專利名稱：一種別藻藍蛋白標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備 方法，屬于免疫熒光檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
免疫熒光檢測法是一種歷史悠久的標(biāo)記分析法，兼具抗原、抗體反應(yīng)的特異性及 熒光檢測的靈敏性，廣泛應(yīng)用于疾病檢測和生物學(xué)研究中。免疫熒光檢測法的特異性和敏 感性依賴于熒光染料、抗體及熒光探針的屬性和質(zhì)量。實際應(yīng)用時，由于血清和其他生物樣 品發(fā)射波長為400-600nm的本底熒光，與常用的FITC等傳統(tǒng)熒光染料的熒光發(fā)射光譜重 疊，嚴重降低熒光檢測的靈敏度，造成一段時期內(nèi)熒光檢測法發(fā)展緩慢。藻膽蛋白是存在于紅藻和藍藻細胞中的一類水溶性的色素蛋白的總稱，是藻類捕 光天線復(fù)合物的重要組成部分，能夠高效捕獲并傳遞光能。藻膽蛋白分為藻紅蛋白(PE)、 藻藍蛋白(PC)、別藻藍蛋白(APC)和藻紅藍蛋白(PEC)四大類，具有水溶性大、無毒性、穩(wěn) 定性好、熒光量子產(chǎn)率高、斯托克位移大、熒光明亮、熒光不易淬滅等優(yōu)點，是優(yōu)秀的熒光染 料。藻膽蛋白應(yīng)用于熒光檢測，極大地提高了熒光檢測的靈敏度，促使多色熒光檢測和能量 共振轉(zhuǎn)移(FRET)熒光探針檢測成為現(xiàn)實。別藻藍蛋白(APC)的穩(wěn)定態(tài)為(α β )3，分子量約為IlOkDa, Amax = 620_650nm， Em = 660nm，摩爾消光系數(shù)為7 X IO5CnT1M-1,熒光量子產(chǎn)率為68%。APC是藻膽蛋白中發(fā)射 熒光波長最大的一類，能夠發(fā)射明亮的紅色熒光，極易與生物質(zhì)本底的藍色或綠色熒光區(qū) 分，因此APC幾乎不受生物質(zhì)本底熒光影響，熒光檢測靈敏度明顯提高，APC的檢測靈敏度 是cy5的7倍。APC是少有的長波長發(fā)射的熒光染料，紅光激發(fā)紅光發(fā)射，促進了 633nm氦 氖激光器的應(yīng)用。APC是優(yōu)秀的發(fā)射紅色熒光的染料，但由于APC分離純化困難、穩(wěn)定性差，蛋白質(zhì) 交聯(lián)時難以定量控制，造成APC標(biāo)記得率低，生產(chǎn)成本高，甚至造成APC失活、熒光喪失，限 制了這一優(yōu)秀染料在臨床檢測中的應(yīng)用。國內(nèi)外尚沒有APC標(biāo)記熒光抗體應(yīng)用于動物疫病 檢測的報道。本發(fā)明采用適宜摩爾比的化學(xué)交聯(lián)劑SPDP分別將APC、抗抗體衍生，然后定量 交聯(lián)高效制備了 APC標(biāo)記的熒光抗抗體，可作為通用熒光探針用于雞或豬傳染病的間接免 疫熒光檢測。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種別藻藍蛋白(APC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法。本發(fā)明采用的螺旋藻別藻藍蛋白(APC)是優(yōu)秀的熒光染料，具有無毒性、水溶性 大、熒光明亮且不易淬滅等特點，檢測靈敏度顯著高于傳統(tǒng)的FITC等熒光染料。APC在熒光 染料中獨樹一幟，在波長550-650nm的光激發(fā)下，APC能發(fā)射明亮的紅色熒光，是少有的發(fā) 射長波長熒光染料，而且APC等紅色熒光染料的發(fā)現(xiàn)促進了 633nm氦氖激光器在熒光檢測 中大量應(yīng)用。
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APC的組成和晶體結(jié)構(gòu)特點決定了其穩(wěn)定性低于其它藻膽蛋白，因此交聯(lián)時控制 使用交聯(lián)劑的濃度是關(guān)鍵，交聯(lián)劑濃度不僅影響交聯(lián)得率還影響熒光特性。本發(fā)明選擇 SPDP與APC和抗抗體的摩爾比分別為20-50 U50-100 1，衍生后的APC與抗體以摩 爾比1-2 1交聯(lián)，制備的APC標(biāo)記的熒光抗抗體交聯(lián)效率高、純度高、熒光明亮、抗體活性 好、穩(wěn)定性好。本發(fā)明的解決方案如下別藻藍蛋白(APC)的制備APC為采用陰離子交換層析法由鈍頂螺旋藻 (Spirulina platensis)中分離純化。純化步驟為藻體細胞加入5倍體積(v/w)的2OmM 磷酸緩沖液(PH6. 8-7. 0)，反復(fù)凍融3次，4°C IOOOOrpm離心，上清液中加入硫酸銨至終濃 度為60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，離心，沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH7)中，用20mM 的磷酸緩沖液(PH7)透析，透析液經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱層析， 離子交換柱經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5. 0，含50mM NaCl)預(yù)平衡，洗脫液為20mM醋酸緩沖液 (pH3. 6，含50mM NaCl)，洗脫速度為60mL/h，收集天藍色液體即為純化的螺旋藻別藻藍蛋 白。純化的APC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃 度為 5-10mg/mLoAPC標(biāo)記熒光抗抗體的制備抗抗體(抗雞IgG抗體、抗豬IgG抗體)購自Sigma 公司，電泳檢測純度達電泳純，對流免疫電泳法檢測抗抗體具有良好的生物學(xué)活性，使用時 用PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5-10mg/ml。