫橋的連接體如SDAD(NHS-SS_雙吖丙啶)、SulfoSAND、DSP，其可以通過(guò)添加具有-SH基團(tuán)的試劑如硫醇(thiols，mercaptanes)、半胱氨酸、巰基乙醇或二硫蘇糖醇而被輕易切割，b)具有肽鍵的連接體，其可使用特定蛋白酶、優(yōu)選人的酶切割，c)可以通過(guò)超聲切割的連接體，d)具有酯鍵的連接體，如EGS，可由例如羥胺切割，e)具有砜的連接體，如BS0C0ES，可在ph較高(例如pH 11. 6)時(shí)被切割f)具有順式二醇的連接體，如DST，可由偏高碘酸鈉切割。作為另外一種選擇，生物分子可以通過(guò)如上所述的干燥而可逆地附著，在下文中將結(jié)合本發(fā)明的方法對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)描述。在該實(shí)施方式中，可逆附著以下述方式實(shí)現(xiàn)生物分子和用作穩(wěn)定劑的分子(即，氨基酸，可選地結(jié)合皂苷和/或可選地結(jié)合與至少一個(gè)如上所述的二肽和/或三肽)和固體載體在干燥后粘附在一起。生物分子的釋放于對(duì)上述化合物添加液體時(shí)發(fā)生，由此將生物分子和穩(wěn)定分子從載體上溶解/溶液化下來(lái)。在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)“固體載體”定義了固體材料的載體。載體的材料可以是致密或多孔結(jié)構(gòu)。如下文中所述，優(yōu)選的是，載體材料是選自由玻璃、醫(yī)用級(jí)不銹鋼、金屬合金(例如鉻鈷鉬、氮氧化鈦)、羥磷灰石、聚硅氧烷、聚苯乙烯、聚-L-乳酸；聚氨酯、聚酯、 聚砜、聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸(polyacryl)、聚丙烯腈、聚酰胺、PMMA、毛織填塞物(fleecewadding)、開(kāi)孔泡沫塑料或玻璃和網(wǎng)狀塑料或玻璃和衍生自于海綿(海綿動(dòng)物)的結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的過(guò)程中，驚訝地發(fā)現(xiàn)了可以通過(guò)應(yīng)用下述組合物而使固定在固體載體上的生物分子穩(wěn)定，所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸、(b)至少兩種不同氨基酸和皂苷或(c)至少一種二肽。該組合物包被或包埋生物分子并保護(hù)其免受不利影響。與術(shù)語(yǔ) “包被”類似，在整個(gè)本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“包埋”包括由根據(jù)本發(fā)明使用的組合物部分或完全包埋生物分子。如所附實(shí)施例中所示，由根據(jù)本發(fā)明使用的組合物包被或者包埋的固定化生物分子在抗逆境(如老化或滅菌等)方面顯示了顯著的提高，同時(shí)基本上保留了其生物活性。本發(fā)明的穩(wěn)定組合物的主要優(yōu)點(diǎn)在于，氨基酸而不是血清蛋白(如白蛋白)被用作穩(wěn)定劑。不像人或動(dòng)物來(lái)源的血清蛋白，根據(jù)本發(fā)明使用的穩(wěn)定組合物的氨基酸可以合成產(chǎn)生。因此，可以降低或者避免受到如病毒或朊病毒等病原體污染的風(fēng)險(xiǎn)。除了對(duì)于生物分子的保護(hù)效果之外，穩(wěn)定組合物還被發(fā)現(xiàn)具有下述附加作用，即， 封閉其上附著有生物分子的固體載體上的自由結(jié)合位。此外，如所附實(shí)施例中確認(rèn)的那樣，根據(jù)本發(fā)明使用的穩(wěn)定組合物是普遍適用的 其適于保護(hù)不同的分子，如抗體(例如IgM、IgG)、酶(例如DNAse)或核酸。本發(fā)明的穩(wěn)定生物分子的方法還具有下述優(yōu)點(diǎn)，即，與常規(guī)穩(wěn)定方法不同，其不需要冷凍生物分子。由此可以避免冷凍過(guò)程中出現(xiàn)的構(gòu)想變化。因此，本發(fā)明的冷凍方法特別適于不穩(wěn)定或易變化的生物分子，如抗體，特別是IgM分子的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。還驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在本發(fā)明的穩(wěn)定組合物中溫育如抗體等生物分子，這些生物分子發(fā)揮其生物活性的能力(例如在抗體的情況中，為結(jié)合其抗原的能力)在通過(guò)利用 25kGy的輻射滅菌時(shí)與未處理的對(duì)照組相比可以保留至少65%。S卩，使用本發(fā)明的穩(wěn)定組合物，在利用25kGy輻射時(shí)，與常規(guī)穩(wěn)定劑(例如公開(kāi)于 US 5，730，9333中的常規(guī)穩(wěn)定劑)相比，可以實(shí)現(xiàn)包埋的生物分子保留的功能性的顯著增加。根據(jù)本發(fā)明使用的組合物優(yōu)選不含有蛋白或非氨基酸、二肽和/或三肽的蛋白的片段。因此，在本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物不含有蛋白或由超過(guò)三種氨基酸構(gòu)成的蛋白片段，也不含有人源或動(dòng)物源的水解蛋白。所述組合物具有下述優(yōu)點(diǎn)，即，不存在污染其中包埋的生物分子的風(fēng)險(xiǎn)。其還是已知穩(wěn)定組合物的具有成本效益的替代選擇。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，穩(wěn)定組合物包含2 18種不同氨基酸、更優(yōu)選 2 10種、進(jìn)而更優(yōu)選2 8種并且最優(yōu)選2 5種或5 8種不同氨基酸。作為另外一種選擇，組合物包含至少2種、至少3種、至少4種、至少5種、至少6種、至少7種或至少8 種以上不同氨基酸，如至少9種、至少10種、至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、 至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種或至少20種不同氨基酸。包含在組合物中的不同種氨基酸的數(shù)量?jī)?yōu)選不超過(guò)18。從所附實(shí)施例中顯而易見(jiàn)的是，當(dāng)用于使固定化生物分子穩(wěn)定時(shí)，本發(fā)明的組合物在存在兩種或三種不同氨基酸時(shí)就已能發(fā)揮其有益效果。該效果然后會(huì)逐漸加強(qiáng)，并在穩(wěn)定組合物中存在5 8種不同氨基酸時(shí)達(dá)到最大效果。根據(jù)用于測(cè)試穩(wěn)定效果的程序， 在存在5種不同氨基酸(例如對(duì)于增強(qiáng)的老化)或在存在8種不同氨基酸(例如對(duì)于滅菌)時(shí)達(dá)到最大效果。有益效果不會(huì)或者基本不會(huì)隨著向根據(jù)本發(fā)明使用的穩(wěn)定組合物中添加另外的不同的氨基酸而降低，但優(yōu)選得到保留。因此，包含至少9種、至少10種、至少 11種、如至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、 至少19種或至少20種不同氨基酸的組合物也可以用于使固定化生物分子穩(wěn)定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物包含至少4或至少5種氨基酸。從實(shí)施例中顯而易見(jiàn)的是，當(dāng)包含至少4或至少5種氨基酸時(shí)，本發(fā)明的組合物對(duì)于固定在固體載體上的生物分子的穩(wěn)定性具有更加有利的作用。根據(jù)氨基酸的組合，逆境暴露后保留的生物活性可達(dá)87%。在一個(gè)更加優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物包含以下每組中的至少一種氨基酸(a) 具有非極性脂肪族R基團(tuán)的氨基酸；(b)具有極性不帶電荷的R基團(tuán)的氨基酸；(c)具有帶正電荷的R基團(tuán)的氨基酸；(d)具有帶負(fù)電荷的R基團(tuán)的氨基酸；和(e)具有芳香族R基團(tuán)
的氨基酸。天然氨基酸可以歸類于上述特征組中(Nelson D. L. & Cox Μ. Μ.，‘ Lehninger Biochemie' (2005)，pp. 122-127)，其中從每組中選擇至少一種氨基酸用于本發(fā)明的組合物。天然氨基酸以外的其他氨基酸，如人造氨基酸等，也可以進(jìn)行相應(yīng)分類。盡管本發(fā)明的組合物中可以包含上述每組中的超過(guò)一種氨基酸，如至少兩種或至少三種氨基酸，但是目前優(yōu)選的是從每組中只選擇一種氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)理解，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物中存在的每組的氨基酸數(shù)量不必相同。相反，可以選擇氨基酸的任何組合，只要每組中的至少一種氨基酸存在即可。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物在至少兩種或至少三種氨基酸的混合物中包含低于1干重％、優(yōu)選低于0. 5干重％的半胱氨酸。這也適用于包含至少4種、至少5種、至少 6種、至少7種、至少8種至少9種或至少10種以上不同氨基酸，如至少11種、至少12種、 至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19種或至少20 種不同氨基酸的組合物。由于半胱氨酸中包含SH基團(tuán)，因此包含半胱氨酸的組合物可以在例如SH基團(tuán)處發(fā)生氧化，引起令人不愉快的氣味和/或可能使組合物顏色改變?yōu)樽厣涤?。為最小化這些不合需要的作用，特別是在將組合物結(jié)合醫(yī)療裝置使用時(shí)，應(yīng)該使組合物中包含的半胱氨酸的量如上所述地降低。然而，即使這些作用不合需要，它們也不會(huì)影響包含較高百分比半胱氨酸(相反其導(dǎo)致棕色或發(fā)出令人不愉快的氣味)的本發(fā)明的組合物的適合性。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，包含在組合物中的氨基酸為丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸。盡管在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含超過(guò)上述5種氨基酸，但在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物中不包含除丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸之外的其他氨基酸。在一個(gè)替代性優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物中包含的氨基酸為天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸。與上面類似，盡管在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含超過(guò)上述5種氨基酸，但在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物中不包含除天冬氨酸酯、精氨酸、 苯丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸之外的其他氨基酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物中包含的氨基酸為脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、 天冬氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸；或酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和纈氨酸；或精氨酸、 甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和色氨酸。最后一種氨基酸組合，即精氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸和色氨酸，已經(jīng)顯示了其在滅菌、特別是輻射后的性質(zhì)是特別有利的。所述氨基酸組合顯示了未發(fā)出任何令人不愉快的氣味或在輻射后變色。同樣，盡管在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含超過(guò)5、6或7種氨基酸，但在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，組合物中除該優(yōu)選實(shí)施方式中所列組合的氨基酸之外不包含其他氨基酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物還包含低于1%、更優(yōu)選低于0.3%的吐溫 (Tween)、優(yōu)選吐溫80。吐溫是用于聚山梨醇酯的通稱，其為在某些藥物和食品制劑中所使用的一類乳化劑和表面活性劑。它們通常用于使油性成分溶于水基產(chǎn)品中。聚山梨醇酯是源于被脂肪酸酯化的PEG化山梨聚糖(山梨糖醇的一種衍生物)的油性液體。聚山梨醇酯的實(shí)例為聚山梨醇酯20((吐溫20或聚氧乙烯00)山梨聚糖單月桂酸酯)、聚山梨醇酯40 (吐溫40或聚氧乙烯00)山梨聚糖單棕櫚酸酯)、聚山梨醇酯60(吐溫60或聚氧乙烯00)山梨聚糖單硬脂酸酯)和聚山梨醇酯80(吐溫80或聚氧乙烯00)山梨聚糖單油酸酯)。吐溫80在本發(fā)明所使用的組合物中是最優(yōu)選的。在本發(fā)明過(guò)程中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，添加低于(優(yōu)選相對(duì)于生物分子和氨基酸的干重低于)的吐溫可避免在處理本發(fā)明的液體組合物的過(guò)程中發(fā)泡。如上所述，本發(fā)明還涉及一種包含至少一種二肽和/或三肽的組合物用于穩(wěn)定固定在固體載體上的生物分子的應(yīng)用。適用時(shí)，以上給出的定義和如上所述的優(yōu)選實(shí)施方式經(jīng)過(guò)必要變更可應(yīng)用于本發(fā)明的該實(shí)施方式。因此，組合物可以由至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種或至少十種不同二肽和/或三肽構(gòu)成。示例性二肽為甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln，與單獨(dú)的谷氨酰胺相比顯示了增強(qiáng)的穩(wěn)定性)、甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr)、丙氨酰谷氨酰胺(Ala-Gln，后二種與單獨(dú)的酪氨酸相比顯示了增強(qiáng)的水溶性)和雙甘氨肽。其他天然二肽為肌肽((β_丙氨酰-L-組氨酸)、 鵝肌肽(β-丙氨酰-N-甲基組氨酸)、高鵝肌肽(N-(4-氨基丁酰)-L-組氨酸)、京都酚 (L-酪氨酰-L-精氨酸)、鯨肌肽(Balenine)(或蛇肉肽)(β -丙氨酰_Ν τ -甲基組氨酸)、 格里肽(Glorin) (N-丙酰-γ -L-谷?