專利名稱：一種植物抗鹽蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中一個(gè)植物抗鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別涉 及利用該基因增強(qiáng)植物抗鹽性的方法。
背景技術(shù)：
糧食問題是當(dāng)今世界所面臨的極大難題之一。通過提高單產(chǎn)或擴(kuò)大種植面積、增 加農(nóng)業(yè)投入改造中低產(chǎn)田等途徑來增加糧食產(chǎn)量都會(huì)碰到需要克服逆境限制或減輕逆境 危害的問題。因此，認(rèn)識(shí)植物對(duì)逆境的反應(yīng)機(jī)制，提高植物的抗逆性，已成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食 品安全進(jìn)一步研究的重點(diǎn)，倍受世界各國(guó)政治界和學(xué)術(shù)界的關(guān)注，也是當(dāng)前生命科學(xué)研究 白勺^^ ； ^^ ο土壤鹽堿化是影響限制作物生長(zhǎng)的兩個(gè)重要逆境因子，也是農(nóng)作物減產(chǎn)的重要影 響因素，因此尋找新的抗鹽功能基因并闡明其功能具有重要的理論及實(shí)踐意義。除了傳統(tǒng) 的育種方法外，利用基因工程技術(shù)來提高作物抗鹽能力具有重要的理論和經(jīng)濟(jì)意義。擬南芥是一種模式植物，廣泛用于植物遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)等研究 領(lǐng)域。擬南芥的大多數(shù)基因在其它植物中都能找到，有關(guān)擬南芥的任何發(fā)現(xiàn)都能應(yīng)用于 其它植物研究。因此，對(duì)擬南芥抗鹽分子生物學(xué)機(jī)制的研究對(duì)特定區(qū)域提高作物的產(chǎn)量 具有重要的理論與經(jīng)濟(jì)意義。擬南芥基因組已完全測(cè)序，根據(jù)擬南芥測(cè)序數(shù)據(jù)庫(靈 arabidopsis.org)尋找和發(fā)現(xiàn)新的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的功能基因是國(guó)際植物學(xué)研究領(lǐng)域 的熱點(diǎn)之一，也是不同國(guó)家之間科技競(jìng)爭(zhēng)的焦點(diǎn)。擬南芥共有約1.3億個(gè)堿基對(duì)，2. 9萬個(gè) 基因。目前大部分基因的功能還不清楚，利用突變技術(shù)研究基因功能已成為一種有效的方 法。通過對(duì)突變體的研究，發(fā)現(xiàn)了一些抗鹽基因的功能，如S0S1、S0S2、S0S3、NHXU HKTl寸。根據(jù)擬南芥數(shù)據(jù)庫公布的基因組序列，發(fā)現(xiàn)鹽處理HIS1-3基因敲除植株表現(xiàn)為 耐受，這表明該表明HIS1-3基因涉及抗鹽性的調(diào)控。為此，我們研究了該基因功能，并發(fā)現(xiàn) 該基因具有調(diào)控植物耐鹽的作用。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)了一種新的植物抗鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因。本發(fā)明所提供 的植物耐鹽及降低植物鹽吸收相關(guān)蛋白的編碼基因，名為HIS1-3(AT2G18050)，來源于哥倫 比亞野生型的擬南芥，其蛋白是具有下述氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)序列表中的SEQ ID No :2，序列表中的序列2由167個(gè)氨基酸殘基組成。HIS1-3的cDNA基因，選自下述核甘酸序列之一；(1)序列表中 SEQ ID No 1 的 DNA 序列；(2)編碼序列表中SEQ ID No 2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；(3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列雜交的核甘酸序 列；
(4)與序列表中SEQ ID No 1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且編碼相同 功能蛋白質(zhì)的DNA序列。序列表中的序列1由763個(gè)堿基組成，其開放閱讀框架(ORF)為自5’端第46位 至549位堿基，編碼序列SEQ ID No :2的蛋白質(zhì)。含有本發(fā)明HIS1-3的表達(dá)載體，細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增 HIS1-3中任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用該基因增強(qiáng)植物抗鹽性的方法。本發(fā)明所提供的增強(qiáng)植物抗鹽性的方法，是抑制植物中的上述植物抗鹽性相關(guān)蛋 白編碼基因的表達(dá)。抑制植物中的上述植物抗鹽性相關(guān)蛋白編碼基因HIS1-3的表達(dá)可通過多種方法 實(shí)現(xiàn)，如植物病毒載體介導(dǎo)基因沉默的方法，反義核酸技術(shù)沉默基因的方法，siRNA介導(dǎo)的 基因沉默方法等。