APC與抗抗體的交聯(lián)采用蛋白質(zhì)交聯(lián)法技術(shù)，利 用異型雙功能交聯(lián)劑SPDP分別在APC、抗抗體上衍生吡啶二硫基團，然后用DTT還原抗抗體 的衍生物為其引入游離-SH，將攜帶吡啶二硫基的APC衍生物與攜帶巰基的抗抗體按一定 摩爾比交聯(lián)制備熒光抗抗體。SPDP與APC、抗抗體的摩爾比分別為20-50 1,50-100 1， DTT與衍生抗體的摩爾比為50-100 1，SPDP衍生的APC與帶-HS的抗抗體再以摩爾比 1-2 1液相交聯(lián)制備APC標(biāo)記的熒光抗抗體。APC標(biāo)記的熒光抗抗體的高效純化和交聯(lián)效率分析液相色譜工作站上采用HPLC 法進行熒光抗抗體的純化和交聯(lián)效率分析，流動相為50mM pH7. 5的PBS，流速0. 5mL/min, 檢測波長190-800nm。采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號為TSK G3000sw (規(guī)格 7. 5mmX60cm)，熒光標(biāo)記抗抗體最先被洗脫下來(附圖1)。收集洗脫峰，進行光譜學(xué)、抗體 活性、電泳檢測。目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫峰面積占所有洗脫峰面積的比例即為交聯(lián)得率。APC標(biāo)記熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計上測定， 掃描波長區(qū)間250-700nm。吸收光譜檢測可判定交聯(lián)是否成功及交聯(lián)反應(yīng)是否導(dǎo)致APC 變性。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計上測定，激發(fā)波長580·，熒光掃描范圍為 600-700nmo APC標(biāo)記熒光抗抗體在紫外區(qū)的吸光度明顯高于對照APC，吸收峰位置相同，這 是因為APC表面交聯(lián)了 280nm有較強的光吸收的抗抗體分子，而在450-700nm區(qū)間，交聯(lián)物 的吸收光譜與APC的吸收峰及吸光度相似，這是因為抗抗體在此范圍內(nèi)無光吸收。APC標(biāo)記 光抗抗體與對照APC在580nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于660nm，沒有發(fā)生 斯托克位移改變，仍具有APC的特征熒光發(fā)射光譜，且熒光亮度無明顯降低(附圖2)。APC標(biāo)記熒光抗抗體的效價檢測對流免疫電泳法檢測APC標(biāo)記熒光抗抗體的免 疫學(xué)活性。APC標(biāo)記熒光抗抗體與雞IgG形成天藍色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察 到沉淀線的位置(附圖3)。天藍色免疫沉淀線的形成進一步說明抗抗體與APC交聯(lián)成功，同時也說明交聯(lián)反應(yīng)對抗抗體的免疫學(xué)活性影響不大，交聯(lián)物仍保留較高的抗體活性。APC標(biāo)記熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上進行，分 離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%，218V恒壓電泳。用0. 25% (w/v)考馬斯亮藍R-250 染色，脫色后觀察結(jié)果。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)APC標(biāo)記熒光抗抗體既具有APC的α、β亞基 條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶(附圖4)，電泳結(jié)果證實APC與抗抗體交聯(lián)成功。APC標(biāo)記熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的APC標(biāo)記熒光抗抗體中加入0. 02%疊 氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價，觀察熒光亮度和抗體活性 的變化。研制的APC標(biāo)記熒光抗抗體在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光強 度保持不變，隨后隨著保存時間推移熒光強度緩慢降低，但降幅較小。熒光抗抗體4°C保存 90天抗體效價維持在5Log 2，隨后抗體效價隨保存時間推遲而緩慢降低(附圖5)?？傊?，APC標(biāo)記熒光抗抗體發(fā)射明亮紅色熒光，4°C保存60天熒光亮度和抗體活性 無衰減，可作為通用熒光探針用于雞、豬等動物傳染病的間接免疫熒光檢測，省去了直接免 疫熒光檢測時需要針對每種病原制備熒光標(biāo)記抗體的麻煩，采用間接免疫熒光抗體即可方 便地進行雞、豬等畜種的傳染病的病原的免疫熒光檢測，而且抗抗體可具有信號放大功能。