；?L-鳥(niǎo)氨酸-δ -Iac乙酯)和巴蒂肽(Barettin) (環(huán)-[(6-溴-8-en-色氨酸)-精氨酸])。其他人造二肽為阿斯巴甜(N-L_a-天冬氨酰-L-苯丙氨酸1-甲酯)和偽脯氨酸。示例性三肽為谷胱甘肽(Y-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸)及其類似物眼晶體酸(L-Y-谷氨酰-L-α-氨基丁酰-甘氨酸)和正眼酸 (y-谷氨酰-丙氨酰-甘氨酸)。其他三肽為異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸(IPP)、甘脯谷肽 (Glypromate)(甘氨酸-脯氨酸-谷氨酸)、促甲狀腺素釋放激素(TRH、促甲狀腺素釋放素或普羅瑞林)(L-焦谷氨酰-L-組氨酸基-L-脯氨酰胺)、促黑激素抑制素(脯氨酰-亮氨酰-甘氨酰胺)、亮抑蛋白酶肽(N-乙?；?L-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰胺)和愛(ài)森肽 (pGlu-Gln-Ala-OH)。優(yōu)選的是，用作穩(wěn)定劑的至少一種三肽、更優(yōu)選的是所有三肽在聯(lián)系本發(fā)明的醫(yī)療應(yīng)用(參見(jiàn)下文)而使用時(shí)不發(fā)揮任何藥理性質(zhì)。本發(fā)明的該實(shí)施方式的組合物優(yōu)選不含有蛋白或非氨基酸、二肽或三肽的蛋白的片段。因此，在本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物不含有蛋白或其由超過(guò)三種氨基酸構(gòu)成的片段。相反，該實(shí)施方式的組合物優(yōu)選還包含至少一種氨基酸、優(yōu)選至少兩種、更優(yōu)選至少三種、進(jìn)而更優(yōu)選至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種以上不同氨基酸，如至少十一種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18種、至少19 種或至少20種不同氨基酸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明使用的組合物包含皂苷。皂苷是一類形成次級(jí)代謝物的化合物，其見(jiàn)于天然來(lái)源、衍生自天然來(lái)源或可化學(xué)合成。皂苷在各種植物物種中特別豐富。皂苷是兩性苷，其可根據(jù)在水性溶液中震蕩時(shí)產(chǎn)生的皂類泡沫按現(xiàn)象分類，也可以根據(jù)其與親脂性三萜烯衍生物結(jié)合的一個(gè)以上親水苷部分的組成按結(jié)構(gòu)分類。皂苷的實(shí)例為甘草酸、甘草次酸、葡萄糖醛酸、七葉樹(shù)皂角素、常春藤苷和毛地黃皂苷。優(yōu)選的是，用作穩(wěn)定劑的皂苷在聯(lián)系本發(fā)明的醫(yī)療應(yīng)用(參見(jiàn)下文) 而使用時(shí)不發(fā)揮任何藥理性質(zhì)。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，皂苷包含在包含任意數(shù)量不同氨基酸的組合物中 (所述氨基酸包含在上述最低數(shù)量的氨基酸名單中)，例如所述組合物包含至少3種、至少4 種、至少5種、至少6種、至少7種、至少8種、至少9種或至少10種以上不同氨基酸，例如至少11種、至少12種、至少13種、至少14種、至少15種、至少16種、至少17種、至少18 種、至少19種或至少20種不同氨基酸。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，皂苷為甘草酸(glycyrrhizic acid，亦作 glycyrrhicic acid)，其也稱作甘草甜素或甘草甜酸(glycyrrhizinic acid)，或者其衍生物。甘草酸的衍生物是本領(lǐng)域公知的，包括通過(guò)甘草酸在羧基和羥基上的轉(zhuǎn)化、通過(guò)將氨基酸殘基偶聯(lián)至糖類部分中或者將2-乙酰氨基-β -D-吡喃葡萄糖胺引入甘草酸的苷鏈中而產(chǎn)生的那些衍生物。其他衍生物為甘草酸的酰胺、具有兩個(gè)氨基酸殘基以及游離的30-C00H官能團(tuán)的甘草酸共軛物和至少一個(gè)氨基酸烷基酯在甘草酸分子的糖類部分中的共軛物。具體衍生物的實(shí)例可見(jiàn)于例如Kondratenko等的文獻(xiàn)(Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol 30(2), (2004)，pp.148-153)。在本發(fā)明過(guò)程中已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，與使用僅包含氨基酸的組合物作為穩(wěn)定劑相比，在向上述組合物中添加甘草酸時(shí)，生物分子保留有更多的其生物活性。關(guān)于這一點(diǎn)，特別值得注意的是，甘草酸單獨(dú)對(duì)于固定化生物分子并不發(fā)揮任何穩(wěn)定或保護(hù)效果。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，穩(wěn)定組合物還包含多元醇、優(yōu)選糖或糖醇，其選自木糖、甘露糖、葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖、葡聚糖、甘露醇、山梨醇或肌在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，組合物的液體實(shí)施方式優(yōu)選是緩沖的、優(yōu)選是水性的溶液，但也可以是水或非緩沖的優(yōu)選水性的鹽溶液。除其他因素之外，所使用的緩沖劑取決于所要包被/包埋的生物分子。通常適于與生物分子接觸的緩沖劑例如為磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、乳酸鹽、銨、甘氨酸、巴比妥酸鹽、HEPES、MOPS、MES、TRIS。示例性適于抗體的緩沖劑將在下文中進(jìn)一步描述。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及穩(wěn)定生物分子或產(chǎn)生被穩(wěn)定的生物分子的方法，所述方法包含(a)將所述生物分子附著于固體載體，和(b)將所述生物分子包埋在本發(fā)明的組合物中?？赡艿墓潭ǚ绞揭言谏衔拿枋觯⑶铱梢詰?yīng)用于本方法中。優(yōu)選的是，在步驟b)中，生物分子被部分或完全包被或包埋在組合物中。包埋的詳細(xì)程序?qū)⒃谙挛闹薪Y(jié)合生產(chǎn)固體載體的本發(fā)明的方法、特別是其步驟(b)但可選的也可以是步驟(c)、(d)和/或(e)進(jìn)一步描述。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)其上附著有生物分子的固體載體的方法，所述方法包含以下步驟(a)將生物分子附著于固體載體；和(b)將步驟(a)的載體在本發(fā)明所述的組合物中溫育。與生物分子相關(guān)的術(shù)語(yǔ)“附著”和“固定”已被定義，程序的詳細(xì)情況在上文中也已進(jìn)行描述。所述定義和描述可同樣適用于本發(fā)明的方法和下文所描述的其他實(shí)施方式。 特別是，如上所述生物分子的附著可以是可逆或不可逆的。術(shù)語(yǔ)“溫育”指在使步驟(a)中所述的化合物附著于載體并使步驟(a)的附著于固體載體的生物分子包埋在步驟(b)所述的穩(wěn)定組合物中的條件下的溫育。在該實(shí)施方式中，用于溫育固體載體的組合物為液體，并優(yōu)選為水性溶液。組合物最初可以是固體組合物。在該實(shí)施方式中，最初的固體組合物被溶解在優(yōu)選為水性的介質(zhì)中，由此包含在優(yōu)選為水性的溶液中。因此，在生物分子上和/或周圍形成了后涂層，其通過(guò)減小生物分子可及面和通過(guò)聯(lián)合生物分子三級(jí)結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)域，與其他因素一起穩(wěn)定生物分子。盡管組合物在應(yīng)用于生物分子時(shí)是液體，但是其之后脫水，獲得包埋或包被生物分子的固體組合物。在步驟b) 中生物分子可以部分或完全包埋在組合物中。技術(shù)人員會(huì)理解，溫育條件需要適合附著在固體載體上的生物分子。溫育條件包括根據(jù)步驟和溫度將溫育進(jìn)行20分鐘 12小時(shí)的那些條件。例如，抗體可以在37°C溫育1小時(shí)，該溫度是IgM抗體穩(wěn)定的最高溫度。IgG抗體可以在高達(dá)50°C 溫育。根據(jù)步驟和溫育時(shí)間，溫度范圍可以為4°C 50°C，優(yōu)選20°C 37°C。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(b)中的溫育在室溫進(jìn)行1小時(shí)。應(yīng)當(dāng)理解，為加速程序或改善結(jié)果，溫育時(shí)間和溫度可以根據(jù)溫育中所使用的物質(zhì)而改變。技術(shù)人員會(huì)知道， 術(shù)語(yǔ)“室溫”根據(jù)位置和外部溫度而意味著不同溫度。其通常為17°C 23°C。優(yōu)選的是，步驟(b)中的液體組合物經(jīng)緩沖的并且更優(yōu)選具有低鹽含量。本發(fā)明所述的低鹽含量被定義為鹽濃度為0. 9重量％以下，優(yōu)選低于0. 2重量％。通常但并非絕對(duì)的是，對(duì)于如IgG和IgY抗體等抗體，可以使用偏堿性的緩沖液，例如由15mM碳酸鈉和35mM 碳酸氫鈉水溶液制得(pH 9)，而對(duì)于IgM的附著而言，較中性的緩沖劑(pH 7. 0 7. 4)如 PBS等磷酸鹽緩沖劑更有利。作為其上附著有生物分子的固體載體，由步驟(a)獲得的固體載體在本發(fā)明的上下文中也稱作“涂布”載體(“coated” carrier)。作為與包被和/或包埋所附著生物分子的本發(fā)明的組合物溫育的固體載體，由步驟(b)獲得的固體涂布載體(solid coated carrier)在本發(fā)明的上下文中也稱作“后涂布，，載體("postcoated，，carrier) ο在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法還包括步驟(C)(c)除去步驟(b)中應(yīng)用的組合物。步驟(a)、(b)和(C)以上述順序進(jìn)行。術(shù)語(yǔ)“除去”指在步驟(b)后定性或定量地除去液體組合物。因此，之上將組合物除去至下述程度組合物的殘留量不顯著改變本發(fā)明方法的后續(xù)步驟中所使用的溶液的品質(zhì)。定量除去引起對(duì)載體的干燥。所述除去可以例如通過(guò)抽吸、濃縮或吹風(fēng)進(jìn)行，所述抽吸例如利用可附接移液管的普通泵進(jìn)行?？蛇x的是，這些步驟可以組合，并可以與空氣干燥進(jìn)一步組合。優(yōu)選的是，除去至少95體積％的溶液，如至少98體積％或至少99體積％、99. 5 體積％或99. 8%。因此，在其中進(jìn)行定量除去的一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法包括步驟 (c)(c)對(duì)固體載體進(jìn)行干燥。干燥可以使用如空氣干燥、噴霧冷凍干燥(dryinglyophilisation)和沉淀等公知技術(shù)進(jìn)行。其他適合的技術(shù)包括晶化和微晶化。當(dāng)作為載體的是珠?；蚣{米顆粒時(shí)，干燥可以通過(guò)冷凍干燥來(lái)進(jìn)行，不過(guò)對(duì)于其他載體而言優(yōu)選其他干燥技術(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)替代性的優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法還在步驟(b)之后包括步驟
(C)(c)對(duì)載體進(jìn)行干燥直至殘留液體含量< 20重量％。根據(jù)本發(fā)明的該優(yōu)選實(shí)施方式，可以以已知用于確定木材的含水量的方式計(jì)算殘留的液體含量。對(duì)于木材，木材的含水量百分比(X)通過(guò)以下方式確定計(jì)算樣品中水的質(zhì)量(HIw)與含水木材樣品的質(zhì)量(mu)的比率并乘以100。樣品中水的質(zhì)量(mw)可以通過(guò)從含水木材樣品質(zhì)量(mu)中減去脫水后樣品質(zhì)量來(lái)確定。因此，木材的含水量的百分比通過(guò)下式計(jì)算X(%)= - aIOO
m 載體制備物的殘留含水量可以以類似方式確定，其中％是載體樣品中的水的質(zhì)量，1^是樣品完全脫水后載體樣品的質(zhì)量。對(duì)于海綿狀載體，在擠出孔中過(guò)量的水后確定
mwo在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，該方法還在步驟(a)之后包含步驟(a’ )(a’ )干燥載體直至組合物的殘留液體含量低于最初應(yīng)用的組合物的10%、優(yōu)選低于5 %、更優(yōu)選低于2 %，如低于1 %、0. 5 %或0. 2 %。優(yōu)選的干燥方法如上所述，并且也包括用于除去組合物的方法。最優(yōu)選的是，干燥通過(guò)空氣干燥、噴霧干燥、冷凍干燥、沉淀、 晶化或微晶化進(jìn)行。本發(fā)明的方法還可以在步驟(a)之后且在步驟(b)之前且可選的是在步驟(a’ ) 之后包括步驟(a”)(a”)在包含封閉劑的緩沖水性溶液中溫育載體并除去該水性溶液?？梢栽谏a(chǎn)固體載體的本方法中使用封閉劑，以防止該方法的后續(xù)步驟中添加的材料的非特異性結(jié)合。將載體在步驟(b)中于本發(fā)明的液體組合物中溫育之前，所述封閉對(duì)于生物分子的構(gòu)象穩(wěn)定性也具有正面作用。有鑒于此，本發(fā)明的組合物可以用作封閉劑。符合本發(fā)明的其他封閉劑包含但不限于人血清和所述血清的蛋白(例如白蛋白)、奶、蛋蛋白、植物源蛋白(例如大豆、小麥)， 包括所述蛋白的水解產(chǎn)物(例如明膠、膠原)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法在步驟(b)、(C)或(d)之后還包括對(duì)固體載體滅菌的步驟(e)。除其他因素之外，對(duì)通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的固體涂布載體的滅菌能力使得可以在非無(wú)菌或半無(wú)菌條件下生產(chǎn)固體涂布載體，其中如此生產(chǎn)的載體仍然還可用在涉及固體涂布載體在體內(nèi)、離體或體外與體液接觸的下文所述的本發(fā)明的方法中。這代表了本發(fā)明的方法和如此生產(chǎn)的載體的另一優(yōu)異特征，這是因?yàn)橛捎谠撎卣?，與生產(chǎn)不可滅菌的載體的成本相比，生產(chǎn)該固體載體的成本可以得到降低。這是因?yàn)?，在生產(chǎn)工藝中，不要求無(wú)菌條件。公知的是，常規(guī)制備的載體不適于滅菌，必需在完全無(wú)菌的條件下生產(chǎn)。此外，有利于成本的特征在于，所述載體可以在其使用后通過(guò)滅菌回收。回收的載體可以隨后用于同一患者或不同患者的進(jìn)一步治療或者用于另一診斷方法或同一診斷方法。優(yōu)選的是，載體的滅菌或回收根據(jù)載體材料通過(guò)環(huán)氧乙烷(EO)、輻射、Y-輻射、X-射線、熱滅活、高壓滅菌或等離子滅菌進(jìn)行。