本發(fā)明抑制基因表達(dá)的方法并不限于上述幾種方法，只要能抑制HIS1-3 表達(dá)均可。利用任何一種植物基因敲除技術(shù)，將此基因敲除(或沉默)后，植物表現(xiàn)為抗鹽。本發(fā)明的HIS1-3基因或其反義核酸在構(gòu)建到植物表達(dá)載體中時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始 核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物 進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所使用的載體進(jìn)行加工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、螢光 素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素，卡那霉素等)。被轉(zhuǎn)化的植物宿主既 可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、油菜、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草 坪草或苜宿等。攜帶有本發(fā)明HIS1-3基因的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物 病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或 組織，并將轉(zhuǎn)化的植物經(jīng)組織培育成植株。本發(fā)明的植物抗鹽相關(guān)蛋白及其編碼基可為農(nóng)作物抗鹽育種提供基因與技術(shù)的 支持。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的說明。
圖1-A-1-D為hisl-3、野生型植株豎立培養(yǎng)，直接點(diǎn)種于含有或不含有鹽(NaCl) 的培養(yǎng)基上在正常光照條件下豎直培養(yǎng)20天的比較照片，I-EU-F為統(tǒng)計(jì)的量化指標(biāo) (I-AMS ； I-B 50mM NaCl ； I-C 75mM NaCl ； I-D IOOmM NaCl ； 1-E 根長(zhǎng)；I-F 鮮重)。圖2-A-2-D為his 1-3、野生型植株在IOOmM NaCl條件處理一周，在正常培養(yǎng)條件 下回復(fù)一周后表型對(duì)比照片0-A、2-B處理前野生型和hisl-3植株；2-C、2-D回復(fù)后野生 型和hisl-3植株)。圖3-A-3-D為hisl_3、野生型植株在用75mM NaCl處理后，植株內(nèi)鈉、鉀含量以及 鈉鉀比的比較(3-A地下部分鈉含量的比較；3-B地上部分鈉含量的比較；3-C地下部分鉀 含量的比較；3-D地上部分鉀含量的比較；3-E地下部分鈉-鉀比的比較)。圖4為hisl-3、野生型植株鹽脅迫條件下相關(guān)基因的表達(dá)水平。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、HIS1-3及其編碼基因的獲得以野生型哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的幼苗約50_100mg為材料，用Trizol提取其總 RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè) RNA 濃度。按 RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas公司)試劑盒說明書，以提取的總RNA為模板，合成cDNA第一條鏈。以提 取出來的第一條鏈cDNA為模板，進(jìn)行如下PCR反應(yīng)20μ 1反應(yīng)體系，內(nèi)含IOXPCR緩沖 液 2μ 1，dNTPs (IOmM)混合物 0. 4 μ 1，引物 1 禾口弓|物 2 各 2μ 1，Tag 酶(5U/μ 1) 0. 2 μ 1， 其余加雙蒸水至 20 μ 1。其中，引物 1 5，-ACCACCACTCATCCTCCATACTTT-3 ‘；引物 2 5' -TCTCGCCTTCTTCACTTTCCTCT-3‘。在 Life Express 基因擴(kuò)增儀上擴(kuò)增先 94°C預(yù)變性 3min，再 94°C 30sec,54°C 30sec,72°C 60sec，共計(jì) 30 個(gè)循環(huán)，最后 72°C延伸 lOmin，將獲得 的PCR產(chǎn)物在1 % (m/v)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。將PCR得到的cDNA片段連接于pGEM_T載 體，得到含有目的片段的載體PT-HIS1-3，進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果表明PCR得到的cDNA片段具 有序列表中序列SEQ ID No 1的DNA序列，為HIS1-3的cDNA基因，由763個(gè)堿基組成，其 編碼序列為自5’端第46位堿基到第549位堿基，編碼具有序列表中序列SEQ ID No 2的 氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。實(shí)施例2、培育抗鹽性增強(qiáng)的擬南芥1、HIS1-3基因被敲除的純合突變體hisl-3的獲得