最優(yōu)選的是，載體通過(guò)輻射或Y-輻射滅菌。在該實(shí)施方式中適當(dāng)?shù)氖抢肐OMeV電子加速器的劑量為25千格雷(kgray)的 β-輻射。在一定程度上，可將利用環(huán)氧乙烷的滅菌應(yīng)用于本發(fā)明的載體。通常，必須選擇滅菌的方法，以不傷害附著于/固定在固體載體上的生物材料的所需活性。這可以通過(guò)上述生物分子進(jìn)行，所述生物分子可以是分離形式、彼此結(jié)合或與其他生物分子結(jié)合的形式、 或者存在于如細(xì)胞或細(xì)胞的片段等更高級(jí)結(jié)構(gòu)上。對(duì)于任何種類的活細(xì)胞而言，目前還不知道適當(dāng)?shù)臏缇绞?。因此，將活?xì)胞用作生物材料并對(duì)載體滅菌的實(shí)施方式不是本發(fā)明的一部分。在步驟(b)、(C)、(d)或(e)之后，載體可以存儲(chǔ)到需要使用時(shí)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種可通過(guò)或者通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的固體載體。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種其上附著有生物分子的固體載體，其中所述生物分子部分或完全由本發(fā)明的組合物包被或包埋于本發(fā)明的組合物中。包含包埋的生物分子的所述固體載體(也稱作“后涂布載體”)的一個(gè)實(shí)施方式示例性地顯示在圖1的示意圖所示截面中。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“部分包被”或“部分包埋”優(yōu)選表示至少20%、優(yōu)選至少30%、 至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、更優(yōu)選至少90%、至少95%、至少 98 %或至少99 %的生物分子被包被或包埋在本發(fā)明的組合物中。除其他因素外，關(guān)于本發(fā)明的組合物和涉及生物分子、載體材料附著和溫育程序或滅菌的本發(fā)明的方法而給出的定義和說(shuō)明經(jīng)過(guò)必要變更適用于本發(fā)明的固體載體。同樣，本發(fā)明的固體載體的特別優(yōu)異的特征已在以上表征本發(fā)明的方法的上下文中進(jìn)行了描述。根據(jù)本發(fā)明的固體后涂布載體的優(yōu)選實(shí)施方式，附著于固體載體的生物分子例如為如上所述的蛋白、肽、核酸、糖類、脂質(zhì)、脂肪酸、多元醇及其組合或修飾物。蛋白優(yōu)選為抗體，更優(yōu)選為IgG、IgY或IgM類抗體。其他優(yōu)選蛋白為除抗體之外的細(xì)胞因子、蛋白激動(dòng)劑或拮抗劑，例如酶、生長(zhǎng)因子、白蛋白或球蛋白、受體、激素、膜蛋白、白蛋白、球蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或凝血因子。在另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，生物分子特異性地結(jié)合于指示疾病的標(biāo)志物蛋白、病原體、優(yōu)選非細(xì)胞病原體、細(xì)胞或毒素。本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)“特異性地結(jié)合”可與“與......特異性地相互作用”互換使用，是
指生物分子不與或基本不與除病原體或指示疾病的標(biāo)志物蛋白以外的其他結(jié)構(gòu)或表位交叉反應(yīng)。該實(shí)施方式的優(yōu)選的生物分子是如上所述的抗體。所研究的一組抗體的交叉反應(yīng)性可以例如通過(guò)評(píng)估該組抗體在常規(guī)條件下與所關(guān)注的結(jié)構(gòu)/表位以及與(結(jié)構(gòu)上和/或功能上)密切相關(guān)性較大或較小的結(jié)構(gòu)/表位的結(jié)合而測(cè)試。只有與在其相關(guān)環(huán)境中結(jié)合所關(guān)注的結(jié)構(gòu)/表位(例如指示疾病的蛋白的結(jié)構(gòu)中的特定基序)但不或者基本不與任何其他結(jié)構(gòu)/表位結(jié)合的那些抗體才被認(rèn)為對(duì)于所關(guān)注的結(jié)構(gòu)/表位具有特異性，由此成為根據(jù)本發(fā)明使用的抗體。例如Harlow和Lane (1988和1999，出處同上)描述了相應(yīng)方法。存在標(biāo)志物蛋白的疾病的實(shí)例包括各種原因的嚴(yán)重高脂血癥、純合子家族性高膽固醇血癥、雜合子家族性高膽固醇血癥、缺陷性Apo B-100、分離的脂蛋白(a)升高、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征、混合性結(jié)締組織病、擴(kuò)張型心肌病(DCM)、與凝血因子的抑制劑關(guān)聯(lián)的疾病、特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、血栓性血小板減少性紫癜(TTP)、自身免疫性溶血性貧血、高丙種球蛋白血癥中的高粘滯綜合征、重癥肌無(wú)力、格林-巴利綜合征、 慢性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)、異常蛋白血癥多神經(jīng)病、骨髓移植、內(nèi)分泌眼病、I型糖尿病(IDDM)、肺出血腎炎綜合征(Goodpasture's syndrome)、免疫球蛋白或免疫復(fù)合物沉積引起的腎病、冷球蛋白血癥、天皰瘡、特應(yīng)性皮炎、移植物抗宿主(GvH)疾病、宿主抗移植物(HvG)疾病和各種形式的血管炎。用于特定疾病的已知的標(biāo)志物蛋白例如為降鈣素原、細(xì)胞因子，如TNFa或IL6， 和C-反應(yīng)蛋白。生物分子可結(jié)合的病原體包括引起傳染病的那些病原體，如細(xì)菌或真菌等。引起傳染病的非細(xì)胞病原體包括病毒和朊病毒。所述病原體的實(shí)例為HIV、HBV、HCV、皰疹病毒，如單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒和水痘帶狀皰疹病毒、革蘭氏陽(yáng)性菌(如鏈球菌、葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌(如大腸桿菌、綠膿桿菌)。毒素也可以指示疾病或身體的某種狀態(tài)。毒素時(shí)有毒物質(zhì)，優(yōu)選通過(guò)活細(xì)胞或生物體產(chǎn)生。毒素可以是例如這樣的小分子、肽或蛋白其能夠在與身體組織接觸或被其吸收時(shí)通過(guò)與如酶或細(xì)胞受體等生物大分子相互作用而引起疾病。毒素的嚴(yán)重性有很大差異， 從通常很微小和很急劇的程度(如蜂蜇)至幾乎立即致死的程度(如肉毒桿菌毒素)。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，固體后涂布載體通過(guò)例如或Y-輻射來(lái)如上所述地滅菌，以用于本發(fā)明的應(yīng)用和方法。適當(dāng)?shù)氖抢肐OmeV電子加速器的劑量為 25kGy的β-輻射。本發(fā)明的固體載體可用于治療和診斷。本發(fā)明的另一方面涉及本發(fā)明的組合物用于穩(wěn)定其上附著有生物分子的固體載體以便長(zhǎng)期存儲(chǔ)和/或滅菌的應(yīng)用。生物分子的長(zhǎng)期存儲(chǔ)和滅菌的主要挑戰(zhàn)是避免具有所需生物活性的生物分子的不可逆改變。這些變化可導(dǎo)致對(duì)生物分子的分子修飾，所述修飾在生物分子經(jīng)受逆境時(shí)出現(xiàn)，還可導(dǎo)致所述生物分子的所需生物活性的損失，導(dǎo)致其存儲(chǔ)穩(wěn)定性降低，或?qū)е滦旅庖?/抗原性質(zhì)，所述新免疫/抗原性質(zhì)可使所述產(chǎn)物的接受者在施用或應(yīng)用時(shí)有過(guò)敏性反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。這對(duì)于具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和/或非常不穩(wěn)定的蛋白特別重要，所述蛋白例如為許多治療性蛋白和單克隆抗體。研究者已經(jīng)嘗試在使用環(huán)氧乙烷的滅菌過(guò)程中避免活性化合物發(fā)生不可逆改變。然而，環(huán)氧乙烷通常與蛋白反應(yīng)。另外，由于已知的組織毒性和環(huán)氧乙烷的副產(chǎn)物的致癌潛力，食品藥品管理局已經(jīng)設(shè)定了環(huán)氧乙烷及其主要反應(yīng)產(chǎn)物乙二醇和2-氯乙醇(ethylene chlorhydrin)的殘留上限。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于，生物分子受本發(fā)明的組合物保護(hù)，使得滅菌也可以使用環(huán)氧乙烷進(jìn)行。與環(huán)氧乙烷不同，輻射滅菌具有高穿透能力、較低化學(xué)反應(yīng)性和即時(shí)作用的優(yōu)點(diǎn)， 且無(wú)需控制溫度、壓力、真空度或濕度。輻射滅菌廣泛用于許多產(chǎn)品行業(yè)，其劑量水平及其生物作用是公知的。通常公認(rèn)電子束和伽馬滅菌在殺滅微生物方面是等效的。雖然足以有效殺滅微生物，但輻射通常會(huì)改變?nèi)绲鞍?、DNA、RNA等生物分子的結(jié)構(gòu)，從而使其在未受保護(hù)或不穩(wěn)定的情況下失去生物活性。因此，迫切需要有效和安全地對(duì)生物活性化合物滅菌而不有害地影響其化學(xué)、物理或生理性質(zhì)的簡(jiǎn)單方法。根據(jù)本發(fā)明已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了這種方法。向醫(yī)療市場(chǎng)引入新型或修改的產(chǎn)品需要確保它們可以存儲(chǔ)更長(zhǎng)時(shí)間(一至五年)，并且不會(huì)在使用產(chǎn)品時(shí)降低性能并影響安全性和有效性。由于這種產(chǎn)品通常不存在完整周期的環(huán)境老化樣品，因此通常需要進(jìn)行“加速老化”試驗(yàn)，以在可獲得完整周期樣品之前提供支持這些產(chǎn)品所要求保護(hù)的性能和儲(chǔ)存壽命的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在醫(yī)療裝置的質(zhì)量測(cè)試中使用加速老化技術(shù)的主要原因是為了在盡可能最早的時(shí)間將產(chǎn)品投入市場(chǎng)。目標(biāo)是既利于患者(例如通過(guò)盡早獲得壽命延長(zhǎng)的裝置)，也利于公司(產(chǎn)生額外的銷售和市場(chǎng)份額)，而不使其暴露于任何不合理的風(fēng)險(xiǎn)。加速老化可以被定義為尋求確定在正常使用條件下于相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)裝置或材料的反應(yīng)，其方式是使產(chǎn)品在短得多的時(shí)間經(jīng)受比正常環(huán)境或運(yùn)作逆境更嚴(yán)苛或更頻繁應(yīng)用的逆境。試驗(yàn)方案效率的顯著增強(qiáng)可以通過(guò)利用過(guò)度的環(huán)境逆境，如熱、氧、化學(xué)品或輻射等實(shí)現(xiàn)。一種加速老化的簡(jiǎn)化方法是基于下述測(cè)試，先在單增加溫度下測(cè)試，然后應(yīng)用下述規(guī)則，所述規(guī)則表述溫度每增加10°c，化學(xué)反應(yīng)的速率將提高( 1(ι倍。為常用醫(yī)療聚合物選擇的典型的關(guān)系是Acl = 2 ；即，在使用或存儲(chǔ)溫度之上溫度每升高10°c反應(yīng)速率增加一倍。為獲得用于診斷或治療的生物分子的足夠的儲(chǔ)藏壽命，需要將這些生物分子冷凍以防止其變性(Cleland 等，(2001)，Journal of Pharmaceutical Sciences 第 90 卷，第 310-321頁(yè))。此外，所關(guān)注的生物分子必須在含有如糖(例如蔗糖、海藻糖、甘露醇)或鹽等所謂凍干保護(hù)劑的穩(wěn)定溶液中溫育。然而，由于存在生物分子受冷凍而變性的風(fēng)險(xiǎn)，需要在4°C或室溫的存儲(chǔ)方法，對(duì)于不穩(wěn)定的生物分子如IgM抗體尤其如此。令人驚訝的是，發(fā)現(xiàn)了通過(guò)在本發(fā)明的穩(wěn)定組合物中溫育生物分子，例如固定在固體載體上的抗體，這些生物分子可以在45°C存儲(chǔ)7天而不顯著喪失其生物活性。根據(jù)之前所述的規(guī)則，該“加速老化”相當(dāng)于在5°C存儲(chǔ)16周。此外，生物分子可以被滅菌，而不顯著喪失其生物活性(參見(jiàn)所附實(shí)施例)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的載體的醫(yī)療和診斷產(chǎn)品和裝置。在另一個(gè)替代性實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明的固體載體在制備醫(yī)療或診斷產(chǎn)品和/或裝置中的應(yīng)用。所述裝置是包含根據(jù)本發(fā)明而被穩(wěn)定的生物分子的生物組分和非生物部分的組合，并且也被稱作生物裝置組合產(chǎn)品。
包埋在本發(fā)明的穩(wěn)定組合物中或被其包被的其上附著有生物分子的固體載體可以用在許多診斷和醫(yī)療/治療應(yīng)用中。治療應(yīng)用或裝置包括醫(yī)療植入物、導(dǎo)管、支架、管 (它們可單獨(dú)或與其他組件組合使用)、一旦被如體液等液體潤(rùn)濕則能夠洗脫所附生物分子的基體，例如傷口繃帶、或體外循環(huán)中所使用的醫(yī)療裝置。診斷應(yīng)用包括例如免疫測(cè)定， 如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)、蛋白芯片、多分析物測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡、斑點(diǎn)雜交、免疫組織化學(xué)、受體-配體測(cè)定和免疫-PCR。治療途徑可以包含在使用醫(yī)療裝置情況下本發(fā)明的載體的體內(nèi)和離體應(yīng)用。因此，包含固體后涂布載體的裝置可以植入患者以用于體內(nèi)應(yīng)用。對(duì)于離體應(yīng)用，包含固體涂布載體的裝置可以與待處理的體液的循環(huán)相連。來(lái)自患者動(dòng)脈或靜脈的血可以例如通過(guò)所述裝置傳導(dǎo)，并隨后泵回患者體內(nèi)(與血流相連)。作為另外一種選擇，可以將體液的樣品與載體在體外溫育。在后一種處理的后續(xù)步驟中，體液可以被再次引入患者體內(nèi)。醫(yī)療裝置的一個(gè)實(shí)施方式適于例如通過(guò)將裝置與患者的體液循環(huán)相連而能夠接觸、過(guò)濾或清潔患者體液(例如血、淋巴或腦脊髓液等)，由此如本說(shuō)明書(shū)中上文所述地治療患者。此外，器件可以適于化合物的定性或定量檢測(cè)，以及適用于在患者的體液樣品中捕集某些細(xì)胞或細(xì)胞群，例如干細(xì)胞、胎細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞，亦如本說(shuō)明書(shū)下面部分中所描述。干細(xì)胞包含多能性干細(xì)胞(pluripotent stem cell)、多潛能干細(xì)胞(multipotent stem cell)或全能性干細(xì)胞(totipotent stem cell)。通常，不同細(xì)胞株、不同細(xì)胞種或細(xì)胞的不同發(fā)育階段可以通過(guò)在細(xì)胞表面上不同抗原的存在來(lái)區(qū)分。這使得能夠通過(guò)選擇附著于本發(fā)明載體的生物分子如抗體或其片段等來(lái)選擇性捕集所需細(xì)胞，其中所述生物分子特異性地結(jié)合于所述抗原中的一種。在捕集胎細(xì)胞的情況下，本發(fā)明的裝置的應(yīng)用避免了如羊膜穿刺等潛在危險(xiǎn)技術(shù)，在本發(fā)明裝置的應(yīng)用中，由母親獲得的血液樣品被用于捕集胎細(xì)胞而不會(huì)危及胎兒性命。此外，通過(guò)提供富含腫瘤細(xì)胞的樣品，可以促進(jìn)癌變疾病的診斷及其表征。在整個(gè)本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)“患者”包含患病對(duì)象和健康對(duì)象。本發(fā)明的患者是接受醫(yī)療關(guān)注、護(hù)理或治療的任何人。該人經(jīng)常但不始終患病或受傷，如果患病或受傷， 則需要醫(yī)師或其他醫(yī)療專業(yè)人員的治療。在另一些情況中，術(shù)語(yǔ)“患者”可與“對(duì)象”互換使用，“對(duì)象”可以患病或不患病。對(duì)象可以是動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。根據(jù)上述內(nèi)容， 患者也可以是例如緊急或例行地診斷疾病或健康狀況的健康人。在另一些部分中，本發(fā)明還用于查出患者是否患有某種疾病(或者疾病組合)、傾向于發(fā)展成所述疾病或疾病組合。裝置的一個(gè)實(shí)施方式包括臨時(shí)或永久植入物，其特征在于表面至少部分地對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的固體涂布載體，或者附著有本發(fā)明的固體涂布載體。這包括用于重建性外科手術(shù)的接骨裝置、材料以及新類型的支架。所述新型種類的支架可以具有催化特征(例如，刺激性、抑制性或消除性特征)。關(guān)于這一點(diǎn)，示例性刺激性特征可以是交聯(lián)細(xì)胞表面上的受體并可活化細(xì)胞如白細(xì)胞的結(jié)合載體的抗體或其片段。 示例性抑制性特征是結(jié)合于細(xì)胞表面上的受體并可通過(guò)誘導(dǎo)失活信號(hào)(例如影響白細(xì)胞) 或通過(guò)阻止活化分子結(jié)合而使細(xì)胞失活的結(jié)合載體的抗體或其片段。消除性特征的實(shí)例是可以結(jié)合可溶性因子并由此降低其在溶液中的濃度(例如耗盡所述因子)的結(jié)合載體的抗體或其片段(例如 Ig-Therasorb ⑧或 LDL-Therasorb )。
此外，醫(yī)療或診斷裝置的另一些替代性實(shí)施方式是其內(nèi)壁為本發(fā)明的固體涂布載體的裝置或者內(nèi)壁附著本發(fā)明的固體涂布載體的裝置。所述裝置包括但不限于離體接種容器、分離單采裝置(apheresis device)、干細(xì)胞分離裝置、清洗裝置、注射器和臨時(shí)或永久血液存儲(chǔ)用裝置(例如，用于血庫(kù)中，但也可以用于常規(guī)研究實(shí)驗(yàn)室中的實(shí)驗(yàn)設(shè)備中)。診斷(醫(yī)療)裝置的一個(gè)實(shí)例是ELISA板，其中所述板的表面(或至少其反應(yīng)壁)至少部分地對(duì)應(yīng)于本發(fā)明的固體涂布載體，或者附著有本發(fā)明的固體涂布載體。本發(fā)明還涉及經(jīng)滅菌容器，其包含載體、可逆地附著于所述載體的至少一種生物分子、部分或完全包被所附著的生物分子的本發(fā)明的穩(wěn)定組合物；和可選的蓋子?？筛街谳d體的生物分子已在上文中有所描述。在優(yōu)選實(shí)施方式中，至少一種生物分子以其可以迅速地從載體上釋放的方式附著于載體，優(yōu)選可在使用前立即釋放。取決于附著的種類(共價(jià)或非共價(jià))，迅速釋放可以例如通過(guò)蛋白酶切、PH值變化或溫度變化而實(shí)現(xiàn)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，載體為固體，更優(yōu)選是多孔的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，載體是半固體，并優(yōu)選包含水凝膠或凝膠性蛋白混合物。在又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，載體是可溶性的并優(yōu)選包含溶解在水性、可選的是緩沖的溶液中的蛋白和/或糖類結(jié)構(gòu)物。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)生物分子的經(jīng)滅菌的容器的方法，其包括(a)向容器中插入載體；(b)將至少一種生物分子可逆地附著于所述載體；(c)在本發(fā)明的液體穩(wěn)定組合物中溫育帶有所述至少一種可逆地附著的生物分子的該載體，從而使所述至少一種生物分子部分或完全地被所述穩(wěn)定組合物包被；(d)密封該容器；和(e)對(duì)該容器滅菌。在替代性實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物分子的經(jīng)滅菌的容器的方法，其包括 (a)將至少一種生物分子可逆地附著于載體，(b)將帶有至少一種附著的生物分子的該載體插入容器中，(c)在本發(fā)明的液體穩(wěn)定組合物中溫育帶有至少一種可逆地附著的生物分子的所述載體，從而使所述至少一種生物分子部分或完全被所述穩(wěn)定組合物包被，(d)密封該容器；和(e)對(duì)該容器滅菌。在另一個(gè)替代性實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)生物分子的滅菌的容器的方法，其包括(a)將至少一種生物分子可逆地附著于載體，(c)在本發(fā)明的液體穩(wěn)定組合物中溫育帶有至少一種可逆地附著的生物分子的該載體，從而使是至少一種生物分子部分或完全被所述穩(wěn)定組合物包被，(c)將所述帶有至少一種可逆地附著的生物分子的該載體插入容器中，(d)密封該容器；和(e)對(duì)該容器滅菌。上述方法還可以包括在如上所述的溫育后干燥或除去組合物的液體部分的步驟。在一個(gè)不同的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的容器。此外，本發(fā)明涉及本發(fā)明的容器用于如上所述的診斷或治療中的應(yīng)用。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了診斷疾病的方法，所述方法包含以下步驟(a)在適當(dāng)條件下將獲自患者的樣品與本發(fā)明的固體載體接觸，以使附著于特異性地結(jié)合指示疾病的標(biāo)志物蛋白、優(yōu)選非細(xì)胞病原體、細(xì)胞或毒素的載體的生物分子與所述病原體或標(biāo)志物蛋白或細(xì)胞或毒素特異性地結(jié)合；和(b)檢測(cè)所述指示疾病的標(biāo)志物蛋白、所述優(yōu)選非細(xì)胞病原體、所述細(xì)胞或所述毒素是否已與生物分子結(jié)合。樣品包括體液或身體流體，如血液、血漿、血清、唾液、尿、支氣管肺泡流體、胃腸分泌液、腦脊液、腹水、胸腔積液、傷口滲出液。使附著于特異性地結(jié)合病原體或指示疾病的標(biāo)志物蛋白的載體的生物分子與所述病原體或標(biāo)志物蛋白特異性地結(jié)合的適當(dāng)條件包括PH值為7. 0 7. 7，并且摩爾滲透壓濃度為 200mosmol/l 400mosmol/l。上面已經(jīng)描述了優(yōu)選的生物分子。特別優(yōu)選的生物分子包括膜結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)生物分子，如受體和可溶性生物分子或者受體或其功能片段。膜結(jié)合生物分子的優(yōu)選功能性片段含有所述生物分子的細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外部分，由此省略了其跨膜的部分。優(yōu)選的是，生物分子或受體是抗體或者如上所述的保留抗體結(jié)合活性和特異性的其片段或衍生物。最優(yōu)選的是，抗體是單克隆抗體。利用本發(fā)明的診斷方法診斷的疾病的實(shí)例包括本說(shuō)明書(shū)上文中所述的疾病。所述病原體或標(biāo)志物蛋白可以例如通過(guò)使用抗體如anti-pM(HIV)(參見(jiàn)例如khupbach等， J. Aquir. Immune Defic. Syndr. (2005)，第 40 卷，第 25O-256 頁(yè))或 anti-IgB (HCMV)(參見(jiàn)例如 Just-Nubling G.等，Infection Q003)，318-323)來(lái)檢測(cè)。病原體或指示疾病的標(biāo)志物蛋白與所附著抗體特異性結(jié)合的適當(dāng)條件可以通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)在生理?xiàng)l件下將患者體液樣品與本發(fā)明的抗體包被的固體載體接觸。生理?xiàng)l件包括PH值為7. 0 7. 7，并且摩爾滲透壓濃度為200mosmol/l 400mosmol/l。對(duì)病原體或指示疾病的標(biāo)志物蛋白是否已結(jié)合于生物分子的檢測(cè)可以通過(guò)本領(lǐng)域公知的和如上所述的方法來(lái)進(jìn)行。示例性方法包含ELISA和免疫沉淀。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的診斷方法包含下述步驟，即，在細(xì)胞培養(yǎng)條件下溫育體液樣品的材料，以在將該樣品與本發(fā)明的載體接觸(步驟(a))之前使其富含非細(xì)胞病原體(如病毒)、細(xì)胞(如細(xì)菌)或單細(xì)胞真核病原體。細(xì)胞培養(yǎng)條件包括在25°C 40°C的培養(yǎng)基中PH值為7. 0 7. 7，并且摩爾滲透壓濃度為200mosmol/l 400mosmol/l。此外，本發(fā)明提供了一種診斷組合物，所述診斷組合物包含根據(jù)本發(fā)明后涂布的固體涂布載體。本發(fā)明的診斷組合物將優(yōu)選用于利用上位對(duì)于檢測(cè)標(biāo)志物蛋白、優(yōu)選非細(xì)胞病原體、細(xì)胞和毒素描述的方法來(lái)診斷疾病。利用本發(fā)明的診斷組合物診斷的疾病的實(shí)例已描述于本說(shuō)明書(shū)的上文中。本發(fā)明還涉及用于使固定化生物分子穩(wěn)定的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括(a)本發(fā)明的至少一種穩(wěn)定組合物和(b)用于將固定化生物分子與有效量的所述至少一種穩(wěn)定組合物接觸以產(chǎn)生被穩(wěn)定的生物分子組合物的說(shuō)明書(shū)。在優(yōu)選實(shí)施方式中，穩(wěn)定組分包括一種以上固體材料(例如，現(xiàn)有技術(shù)中已知的凍干或粉末試劑或其他化合物)。 試劑盒的各組分可以包裝在一個(gè)或多個(gè)容器中，如包裝在一個(gè)或多個(gè)小瓶中。除所述組分之外，小瓶還可以包含用于儲(chǔ)存的防腐劑或緩沖劑。


圖1 生物分子(例如抗體)附著于固體載體，其優(yōu)選使用隔離體分子和連接體分子附著?？贵w被后涂布溶液包埋，由此保護(hù)其免受如輻射等逆境影響。圖2和圖3 氨基酸后涂層的保護(hù)效果隨所使用的不同氨基酸的數(shù)量而增加(與氨基酸無(wú)關(guān))。選擇以下各組的代表作為所述氨基酸具有芳香性的/帶正電荷的/帶負(fù)電荷的/極性不帶電荷的/非極性脂肪族側(cè)鏈的氨基酸。由5種不同氨基酸組成的后涂層在利用25kGy輻射后，與未輻射的對(duì)照組相比，約 65%的抗原結(jié)合能力得到保留；在加速老化程序(在45°C持續(xù)7天)后，與未處理的對(duì)照組相比，約85%的抗原結(jié)合能力得到保留。圖4和圖5 將氨基酸數(shù)量增加到超過(guò)5不能進(jìn)一步增強(qiáng)氨基酸后涂層的保護(hù)效果。與未處理的對(duì)照組相比，利用25kGy輻射后，對(duì)于含有超過(guò)5種氨基酸的所有后涂層而言，有約70%的抗原結(jié)合能力得到保留；加速老化(在45°C持續(xù)7天)后，有約85%的抗原結(jié)合能力得到保留。圖6和圖7 相對(duì)于未滅菌的對(duì)照組，氨基酸的組合分別顯示了 65% 0種氨基酸) 和85% (8種氨基酸)的保護(hù)效果，而單種氨基酸的平均作用分別為22% 0種氨基酸)和 33% (8種氨基酸)的抗原結(jié)合能力。單種氨基酸的最大效果分別為觀％ 0種氨基酸)和 55% (8種氨基酸)。圖8 向氨基酸后涂層添加ImM甘草酸可將所有后涂層的保護(hù)效果增加至70% 80%的最大值(與未輻射對(duì)照組相比的抗原結(jié)合能力)。圖9 與未處理的對(duì)照組相比，由五種不同氨基酸OOOmM)和ImM甘草酸組成的氨基酸后涂層在輻射(25kGy)后和在加速老化程序后對(duì)抗原結(jié)合能力分別顯示了 80%和 85%的保護(hù)效果。由白蛋白和甘露醇組成的后涂層在輻射(25kGy)后顯示了僅65%的保留活性。經(jīng)過(guò)在45°C持續(xù)7天的加速老化之后，白蛋白和甘露醇幾乎未保留活性，這與不具有任何后涂層的對(duì)照組相似。圖10 使用18種氨基酸的混合物來(lái)封閉對(duì)ELISA板的非特異性結(jié)合，而且不抑制特異性抗原-抗體相互作用。封閉效率與標(biāo)準(zhǔn)白蛋白封閉液相當(dāng)。圖11 輻射(25kGy)后，由18種不同氨基酸QOg/Ι)和0. 25mM甘草酸組成的氨基酸后涂層與未處理的對(duì)照組相比顯示了為83% DNAse活性的保護(hù)效果。由白蛋白和甘露醇組成的后涂層在輻射(25kGy)后顯示了 95%的保留活性。圖12 與未處理的對(duì)照組相比，由18種不同氨基酸(在PBS中20g/l的溶液)組成的氨基酸后涂層在輻射(25kGy)后和在加速老化程序后分別顯示了 85%和90%的抗原結(jié)合能力的保護(hù)效果。與未處理的對(duì)照組相比，向氨基酸后涂層中添加ImM甘草酸在輻射 (25kGy)后和加速老化程序后，保護(hù)效果分別為92%和95%的抗原結(jié)合能力。圖13:由18種不同氨基酸(在PBS中20g/l的溶液)組成的氨基酸后涂層顯示了 55 % 60 %的保護(hù)效果。在沒(méi)有后涂層的情況下，完整ds-DNA的量降低至20 %，通過(guò)白蛋白和甘露醇可有85%得到保留。圖14 用于保護(hù)抗肝炎抗體的氨基酸組合物在凍干和滅菌后的抗甲型肝炎測(cè)試 (功能 ELISA)。圖15 皂苷的結(jié)構(gòu)類型具有增強(qiáng)氨基酸組合的保護(hù)效果的能力。圖16:在采用50kGy β輻射時(shí)，至少3種氨基酸的組合和2種氨基酸與附加的甘草酸(GA)的組合提供了對(duì)固定化抗體的最大保護(hù)。圖17 氨基酸組合物在不同逆境條件下提供保護(hù)。對(duì)于不同劑量的β -輻射和升溫下的人工老化，提供了最佳保護(hù)。對(duì)于Y-輻射或環(huán)氧乙烷滅菌的保護(hù)較小，但仍具相關(guān)性。