從美國(guó)擬南芥種質(zhì)資源中心獲得了 T-DNA插入突變體種子(SAIL_799_A07 ； http://www.arabidopsis.org/servlets/TairObject ？ type = germplasm&id = 1006546836)。為鑒定HIS1-3基因被敲除的純合突變體，播種SAIL_799_A07種子并提取單 株植株DNA，以此為模板，用3對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，引物ILBl :5’ -GCCTTTTCAG AAATGGATAAATAGCCTTGCTTCC-3，引物 2 :HIS 1-3-LP 5，-GACCGAAAGGAGGAGCTAATG-3，，引物 3 :HISl-3-RP 5，-AAGATGATAACGAGGCAGCAG-3，。根據(jù)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，獲 得HIS1-3基因被敲除的純合突變體hisl-3。從表型來看，該突變體與野生型(WT)植株在 正常生長(zhǎng)條件下沒有顯著差異(圖1-A)，用該基因的cDNA序列構(gòu)建35S強(qiáng)動(dòng)子的過表達(dá)載 體并轉(zhuǎn)化突變體，該轉(zhuǎn)基因植株形態(tài)上恢復(fù)了野生型表型，在鹽脅迫條件下也恢復(fù)了野生 型植株癥狀，證實(shí)了該基因確實(shí)控制抗鹽性狀。2、hisl-3與野生型植株的抗鹽性比較將野生型(WT)與hisl-3同時(shí)播種于直徑為90mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基分別為加鈉 和不加鈉的固體培養(yǎng)基，豎立培養(yǎng)或者水平培養(yǎng)置于22°C恒溫光照(光周期為16小時(shí)光 照，8小時(shí)黑暗)培養(yǎng)。培養(yǎng)20天后，可以觀察到在正常培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的WT和hisl-3在 表型、鮮重、根長(zhǎng)方面均無顯著差異。在植株直接點(diǎn)種或者移栽后在含有鈉的培養(yǎng)基上培 養(yǎng)，hisl-3都表現(xiàn)出明顯的鹽耐受的性狀。在75mM，IOOmM NaCl脅迫下，hisl-3的鮮重和 根長(zhǎng)明顯比WT高。上述結(jié)果表明，hisl-3較WT對(duì)鹽脅迫明顯耐受。3、hisl-3與野生型植株的鈉積累比較對(duì)鹽處理的WT和hisl-3植株體內(nèi)的鈉-鉀含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)hisl-3植株體 內(nèi)鈉積累明顯低于WT，而鉀含量無顯著差異；同時(shí)野生型的Na+/K+明顯高于hisl-3，表明 hisl-3植株較WT不易積累Na+，對(duì)Na+有一定的耐受性。
4、鹽處理?xiàng)l件下hisl-3與野生型植株相關(guān)基因表達(dá)比較對(duì)鹽處理的WT和hisl-3植株體內(nèi)的相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)hisl-3植 株體內(nèi)SOS家族基因及NHXl基因明顯高于WT，而HKTl基因表達(dá)沒有明顯差異，表明hisl-3 植株對(duì)鹽離子響應(yīng)可能與SOS家族基因的激活有關(guān)。
權(quán)利要求
1.編碼有序列表SEQID No :1DNA序列或SEQ ID No :2的氨基酸序列的植物蛋白在調(diào) 控植物耐鹽性的應(yīng)用。
2.一種增強(qiáng)植物抗鹽性的調(diào)控方法其特征在于通過抑制植物體內(nèi)編碼有序列表 SEQID No 1的DNA序列或SEQ ID No 2的氨基酸序列的植物蛋白編碼基因的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種增強(qiáng)植物抗鹽性的調(diào)控方法，其特征在于抑制所述植 物蛋白編碼基因表達(dá)的方法包括植物病毒載體介導(dǎo)基因沉默的方法，或者反義核酸技術(shù)沉 默基因的方法，或者siRNA介導(dǎo)的基因沉默方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種編碼有序列表SEQ ID No1 DNA序列或SEQ ID No2的氨基酸序列的植物蛋白在調(diào)控植物耐鹽性的應(yīng)用。本發(fā)明利用該抗鹽蛋白的編碼基因增強(qiáng)植物抗鹽性，如抑制植物中上述植物耐鹽性相關(guān)蛋白的編碼基因的表達(dá)，為耐鹽性農(nóng)作物育種提供基因與技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C07K14/415GK102051364SQ201010583400
公開日2011年5月11日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者呂申超, 曹樹青, 江力, 袁懷波 申請(qǐng)人:合肥工業(yè)大學(xué)