圖18和圖19 含有至少5種氨基酸的氨基酸后涂層在長(zhǎng)期存儲(chǔ)過(guò)程中提供保護(hù)。 對(duì)于非滅菌樣品而言，在45°C持續(xù)62天后約80%抗原結(jié)合能力得到保留。滅菌樣品(β， 25kGy)在45°C持續(xù)62天后保留其抗原結(jié)合能力的約70%。不考慮滅菌，在存儲(chǔ)過(guò)程中，含有僅2種氨基酸的氨基酸后涂層僅保留有約40 %的抗原結(jié)合能力。無(wú)后涂層的則僅保留了 20% 30%的活性。圖20和圖21 向后涂層溶液中添加ImM甘草酸可增強(qiáng)保護(hù)效果。含有至少5種氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂層在長(zhǎng)期存儲(chǔ)過(guò)程中提供保護(hù)。對(duì)于非滅菌樣品而言，在45°C 持續(xù)62天后約90%抗原結(jié)合能力得到保留。滅菌樣品(i3，25kGy)在45°C持續(xù)62天后保留其抗原結(jié)合能力的約80 %。不考慮滅菌，在存儲(chǔ)過(guò)程中，含有2種氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂層保留有約70%的抗原結(jié)合能力。無(wú)后涂層的則僅保留了 20% 30%的活性。圖22 在使用含有18種氨基酸的氨基酸后涂層保護(hù)時(shí)，以Y-輻射滅菌的樣品保留約85%活性；該效果不會(huì)被甘草酸進(jìn)一步增強(qiáng)；使用5種氨基酸時(shí)保留活性為75% ；使用2種氨基酸時(shí)僅保留40%。添加甘草酸改善了使用2種氨基酸的保護(hù)，此處其保留的活性為65%。當(dāng)使用含有18種氨基酸的氨基酸后涂層保護(hù)時(shí)，使用ETO滅菌的樣品保留約 85%的活性；此效果不會(huì)被甘草酸進(jìn)一步增強(qiáng)。含有5種或2種氨基酸的后涂層僅具有很小的保護(hù)效果；添加甘草酸可以邊際性地增強(qiáng)保護(hù)。圖23 氨基酸、二肽或其混合物組成的氨基酸后涂層，可選含有甘草酸。圖 24顯示了一個(gè)實(shí)例，其中小瓶自身是載體。首先，通過(guò)干燥使生物分子附著于載體。 然后，添加穩(wěn)定劑溶液并再干燥。若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的滅菌(25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為白介素8 = IL8)將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。顯示的是IL8對(duì)于人嗜中性粒細(xì)胞的趨化活性。圖 25顯示了一個(gè)實(shí)例，其中小瓶自身是載體。首先，通過(guò)干燥使生物分子附著于載體。 然后，添加穩(wěn)定劑溶液并再干燥。若不添加穩(wěn)定劑，則在加速存儲(chǔ)過(guò)程中生物分子 (此處為白介素8 = IL8)將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。顯示的是IL8對(duì)于人嗜中性粒細(xì)胞的趨化活性。圖 26顯示了一個(gè)實(shí)例，其中小瓶自身是載體。首先，通過(guò)干燥使生物分子附著于載體。 然后，添加穩(wěn)定劑溶液并再干燥。若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的滅菌(25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為ds-DNA)將失去其部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。顯示的是以占初始值的百分比表示的可檢測(cè)的DNA量。圖 27顯示了一個(gè)實(shí)例，其中穩(wěn)定劑自身是載體。添加生物分子和穩(wěn)定劑溶液并一起干燥。若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的滅菌(25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為白介素8 = IL8)將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。顯示的是IL8對(duì)于人嗜中性粒細(xì)胞的趨化活性。圖 28顯示了一個(gè)實(shí)例，其中穩(wěn)定劑自身是載體。添加生物分子和穩(wěn)定劑溶液并一起干燥。若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的存儲(chǔ)和/或滅菌(25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。圖 29不同解吸液對(duì)于生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)的生物活性的影響。除0. 5M H2SO4外，本實(shí)驗(yàn)中測(cè)試的其他解吸液對(duì)于生物分子的生物活性沒(méi)有顯著影響。顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。圖 30在將生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)附著于開(kāi)孔聚氨酯泡沫(supplier A，大孔)后測(cè)試生物分子的解吸。雖然PH 4. 75的檸檬酸鹽緩沖劑和IM NaCl僅解吸少量生物分子，但I(xiàn)M NaCl+0.02M咪唑和磷酸鹽緩沖鹽水分別可以解吸明顯更多的生物分子。顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。圖 31在將生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)附著于開(kāi)孔聚氨酯泡沫(supplier B，較小孔)后測(cè)試生物分子的解吸。PH 4. 75的檸檬酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖鹽水解吸得比含有或不含有0. 02M咪唑的IM NaCl強(qiáng)少許。顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。圖 32在將生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)附著于開(kāi)孔聚氨酯泡沫(supplier Smith&Nephews,小孔)后測(cè)試生物分子的解吸。若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的存儲(chǔ)和/或滅菌(25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子?？贵w的回收幾乎為100% (5yg/ml)0 顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。圖 33在使生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)附著于PVA-水凝膠之后測(cè)試生物分子的解吸。若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的存儲(chǔ)和/或滅菌(25kGy輻射)過(guò)程中生物分子將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。洗脫的抗體的回收率非常高。顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。圖 34可切割的連接體的實(shí)例的化學(xué)結(jié)構(gòu)。所述實(shí)例說(shuō)明了本發(fā)明。材料和方法所有實(shí)驗(yàn)都基于相同基本ELISA測(cè)定設(shè)計(jì)。L0-MM-3對(duì)ELISA板的吸附和后涂層的應(yīng)用使單克隆抗體L0-MM-3 (anti-mouse-IgM，Acris, SM1495P)吸附在 96 孔 ELISA 板 (Greiner Bio-one, 655061)的表面上。將 L0-MM-3 在 PBS (無(wú) Ca2+/Mg2+，PAA，H15-002)中稀釋至濃度為2yg/ml。向各孔中移入100 μ 1抗體溶液并在5°C溫育過(guò)夜。使用洗滌緩沖劑(25倍濃縮液，Invitrogen, WB02)洗滌該板2次。在各孔中移入200 μ 1各測(cè)定的穩(wěn)定組合物(后涂布)。利用相同的后涂布同樣地處理至少4個(gè)孔，以在后續(xù)的分析中計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。在環(huán)境溫度將該板與后涂布液溫育1小時(shí)。棄掉后涂布液，并在環(huán)境溫度干燥該板至少1小時(shí)。用于后涂層的氨基酸為L(zhǎng)-丙氨酸(Sigma-Aldrich，A7627)、L-精氨酸(Sigma-Aldrich，A5131)、L-天冬酰胺(Sigma-Aldrich，A0884)、L-天冬氨酸鹽(Sigma-Aldrich, A9256)、L-半胱氨酸(Sigma-Aldrich, 1276)、L-谷氨酰胺(AppliChem， A1420)、 L-谷氨酸鹽(Sigma-Aldrich， G1251)、甘氨酸(Merck， 1042010)、L-組氨酸(Sigma-Aldrich，H8125)、L-異亮氨酸(Sigma-Aldrich，12752)、 L-亮氨酸(Sigma-Aldrich，L8000)、L-賴氨酸(Sigma-Aldrich，L5626)、L-甲硫氨酸(Sigma-Aldrich, M9625)、L-苯丙氨酸(Sigma-Aldrich, P2126)、L-脯氨酸 (Sigma-Aldrich, P0380)、L-絲氨酸(Sigma-Aldrich，S4500)、L-蘇氨酸(Sigma-Aldrich， T8625)、L-色氨酸(Sigma-Aldrich, T0254)、L-酪氨酸(Sigma-Aldrich, T3754)、L-纈氨酸(Sigma-Aldrich，V0500)。經(jīng)涂布表面的逆境暴露將三塊相同處理的板暴露于不同環(huán)境條件。一塊板通過(guò)輻射滅菌(β，25kGy)。輻射在Beta-Gammalervice (德國(guó)Bruchsal)進(jìn)行。一塊板通過(guò)加速老化程序(在45°C持續(xù)7 天)處理。根據(jù)簡(jiǎn)化的阿雷尼烏斯方程(Arrhenius equation)，假定存儲(chǔ)溫度每升高10°C， 反應(yīng)(即，老化)速度變?yōu)閮杀?Hemmerich，1998 =General Aging Theory and Simplified Protocol for Accelerated Aging of Medical Devices)。這意味著，在 45°C 持續(xù) 7 天的加速老化相當(dāng)于冷卻存儲(chǔ)(5°C ) 16周的實(shí)際時(shí)間老化。使用未進(jìn)行逆境暴露的同樣的板充當(dāng)各個(gè)實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組。保護(hù)效果被計(jì)算為逆境條件后保留的抗體功能與未處理的對(duì)照組之比。
經(jīng)受逆境的板· 100 功能(％)=-
對(duì)照組的板L0-MM-3 功能的 ELISA 檢測(cè)通過(guò)洗滌板3次來(lái)從孔中除去干燥的后涂層。在各孔中移入300 μ 1封閉液(在 PBS中的10g/l的白蛋白溶液)并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)，從而封閉ELISA板。洗滌該板3 次。將L0-MM-3、CH11 (小鼠 IgM，MBL，SY001)的抗原稀釋至 125ng/ml，并將 200 μ 1 抗
原溶液移入各孔中。在環(huán)境溫度溫育該板1小時(shí)并洗滌3次。通過(guò)以PBS稀釋至50ng/ml的檢測(cè)抗體L0_MM_9 (生物素化的抗小鼠I gM，AbD serotec,MCA199B)檢測(cè)結(jié)合的抗原。向各孔中添加200 μ 1，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。使用PBS將鏈親和素(辣根過(guò)氧物酶(HRP)標(biāo)記，Pierce，21126)稀釋至IOOng/ ml。向各孔中添加200 μ 1，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。將HRP用即用型ELISA底物溶液(TMB =四甲基聯(lián)苯胺，Invitrogen，00-2023)用蒸餾水以1 2比例稀釋，并向各孔移入200 μ 1。在該板環(huán)境溫度避光溫育20分鐘。為停止顯色反應(yīng)，向各孔添加50 μ 1 H2S04(使用蒸餾水以1 5稀釋，Merck, 1007311000)。 通過(guò)測(cè)量在波長(zhǎng)為450nm處的吸收檢測(cè)所獲得的黃色(Fusion Photometer A153601， PerkinElmer)。
實(shí)施例1 由至小5種氨基酸組成的后涂層顯示抵抗逆境的最大保護(hù)。實(shí)驗(yàn)將氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck, 106482)或 0· 5M HCl (Merck, 100319)中以獲得具有最高濃度的儲(chǔ)液。將氨基酸儲(chǔ)液混合在一起以使后涂布液中總氨基酸濃度達(dá)到 200mM。這些氨基酸以等摩爾比例使用O種氨基酸2x IOOmM ；3種氨基酸3x 67mM :4種氨基酸4x 50mM ；5x40mM ；等等)。將氨基酸混合物的pH設(shè)為約7. 0 ；并將混合物進(jìn)一步在PBS中稀釋，以使最終濃度為200mM。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)板的吸附和后涂層的應(yīng)用；滅菌和加速老化；以及一般性ELISA程序。結(jié)果如圖2和圖3中所示，氨基酸后涂層的保護(hù)效果隨所使用的不同種氨基酸的數(shù)量而增加。選擇以下各組的代表作為所述氨基酸具有芳香性的/帶正電荷的/帶負(fù)電荷的/ 極性不帶電荷的/非極性脂肪族側(cè)鏈的氨基酸。并非必須使用特定氨基酸；它們可以分別由來(lái)自同一組或具有相似特性的不同氨基酸取代(Taylor，1985 :The Classification of Amino Acid Conservation)。由5種不同氨基酸組成的后涂層在利用25kGy輻射后，與未輻射的對(duì)照組相比，約 65%的抗原結(jié)合能力得到保留(圖1)；在加速老化程序(在45°C持續(xù)7天)后，與未處理的對(duì)照組相比，約85%的抗原結(jié)合能力得到保留(圖2)。將氨基酸數(shù)量增加到超過(guò)5不能進(jìn)一步增強(qiáng)氨基酸后保護(hù)層的保護(hù)效果。如圖4 和圖5所示，含有8、10或者甚至18種氨基酸的后涂層具有實(shí)際上相同的效果。實(shí)施例2 氨基酸的組合揭示了保護(hù)效果并不是由于特定的一種氨基酸。實(shí)驗(yàn)將氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck, 106482)或 0· 5M HCl (Merck, 100319)中以獲得具有最高濃度的儲(chǔ)液。將氨基酸儲(chǔ)液混合在一起以使后涂布液中總氨基酸濃度達(dá)到 200mM。氨基酸以等摩爾比例來(lái)使用0種氨基酸4x 50mM ;8種氨基酸8x 25mM)。對(duì)于單種的氨基酸溶液，將氨基酸以最大溶解濃度(可能的話為400mM)溶于蒸餾水。將所有后涂布液的PH調(diào)為約7.0。單種的氨基酸的濃度為Ala 400mM, Glu IOOmM, Lys 400mM, Thr 400mM, Asn 200mM, Asp IOOmM, His 300mM, Pro 400mM, Ser 400mM, Trp 60mM, Val 400mM。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)板的吸附和后涂層的應(yīng)用；滅菌和加速老化；以及一般性ELISA程序。結(jié)果從圖6和圖7中可以看出，氨基酸混合物的保護(hù)效果不能歸因于混合物中的某一種氨基酸的保護(hù)效果。相對(duì)于未滅菌的對(duì)照組，氨基酸的組合顯示了 65% (4種氨基酸)和85% (8種氨基酸)的保護(hù)效果，而這些混合物中的單種的氨基酸的平均效果為22% 0種氨基酸)和 33% (8種氨基酸)的抗原結(jié)合能力。單種氨基酸的最大效果為0種氨基酸)和55% (8種氨基酸)。實(shí)施例3 向溶液中添加甘草酸可進(jìn)一步提高氨基酸后涂層的保護(hù)效果。
實(shí)驗(yàn)將氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck, 106482)或 0· 5M HCl (Merck, 100319)中以獲得具有最高濃度的儲(chǔ)液。將氨基酸儲(chǔ)液混合在一起以使后涂布液中總氨基酸濃度達(dá)到 200mM。這些氨基酸以等摩爾比例使用O種氨基酸2x IOOmM ；3種氨基酸3x 67mM :4種氨基酸4x 50mM ；等等)。將甘草酸(銨鹽，F(xiàn)luka, 50531)溶解在50 %的乙醇(無(wú)水，Sigma-Aldrich, 32205)中以獲得25mM的儲(chǔ)液。將甘草酸在后涂布液中以1 25稀釋，從而得到ImM的濃度。將氨基酸混合物的pH設(shè)為約7. 0 ；并將混合物進(jìn)一步在PBS中稀釋，以使最終氨基酸濃度為200mM。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)板的吸附和后涂層的應(yīng)用；滅菌和加速老化；以及一般性ELISA程序。結(jié)果如圖8所示，向不同的氨基酸后涂層添加甘草酸可將所有后涂層的保護(hù)效果增加至75% 80%的最大值(與未輻射對(duì)照組相比的抗原結(jié)合能力)。甘草酸單獨(dú)作為后涂層不具有保護(hù)效果。^MMA^氨基酸后涂層提供了抵抗逆境條件的保護(hù)，該保護(hù)至少與含有如白蛋白和甘露醇等常規(guī)保護(hù)物質(zhì)的后涂層的保護(hù)相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例3中所述制備氨基酸后涂層。分別以在PBS中稀釋至20g/l和10g/l的濃度使用人白蛋白和甘露醇。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)板的吸附和后涂層的應(yīng)用；滅菌和加速老化；以及一般性ELISA程序。結(jié)果如圖9中所示，氨基酸后涂層提供了保護(hù)效果，取決于所施加的逆境的形式，該保護(hù)效果與基于白蛋白和甘露醇的后涂層的保護(hù)效果相當(dāng)，或者甚至優(yōu)于后者。與未處理的對(duì)照組相比，由五種不同氨基酸QOOmM)和ImM甘草酸組成的氨基酸后涂層在輻射(25kGy)后和在加速老化程序后分別顯示了 80%和85%的抗原結(jié)合能力的保護(hù)效果。輻射(25kGy)后，由白蛋白和甘露醇組成的后涂層顯示了未處理的對(duì)照組的 65%的活性。經(jīng)過(guò)在45°C持續(xù)7天的加速老化之后，通過(guò)白蛋白和甘露醇幾乎未保留活性， 這與不具有任何后涂層的對(duì)照組相似。實(shí)施例5 氨基酸混合物封閉非特異件結(jié)合(例如封閉對(duì)ELISA板的非特異性結(jié)
合)ο實(shí)驗(yàn)如“材料和方法”中所述使L0-MM-3吸附于ELISA板。通過(guò)在環(huán)境溫度使用300 μ 1 封閉液對(duì)孔溫育1小時(shí)來(lái)封閉板表面。作為封閉液，使用10g/l人白蛋白在PBS中的溶液或20g/l的18種氨基酸混合物在PBS中的溶液。之后的ELISA程序如“材料和方法”部分中所述進(jìn)行。結(jié)果
氨基酸混合物也可以封閉對(duì)于表面的非特異性結(jié)合，如圖10中所示。使用18種氨基酸的混合物封閉對(duì)ELISA板的非特異性結(jié)合，而不抑制特異性抗原-抗體相互作用。封閉效率與標(biāo)準(zhǔn)白蛋白封閉液相當(dāng)。實(shí)施例6 氨基酸混合物為諸如DNAse等酶提供抵抗逆境的保護(hù)。實(shí)驗(yàn)DNAse對(duì)ELISA板的吸附和后涂層的應(yīng)用使酶DNAse (Sigma Aldrich, DN25)吸附至 96 孔 ELISA 板(Greiner Bio-one, 655061)的表面。將 DNAse 在 PBS (無(wú) Ca2+/Mg2+，PAA，H15-002)中稀釋至濃度為 lmg/ml。將 100 μ 1酶溶液吸移至各孔中并在5°C溫育過(guò)夜。使用PBS+洗滌該板2次。以相同方式處理四個(gè)孔，以在之后的分析中計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。每孔使用 200 μ 1封閉液封閉對(duì)板的非特異性結(jié)合，并在環(huán)境溫度下溫育1小時(shí)。使用PBS+洗滌該板2次。在每孔移入200 μ 1各后涂布液。使用后涂布液在環(huán)境溫度溫育該板1小時(shí)。棄掉后涂布液，并在環(huán)境溫度干燥該板。封閉液和后涂布液-封閉液20g/l 人白蛋白(Biotest Pharma)在 PBS+ 中的溶液。-后涂布液20g/l 人白蛋白 +10g/l 甘露醇(Serag Wiesner, 219675)在 PBS+ 中的溶液。-封閉液20g/l 氨基酸(Ala, Asp, Arg, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)在 PBS+ 中的溶液。-后涂布液20g/l 氨基酸(Ala, Asp, Arg, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val)+0025mM 甘草酸(銨鹽，F(xiàn)luka，50531)在 PBS+ 中的溶液。經(jīng)涂布的表面的逆境暴露一±夬板通過(guò)輻射滅菌(β，25kGy)。輻射在 Beta-Gamma-Service (德國(guó) Bruchsal) 進(jìn)行。使用一塊未經(jīng)逆境暴露的相似的板充當(dāng)對(duì)照組。保護(hù)效果被計(jì)算為逆境條件后保留的DNAse功能與未處理的對(duì)照組之比。
經(jīng)受逆境的板· 100 功能(％)=-
對(duì)照組的板DNAse功能的檢測(cè)使用PBS+ 洗滌該板 3 次。將 Ds-DNA 標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma Aldrich, D1501)在 PBS (含有Ca2VMg2+, Hyclone, SH3026401)中稀釋至1 μ g/ml。向各孔中添加50 μ 1該DNA溶液并在 37°C溫育 1 小時(shí)。將熒光 DNA 染料 Picogreen (Molecular Probes, P7581)以 1 1000 稀釋(PBS)，并在每孔的DNA溶液中添加150ml該染料。測(cè)量picogreen熒光，將激發(fā)濾光片設(shè)定為485nm，并檢測(cè)530nm處的發(fā)射(Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。熒光信號(hào)與DNA濃度相關(guān)。DNAse活性被確定為DNA的減少，也即熒光信號(hào)的減少。結(jié)果如圖11所示，氨基酸后涂層對(duì)諸如DNAse等酶也提供了抵抗逆境(輻射)的保護(hù)效果。該保護(hù)與基于白蛋白和甘露醇的后涂層的保護(hù)相當(dāng)。輻射(25kGy)后，由18種不同氨基酸QOg/Ι)和0. 25mM甘草酸組成的氨基酸后涂層顯示了與未處理的對(duì)照組相比為83% DNAse活性的保護(hù)效果。輻射(25kGy)后，由白蛋白和甘露醇組成的后涂層顯示了未處理的對(duì)照組的95%的活性。實(shí)施例7 氨基酸后涂層對(duì)諸如IgG英夫利西單抗(Infliximab)等治療抗體提供了抵抗逆境條件的保護(hù)。實(shí)驗(yàn)使治療抗體英夫利西單抗(人源化IgG，抗人TNF-α，Centocor，DD7701504)吸附于ELISA板表面。使用PBS-/-將英夫利西單抗稀釋至1 μ g/ml的濃度，并將100 μ 1該溶液移入至各孔中。在5°C溫育該板過(guò)夜并使用洗滌緩沖劑洗滌該板2次。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行后涂層的應(yīng)用；滅菌和加速老化。英夫利西單抗功能的ELISA檢測(cè)通過(guò)洗滌板3次來(lái)從孔中除去干燥的后涂層。通過(guò)在各孔中移入300 μ 1封閉液 (10g/l的白蛋白在PBS中的溶液)并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)來(lái)封閉ELISA板。洗滌該板3 次。將英夫利西單抗的抗原TNF- α (重組人TNF- α，R&D, Cat 210-TA)稀釋至lng/ml， 并在各孔移入200 μ 1該抗原溶液。在環(huán)境溫度溫育該板1小時(shí)并洗滌3次。通過(guò)檢測(cè)抗體(HRP標(biāo)記的anti-human-TNF- α，R&D, Cat DTA00C)來(lái)檢測(cè)結(jié)合的抗原。使用PBS將檢測(cè)抗體的即用型溶液以1 2稀釋。向各孔中添加200 μ 1，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。將200 μ HRP的即用型ELISA底物溶液(TMB =四甲基聯(lián)苯胺)移入至各孔。在環(huán)境溫度避光溫育該板20分鐘。為停止顯色反應(yīng)，向各孔添加50 μ 1 H2S04(使用蒸餾水以 1 5稀釋)。通過(guò)測(cè)量在波長(zhǎng)為450nm處的吸收檢測(cè)所獲得的黃色。結(jié)果如圖12中所示，不具有甘草酸或具有甘草酸的氨基酸后涂層提供了保護(hù)效果，取決于所施加的逆境的形式，該保護(hù)效果與基于白蛋白和甘露醇的后涂層的保護(hù)效果相當(dāng)， 或者甚至優(yōu)于后者。與未處理的對(duì)照組相比，由18種不同氨基酸(在PBS中20g/l的溶液)組成的氨基酸后涂層在輻射(25kGy)后和在加速老化程序后分別顯示了 85%和90%的抗原結(jié)合能力的保護(hù)效果。與未處理的對(duì)照組相比，通過(guò)向氨基酸后保護(hù)層添加ImM甘草酸，在輻射 (25kGy)后和加速老化程序后，保護(hù)效果分別為92%和95%的抗原結(jié)合能力。輻射(25kGy) 后，由白蛋白和甘露醇組成的后涂層顯示了未處理的對(duì)照組的72%的活性。經(jīng)過(guò)在45°C持續(xù)6天的加速老化之后，通過(guò)白蛋白和甘露醇僅保留15%的活性，這與不具有任何后涂層的對(duì)照組相似。實(shí)施例8 氨基酸后保護(hù)層為核酸(dsDNA)提供抵抗逆境條件的保護(hù)實(shí)驗(yàn)
使Ds-DNA(Sigma，D1501)吸附至ELISA板表面。將DNA溶解在具有ImM EDTA (Fluka，50531)的PBS"-(lmg/ml)中以抑制可能的DNAse活性。使用PBS按照1 64將 DNA稀釋至15 μ g/ml，并將100 μ 1溶液移入至各孔中。在5°C溫育該板過(guò)夜并使用PBS+洗滌該板2次。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行后涂層的應(yīng)用和滅菌。使用Picogreen對(duì)完整的ds-DNA的檢測(cè)通過(guò)洗滌板3次來(lái)從孔中除去干燥的后涂層。向各孔中添加100 μ 1 Picogreen 染料(在 PBS+ 中以 1 1000 稀釋，Molecular Probes, P7581)。立即測(cè)量 picogreen 熒光，將激發(fā)濾光片設(shè)定為485nm，并檢測(cè)530nm處的發(fā)射(Fusion Photometer A153601， PerkinElmer)。熒光信號(hào)與完整的ds_DNA的濃度相關(guān)。結(jié)果如圖13所示，氨基酸后涂層提供了 55% 60%的保護(hù)效果，其不依賴甘草酸或甘露醇的添加。在沒(méi)有后涂層的情況下，當(dāng)使用25kGy輻射時(shí)，完整的ds-DNA的量降低至 20 %。如白蛋白和甘露醇等常用穩(wěn)定物質(zhì)提供了約85 %的保護(hù)。實(shí)施例9 特定氨基酸組合物的保護(hù)效果將20mg 人抗甲型肝炎抗體(Beriglobin (人 IgG，AK)，CSL Behring)和 40mg 保護(hù)組合物溶在水中，使每個(gè)樣品的總體積為525μ 1并將其凍干。然后，將樣品溶解在Iml水中，并使用HAV (甲型肝炎病毒)IgGELISA測(cè)試功能。組成20g精氨酸20g組氨酸20g賴氨酸3g谷氨酸2g色氨酸20g甘氨酸15g丙氨酸0. 2g 吐溫 80Ig甘草酸銨鹽使用NaOH和/或NaCl將pH調(diào)節(jié)至約7. 2。然后，將該溶液進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。將400 μ 1溶液(對(duì)應(yīng)于40mg固體化合物)與125 μ 1 Beriglobin (對(duì)應(yīng)于20mg 抗體)混合。凍干凍干如下進(jìn)行初始冷凍溫度為_(kāi)40°C ；冷凍3小時(shí)后初始真空度為0. ImBar ；以約1. 5°C /小時(shí)的速度升溫23小時(shí)；在6 °C和0. 004mBar下過(guò)夜干燥6小時(shí)。滅菌利用25kGy對(duì)凍干樣品輻射，一份樣品用50kGy β -輻射。
結(jié)果HAV-ELISA的結(jié)果如圖14所示。干燥并滅菌后，獲得白色、無(wú)味、固有穩(wěn)定性的餅狀物。向每種樣品中添加Iml水并監(jiān)視溶解行為。溶解在少于30秒內(nèi)發(fā)生，并且不存在聚集物。甚至M小時(shí)后，也未檢測(cè)到肉眼可見(jiàn)的或用顯微鏡可見(jiàn)的聚集物。結(jié)論與未經(jīng)輻射的對(duì)照組相比，該組合物的應(yīng)用使得Beriglobin的甲型肝炎抗體部分僅有很小的損失。實(shí)施例10 作為穩(wěn)定化合物的不同皂苷的試驗(yàn)。皂苷的結(jié)構(gòu)類型對(duì)于抗體具有穩(wěn)定作用。材料和方法所有實(shí)驗(yàn)都基于相同基本ELISA測(cè)定設(shè)計(jì)。(參見(jiàn)上文)L0-MM-3對(duì)ELISA板的吸附和后涂層的應(yīng)用經(jīng)涂布的表面的逆境暴露L0-MM-3 功能的 ELISA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)于板的吸附和后涂層的應(yīng)用以及滅菌； 和一般性ELISA程序。輻射劑量(電子束)為50kGy。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示。皂苷的結(jié)構(gòu)類型具有增強(qiáng)氨基酸組合的保護(hù)性效果的潛能。優(yōu)選的是使用皂苷甘草酸。實(shí)施例11 包含至少3種不同氨基酸或至少兩種不同氨基酸和如甘草酸等皂苷的穩(wěn)定組合物提供非常好的保護(hù)材料和方法所有實(shí)驗(yàn)都基于相同基本ELISA測(cè)定設(shè)計(jì)。(參見(jiàn)上文)L0-MM-3對(duì)ELISA板的吸附和后涂層的應(yīng)用經(jīng)涂布的表面的逆境暴露L0-MM-3 功能的 ELISA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將氨基酸溶解在0. 5M NaOH (Merck, 106482)或 0. 5M HCl (Merck, 100319)中以獲
得具有最高濃度的儲(chǔ)液。將氨基酸儲(chǔ)液以不同組合混合在一起，使在后涂布液中總氨基酸濃度為20g/l。將氨基酸混合物的pH定為約7.0。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)板的吸附和后涂層的應(yīng)用以及滅菌；和一般性ELISA程序。輻射劑量(電子束)為50kGy。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16所示。在采用50kGy β輻射時(shí)，至少3種氨基酸的組合和2種氨基酸與附加的甘草酸的組合提供了對(duì)固定化抗體的最大保護(hù)(超過(guò)75% )。實(shí)施例12 優(yōu)選的氨基酸組合物在不同逆境條件下提供保護(hù)。
材料和方法所有實(shí)驗(yàn)都基于相同基本ELISA測(cè)定設(shè)計(jì)。(參見(jiàn)上文)L0-MM-3對(duì)ELISA板的吸附和后涂層的應(yīng)用經(jīng)涂布的表面的逆境暴露L0-MM-3 功能的 ELISA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所使用的組合物保護(hù)組合物A(化合物/升)20g精氨酸20g組氨酸20g賴氨酸3g谷氨酰胺2g色氨酸20g甘氨酸15g丙氨酸0. 2g 吐溫 80Ig甘草酸銨鹽使用NaOH和/或HCl將pH調(diào)節(jié)至約7. 2。然后，將該溶液進(jìn)行除菌過(guò)濾。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)于板的吸附和后涂層的應(yīng)用以及滅菌； 和一般性ELISA程序。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖17所示。氨基酸組合物在不同逆境條件下提供保護(hù)。對(duì)于不同劑量的輻射和升溫下的人工老化提供了最佳保護(hù)。對(duì)于Y-輻射或環(huán)氧乙烷滅菌的保護(hù)較小，但具相關(guān)性。實(shí)施例13 氨基酸后涂層在長(zhǎng)期存儲(chǔ)過(guò)程中提供保護(hù)實(shí)驗(yàn)將氨基酸溶解在0.5Μ NaOH(Merck, 106482)或 0· 5M HCl (Merck, 100319)中以獲得具有最高濃度的儲(chǔ)液。將氨基酸儲(chǔ)液混合在一起以使后涂布液中總氨基酸濃度達(dá)到 200mM。這些氨基酸以等摩爾比例使用。18 種氨基酸:Ala, Arg, Asp, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val5 種氨基酸(1) :Asp, Arg, Phe, Ser, Val5 種氨基酸(2) :Ala, Glu, Lys, Thr, Trp2 種氨基酸(1) :Asp，Val2 種氨基酸(2) =Ala, Glu將氨基酸混合物的pH設(shè)為約7. 0 ；并將混合物進(jìn)一步在PBS中稀釋，以使最終濃度為200mM。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)板的吸附和后涂層的應(yīng)用以及滅菌；和一般性ELISA程序。通過(guò)加速老化程序模擬長(zhǎng)期存儲(chǔ)。將板在45°C存儲(chǔ)，并在存儲(chǔ)0、10、 25、41和62天后確定抗體活性。這相當(dāng)于在5°C實(shí)際時(shí)間為0、6、12、M和36個(gè)月的老化。
結(jié)果含有至少5種氨基酸的氨基酸后涂層在長(zhǎng)期存儲(chǔ)過(guò)程中提供保護(hù)。對(duì)于非滅菌樣品而言，在45°C持續(xù)62天后約80%抗原結(jié)合能力得到保留。滅菌樣品(β，25kGy)在45°C 持續(xù)62天后保留其抗原結(jié)合能力的約70%。不考慮滅菌，在存儲(chǔ)過(guò)程中，含有僅2種氨基酸的氨基酸后涂層僅保留有約40%的抗原結(jié)合能力。向后涂布溶液添加ImM甘草酸可增強(qiáng)保護(hù)效果對(duì)于含有至少5種氨基酸和甘草酸的非滅菌樣品而言，在45°C持續(xù)62天后約 90%的抗原結(jié)合能力得到保留。滅菌樣品(β，25kGy)在45°C持續(xù)62天后保留其抗原結(jié)合能力的約80 %。在存儲(chǔ)過(guò)程中，含有2種氨基酸和甘草酸的氨基酸后涂層保留有約70 %的抗原結(jié)合能力。實(shí)施例14 氨基酸后涂層在不同滅菌過(guò)程中提供保護(hù)實(shí)驗(yàn)將氨基酸溶解在0.5M NaOH(Merck, 106482)或 0· 5M HCl (Merck, 100319)中以獲得具有最高濃度的儲(chǔ)液。將氨基酸儲(chǔ)液混合在一起以使后涂布液中總氨基酸濃度達(dá)到 200mM。這些氨基酸以等摩爾比例使用。18 種氨基酸:Ala, Arg, Asp, Gin, Glu, Gly, His, lie, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val5 種氨基酸:Asp, Arg, Phe, Ser, Val2 種氨基酸Asp，Val將氨基酸混合物的pH設(shè)為約7. 0 ；并將混合物進(jìn)一步在PBS中稀釋，以使最終濃度為200mM。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)板的吸附和后涂層的應(yīng)用以及滅菌；和一般性ELISA程序。對(duì)一塊板進(jìn)行輻射(Y，25kGy)。輻射在Beta-Gamma-Service (德國(guó) Bruchsal)進(jìn)行。另一±夬板通過(guò) EO(ΕΤ0 BOl cycle)滅菌；滅菌在 Rose GmbH(德國(guó) Trier) 進(jìn)行。結(jié)果利用Y-輻射滅菌的樣品在使用含有18種氨基酸的氨基酸后涂層保護(hù)時(shí)保留約 85%活性；該效果不會(huì)因使用甘草酸而進(jìn)一步增強(qiáng)；使用5種氨基酸時(shí)保留活性為75%;使用2種氨基酸時(shí)僅保留40%。添加甘草酸改善了使用2種氨基酸的保護(hù)；此處其保留的活性為65%。當(dāng)使用含有18種氨基酸的氨基酸后涂層保護(hù)時(shí)，經(jīng)ETO滅菌的樣品保留約85% 的活性；使用甘草酸不會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)此效果。含有5或2種氨基酸的后涂層僅具有很小的保護(hù)效果；添加甘草酸可以增強(qiáng)邊際保護(hù)。實(shí)施例15 由氨基酸和二肽組成的后涂層提供抵抗高輻射劑量的保護(hù)材料和方法-所有實(shí)驗(yàn)都基于相同基本ELISA測(cè)定設(shè)計(jì)。(參見(jiàn)上文)-L0-MM-3對(duì)ELISA板的吸附和后涂層的應(yīng)用-經(jīng)涂布的表面的逆境暴露-L0-MM-3 功能的 ELISA 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)將氨基酸溶解在0. 5M NaOH (Merck, 106482)或 0. 5M HCl (Merck, 100319)中以獲得具有最高濃度的儲(chǔ)液。將氨基酸儲(chǔ)液混合在一起以使后涂布液中總氨基酸濃度達(dá)到20g/ 1。二肽以10g/l的濃度單獨(dú)使用，和以2g/l的濃度與氨基酸組合使用。7 種氨基酸:Arg, His, Lys, Glu, Trp, Gly, Ala2種二肽甘氨酰酪氨酸(Gly-Tyr)，甘氨酰谷氨酰胺(Gly-Gln)將氨基酸混合物的pH設(shè)定為約7. 0。如“材料和方法”部分所述進(jìn)行L0-MM-3對(duì)板的吸附和后涂層的應(yīng)用以及滅菌；和一般性ELISA程序。輻射劑量(電子束)為50kGy。結(jié)果當(dāng)使用含有僅7種氨基酸的氨基酸后涂層保護(hù)時(shí)，經(jīng)50kGy β -輻射滅菌的樣品保留約60%的活性；該效果在添加如Gly-Tyr等二肽或二肽組合時(shí)得到進(jìn)一步增強(qiáng)。甘草酸不進(jìn)一步增強(qiáng)氨基酸二肽組合的保護(hù)效果。實(shí)施例16 對(duì)玻璃瓶中的白介素-8滅菌，瓶自身是載體。實(shí)驗(yàn)將白介素-8(IL-8,R&D，208-IL)在 PBS(不具有 Ca2+/Mg2+，PAA, H15-002)中稀釋至 ομ g/ml。向玻璃瓶中添加5μ 1該溶液(50ng IL-8)并旋轉(zhuǎn)4小時(shí)，直至干燥。添加 25 μ 1穩(wěn)定溶液氨基酸混合物和ImM甘草酸(銨鹽，F(xiàn)luka, 50531))并旋轉(zhuǎn)/干燥過(guò)夜。利用彡25kGy(i3-輻射)對(duì)瓶滅菌。在冷藏條件下存儲(chǔ)未滅菌的對(duì)照組。測(cè)定從10% ACDA全血中分離嗜中性粒細(xì)胞。利用2ml HES(Grifols 662650)沉降 20ml ACDA血(10%)。將上清液移入至7ml Percoll (L6143)中并以2000x g離心分離20 分鐘。將分離的粒細(xì)胞再懸浮于自體血清中，并將細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)定為0. IO6個(gè)/ml。將陽(yáng)性對(duì)照組5 μ 1 IL-8溶液(50ng)溶解在25 μ 1穩(wěn)定溶液(Α和B)中。向各無(wú)菌瓶中添加Iml PBS (具有Ca2+/Mg2+, Hyclone, SH3026401)(具有自體血清)以溶解干燥的膜。為檢測(cè)樣品的趨化活性，將無(wú)菌和非無(wú)菌瓶中以及對(duì)照組的全部IL-8溶液移入至12孔板中。插入遷移過(guò)濾器(3 μ m, Corning, 3462)，并將500 μ 1粒細(xì)胞懸浮液移入至過(guò)濾器中。將該板在37°C溫育30分鐘。通過(guò)FACS和計(jì)數(shù)珠(Invitrogen，C36950)對(duì)各孔中的細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而檢測(cè)遷移的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果參見(jiàn)圖26若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的滅菌(> 25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為白介素8 = IL8)將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。顯示的是IL8對(duì)于人嗜中性粒細(xì)胞的趨化活性。實(shí)施例17 對(duì)玻璃瓶中的白介素-8滅菌，穩(wěn)定劑自身是載體。實(shí)驗(yàn)將白介素-8(IL_8)在PBS(不具有 Ca2+/Mg2+，PAA，H15-002)中稀釋至 10yg/ml。 將5 μ 1溶液(50ng IL-8)和25 μ 1穩(wěn)定溶液QOg/Ι氨基酸混合物和ImM甘草酸(銨鹽， Fluka, 50531))混合并移入至玻璃瓶中。旋轉(zhuǎn)/干燥該瓶過(guò)夜。
利用彡25kGy的輻射對(duì)瓶滅菌。在冷藏條件下存儲(chǔ)未滅菌的對(duì)照組。測(cè)定從10% ACDA全血中分離嗜中性粒細(xì)胞。利用2ml HES(Grifols 662650)沉降 20ml ACDA血(10%)。將上清液移入至7ml Percoll (L6143)中并以2000x g離心分離20 分鐘。將分離的粒細(xì)胞再懸浮于自體血清中，并將細(xì)胞計(jì)數(shù)設(shè)定為0. IO6個(gè)/ml。將陽(yáng)性對(duì)照組5 μ 1 IL-8-溶液(50ng)溶解在25 μ 1穩(wěn)定溶液(Α和B)中。向各無(wú)菌瓶中添加Iml PBS (具有Ca2+/Mg2+, Hyclone, SH3026401)(含有自體血清)以溶解干燥的膜。為檢測(cè)樣品的趨化活性，將無(wú)菌和非無(wú)菌瓶中的全部IL-8溶液和對(duì)照組移入至 12孔板中。插入遷移過(guò)濾器(3 μ m)，并將500 μ 1粒細(xì)胞懸浮液移入至過(guò)濾器中。將該板在37°C溫育30分鐘。對(duì)各孔中的細(xì)胞計(jì)數(shù)(通過(guò)FACS和計(jì)數(shù)珠)，從而檢測(cè)遷移的細(xì)胞數(shù)。結(jié)果參見(jiàn)圖29若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的滅菌(> 25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為白介素8 = IL8)將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。顯示的是IL8對(duì)于人嗜中性粒細(xì)胞的趨化活性。實(shí)施例18 對(duì)玻璃瓶中的抗小鼠IgG滅菌，穩(wěn)定劑自身是載體。實(shí)驗(yàn)將抗小鼠 IgG(生物素化的，Jackson ImmunoResearch, 115-065-003)在 PBS(不具有 Ca2VMg2+, PAA, H15-002)中稀釋至 4 μ g/ml。將 25 μ 1 (IOOng)該抗體溶液和 25 μ 12χ 濃縮的穩(wěn)定溶液氨基酸混合物和ImM甘草酸(銨鹽，F(xiàn)luka，50531))混合并移入至玻璃瓶中。旋轉(zhuǎn)/干燥該瓶過(guò)夜。利用彡25kGy的輻射對(duì)瓶滅菌。在冷藏條件下存儲(chǔ)未滅菌的對(duì)照組。測(cè)定使用抗原(小鼠IgG，Innovativ Research, Ir-Ms-Gf)涂布 ELISA 板(Greiner Bio-one, 655061)將抗原稀釋至1 μ g/ml，取100 μ 1移入至各孔中并在4°C溫育過(guò)夜。使用洗滌緩沖劑0 濃縮，IrwitrOgen，WB02)洗滌該板2次。使用白蛋白(5%)封閉該板并再洗滌3次。向所有樣品瓶中添加200 μ 1 PBS以溶解干燥的膜(理論上為5 μ g/ml)。使用PBS 將樣品稀釋至lOng/ml。為計(jì)算抗體濃度，制備新鮮抗體的系列稀釋液。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品移入至ELISA板(各自為h 200 μ 1)中，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。向各孔中添加200 μ 1鏈親和素液(以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記， Pierce，211 ，在PBS中稀釋至0. 1 μ g/ml)，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。將 HRP發(fā)色底物TMB (TMB =四甲基聯(lián)苯胺，Invitrogen，00-2023)在H2O中以1 2稀釋，并向各孔中添加200 μ 1。在環(huán)境溫度避光溫育該板15分鐘。為停止顯色反應(yīng)，添加50 μ 1稀 H2S04(使用蒸餾水以1 5稀釋，Merck，1007311000)。在450nm處檢測(cè)板的吸收(Fusion Photometer A153601, PerkinElmer)。結(jié)果
參見(jiàn)圖30若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的存儲(chǔ)和/或滅菌(> 25kGy輻射)過(guò)程中生物分子 (此處為抗小鼠IgG抗體)將失去其大部分生物功能。相反，具有不同氨基酸的穩(wěn)定劑溶液保護(hù)了生物分子。顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。實(shí)施例19 對(duì)抗小鼠IgG滅菌，載體是聚氨酯泡沫。實(shí)驗(yàn)從微孔聚氨酯(PU)泡沫(Smith&N印hew，660U608)沖壓具有規(guī)定直徑(Icm)的樣品。將抗小鼠IgG (生物素化的，Jackson ImmunoResearch, 115-065-003)附著于樣品將抗體在PBS (不具有Ca2+/Mg2+，PAA, H15-002)中或在穩(wěn)定溶液QOg/1氨基酸混合物和ImM 甘草酸(銨鹽，F(xiàn)luka，50531))中稀釋至5 μ g/ml，并使用抗體溶液包被PU樣品。將該樣品在37°C溫育1小時(shí)。除去抗體溶液，并空氣干燥PU樣品2小時(shí)。通過(guò)β -輻射(25kGy)對(duì)樣品滅菌， 并在冷藏條件下存儲(chǔ)未滅菌的對(duì)照組。測(cè)定使用抗原(小鼠IgG，Innovativ Research, Ir-Ms-Gf)涂布 ELISA 板(Greiner Bio-one, 655061)將抗原稀釋至1 μ g/ml，取100 μ 1移入至各孔中并在4°C溫育過(guò)夜。使用洗滌緩沖劑0 濃縮，IrwitrOgen，WB02)洗滌該板2次。使用白蛋白(5%)封閉該板并再洗滌3次。使用PBS包被PU樣品并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。收集樣品溶液，并使用PBS以 1 20稀釋，進(jìn)而以1 4連續(xù)稀釋。為計(jì)算樣品的抗體濃度，制備新鮮抗體的連續(xù)稀釋液。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品移入至ELISA板(各自為h 200 μ 1)中，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。向各孔中添加200 μ 1鏈親和素液(以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記， Pierce，211 ，在PBS中稀釋至0. 1 μ g/ml)，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。將 HRP發(fā)色底物TMB (TMB =四甲基聯(lián)苯胺，Invitrogen，00-2023)在H2O中以1 2稀釋，并向各孔中添加200 μ 1。在環(huán)境溫度避光溫育該板15分鐘。為停止顯色反應(yīng)，添加50 μ 1稀 H2S04(使用蒸餾水以1 5稀釋，Merck，1007311000)。在450nm處檢測(cè)板的吸收(Fusion Photometer A153601, PerkinElmer)。
結(jié)果若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的存儲(chǔ)和/或滅菌(25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)將失去其大部分生物功能。相反，穩(wěn)定劑溶液保護(hù)生物分子?？贵w的回收幾乎為100% (5yg/ml)。顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。實(shí)施例20 對(duì)抗小鼠IgG滅菌，載體是PVA水凝膠。實(shí)驗(yàn)制備7% (m/v)的聚乙烯醇(PVA，Sigma，341584-25G)水溶液(加熱至85°C )。將該溶液冷卻至環(huán)境溫度。將抗小鼠IgG (生物素化的，Jackson ImmunoResearch, 115-065-003) 在PBS中稀釋至200 μ g/ml。水凝膠混合物由以下物質(zhì)組成-6. 75ml PVA 溶液(7% )
-4. 5 μ 1 抗小鼠 IgG (200 μ g/ml)-2. 25PBS或穩(wěn)定溶液G20g/1氨基酸混合物和ImM甘草酸(銨鹽，F(xiàn)luka，50531)) 在PBS中的溶液)將PVA水凝膠注入小型陪替氏皿(直徑35mm，2ml溶液)中。將水凝膠膜空氣干燥48小時(shí)。通過(guò)β-輻射(25kGy)對(duì)樣品滅菌，并在冷藏條件下存儲(chǔ)未滅菌的對(duì)照組。測(cè)定^ffiiiJIC (/]、鼠 IgG, Innovativ Research, Ir-Ms-Gf) ELISA U (Greiner Bio-one, 655061)抗原被稀釋至1 μ g/ml，將100 μ 1移入至各孔中并在4°C溫育過(guò)夜。使用洗滌緩沖劑0 濃縮，IrwitrOgen，WB02)洗滌該板2次。使用白蛋白(5%)封閉該板并再洗滌3次。將PVA水凝膠置入6孔板中并使用PBS (不具有Ca2+/Mg2+，PAA, H15-002)包被。30分鐘、1小時(shí)和2小時(shí)后收集PBS并使用新鮮PBS置換。將樣品的系列稀釋液和標(biāo)準(zhǔn)品移入至ELISA板(各自為h 200μ1)中，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。向各孔中添加200 μ 1鏈親和素液(辣根過(guò)氧化物酶 (HRP)標(biāo)記，Pierce，21126，在PBS中稀釋至0. 1 μ g/ml)，并在環(huán)境溫度溫育1小時(shí)。洗滌該板3次。將HRP發(fā)色底物TMB (TMB =四甲基聯(lián)苯胺，Invitrogen, 00-2023)在H2O中以 1 2稀釋，并向各孔中添加200 μ 1。在環(huán)境溫度避光溫育該板15分鐘。為停止顯色反應(yīng)，添加50μ 1稀壓504 (使用蒸餾水以1 5稀釋，Merck，1007311000)。在450nm處檢測(cè)
白勺口及& (Fusion Photometer A153601，PerkinElmer)。結(jié)果若不添加穩(wěn)定劑，則在后續(xù)的存儲(chǔ)和/或滅菌(25kGy輻射)過(guò)程中生物分子(此處為抗小鼠IgG抗體)將失去其大部分生物功能。相反，穩(wěn)定劑溶液保護(hù)生物分子。洗脫的抗體的回收率非常高。顯示的是與抗原的特異性結(jié)合。
3權(quán)利要求
1.一種組合物在使固體載體上固定的生物分子穩(wěn)定中的應(yīng)用，所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸，(b)至少兩種不同氨基酸和皂苷，或者(c)至少一種二肽或三肽。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中所述生物分子可逆地附著在所述固體載體上。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其中使生物分子穩(wěn)定包括穩(wěn)定生物分子的結(jié)構(gòu)和/ 或活性、增加生物分子的儲(chǔ)存期和/或保護(hù)生物分子抵抗逆境介導(dǎo)的損傷。
4.如權(quán)利要求1 3中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述組合物包含至少4種或至少5種不同氨基酸。
5.如權(quán)利要求1 4中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述組合物包含以下每組中的至少一種氨基酸(a)具有非極性脂肪族R基團(tuán)的氨基酸；(b)具有極性不帶電荷的R基團(tuán)的氨基酸；(c)具有帶正電荷的R基團(tuán)的氨基酸；(d)具有帶負(fù)電荷的R基團(tuán)的氨基酸；和(e)具有芳香性R基團(tuán)的氨基酸。
6.如權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述組合物中含有的氨基酸選自(a)丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、蘇氨酸和色氨酸；(b)天冬氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸和纈氨酸；(c)脯氨酸、絲氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、蘇氨酸、苯丙氨酸；(d)酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、纈氨酸；和(e)精氨酸、甘氨酸、組氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、色氨酸。
7.如權(quán)利要求1 6中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述組合物在至少兩種或至少三種氨基酸的混合物中包含低于1干重％的半胱氨酸。
8.如權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述組合物還包含低于1%、更優(yōu)選低于0. 3%的吐溫、優(yōu)選吐溫80。
9.如權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中所述皂苷為甘草酸或其衍生物。
10.一種生產(chǎn)被穩(wěn)定的生物分子的方法，所述方法包括(a)將所述生物分子附著于固體載體，和(b)將所述生物分子包埋在權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的組合物中，從而使得所包埋的生物分子被權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的組合物部分地或完全地包被。
11.一種生產(chǎn)其上附著有生物分子的固體載體的方法，所述方法包括以下步驟(a)將所述生物分子附著于所述固體載體，和(b)將步驟(a)的載體在權(quán)利要求1 9中任一項(xiàng)所述的組合物中溫育。
12.如權(quán)利要求10或11所述的方法，所述方法還包括(c)對(duì)所述固體載體進(jìn)行干燥。
13.如權(quán)利要求10 12中任一項(xiàng)所述的方法，所述方法還包括在步驟(b)后或在步驟 (c)后對(duì)所述固體載體滅菌。
14.一種固體載體，所述固體載體可通過(guò)權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)，或者是通過(guò)權(quán)利要求11 13中任一項(xiàng)所述的方法生產(chǎn)的。
15.如權(quán)利要求14所述的固體載體，其中所述生物分子為蛋白、肽、核酸、糖類、脂質(zhì)、 脂肪酸、多元醇及其組合或修飾物，其中所述蛋白優(yōu)選為抗體、酶、受體、細(xì)胞因子、激素、膜蛋白、生長(zhǎng)因子、白蛋白、球蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或凝血因子。
16.如權(quán)利要求14或15所述的固體載體，其中所述生物分子特異性地結(jié)合指示疾病的標(biāo)志物蛋白、非細(xì)胞病原體、細(xì)胞或毒素。
17.如權(quán)利要求14 16中任一項(xiàng)所述的固體載體在醫(yī)療裝置制備中的應(yīng)用。
18.如權(quán)利要求17所述的應(yīng)用，其中所述醫(yī)療裝置為植入物、管、導(dǎo)管、支架、管、傷口敷料或體外循環(huán)中所使用的醫(yī)療裝置。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述載體的滅菌通過(guò)環(huán)氧乙烷、β-輻射、Y-輻射、χ-射線、熱滅活、高壓滅菌或等離子滅菌進(jìn)行。
20.一種診斷疾病的方法，所述方法包括以下步驟(a)在適當(dāng)條件下將獲自患者的樣品與權(quán)利要求16所述的固體載體接觸，以使附著于所述載體上的生物分子特異性地結(jié)合所述指示疾病的標(biāo)志物蛋白、所述非細(xì)胞病原體、所述細(xì)胞或所述毒素；和(b)檢測(cè)所述指示疾病的標(biāo)志物蛋白、所述非細(xì)胞病原體、所述細(xì)胞或所述毒素是否已結(jié)合所述生物分子。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種組合物在使固體載體上固定的生物分子穩(wěn)定中的應(yīng)用，所述組合物包含(a)至少三種不同氨基酸，(b)至少兩種不同氨基酸和皂苷，或者(c)至少一種二肽或三肽。本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)被穩(wěn)定的生物分子的方法，所述方法包含將生物分子包埋在本發(fā)明的組合物中，并涉及一種生產(chǎn)其上附著有生物分子的固體載體的方法。本發(fā)明還涉及一種可通過(guò)或者通過(guò)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的固體載體，和一種利用本發(fā)明的載體診斷疾病的方法。
文檔編號(hào)C07K17/00GK102448992SQ201080023348
公開(kāi)日2012年5月9日 申請(qǐng)日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月31日
發(fā)明者A·布魯爾, 延斯·阿爾特里克特, 斯特凡·馬格拉夫, 馬丁·肖爾茨 申請(qǐng)人:白血球保健股份有限公司