附圖1為APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的HPLC純化圖。液相柱型號為TSK G3000sw，流動相為50mM pH7. 5的PBSr1^iI 0. 5mL/min,APC標(biāo)記熒光抗抗體的洗脫時間為 19. 57min，抗抗體和APC的洗脫時間分別為27. 32,31. 26min。附圖2為APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體(虛線)及對照APC(實線)的吸收光譜 (A)和熒光光譜(B)。APC標(biāo)記熒光抗抗體在紫外區(qū)的吸光度明顯高于對照APC，吸收峰位 置相同，在450-700nm區(qū)間，交聯(lián)物的吸收光譜與APC的吸收峰及吸光度相似。APC標(biāo)記熒 光抗抗體與對照APC在580nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于660nm，沒有發(fā)生 斯托克位移改變，仍具有APC的特征熒光發(fā)射光譜，且熒光亮度無明顯降低。附圖3為APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體與雞IgG的對流免疫電泳。APC標(biāo)記熒光 抗抗體與雞IgG形成天藍色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察到沉淀線的位置。 附圖4為APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的SDS-PAGE電泳。APC標(biāo)記熒光抗抗體既 具有APC的α、β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶。附圖5為不同保存時間的APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的熒光亮度(A)和抗體活 性⑶。APC標(biāo)記熒光抗抗體在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光強度保持不 變，隨后隨著保存時間推移熒光強度緩慢降低。熒光抗抗體4°C保存90天抗體效價維持在 5Log 2，隨后抗體效價隨保存時間推遲而緩慢降低。
具體實施例方式實施方式1 :APC標(biāo)記的抗雞IgG熒光抗抗體的制備方法別藻藍蛋白(APC)的制備APC由鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)中分 離純化。藻體細胞加入5倍體積(V/w)20mM磷酸緩沖液(pH6. 8-7.0)，反復(fù)凍融3次， 40C IOOOOrpm離心，上清液中加入硫酸銨至終濃度為60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，離心， 沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH7)中，20mM的磷酸緩沖液(pH7)透析，透析液上DEAE
5Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱層析，離子交換柱經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5. 0，含 50mM NaCl)預(yù)平衡，洗脫液為20mM醋酸緩沖液(pH3.6，含50mM NaGl)，洗脫速度為60mL/ h，收集天藍色液體即為純化的螺旋藻別藻藍蛋白。純化的螺旋藻APC純度達電泳純，純度 指數(shù)A650A280 >5，結(jié)構(gòu)式為(α β)3，分子量約為IlOkDa,最大吸收峰位于650歷，620歷處 有一肩峰，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于660nm，純化的APC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為5-10mg/mL。APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的制備抗雞IgG抗體購自Sigma公司，用20mM磷酸 緩沖液(PH6. 8-7. 0)透析，調(diào)整抗體濃度為8mg/mL。交聯(lián)過程為準(zhǔn)確稱取SPDP，以DMSO 溶解配制SPDP母液。將SPDP按摩爾比分別為50 UlOO 1與APC、抗雞IgG抗體混勻， 鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按100 1的摩爾比 與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除去多余的DTT?？箍贵w-HS與APC 衍生物以摩爾比1 2混勻，鋁箔封好后于20-25°C振蕩反應(yīng)20h。用10mg/ml的NEM溶液 20ul封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。反應(yīng)中的NEM不用除去。APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體的純化和交聯(lián)效率分析液相色譜工作站上采 用HPLC法分析交聯(lián)效率和純化，流動相為50mM PBS pH 7. 5，流速0. 5mL/min,檢測 波長190-800nm。采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號TSK G3000sw(規(guī)格 7. 5mmX60cm)。洗脫順序依次為熒光抗抗體、游離的抗抗體、游離的APC，洗脫時間分別出現(xiàn) 在19. 57,27. 32,31. 26min(附圖1)。收集19. 57min出現(xiàn)的洗脫峰，即為APC標(biāo)記抗雞IgG 熒光抗抗體。第一個洗脫峰的面積占所有洗脫峰面積的比例即為交聯(lián)效率，本法制備的熒 光抗抗體的交聯(lián)效率為92%。APC標(biāo)記熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計上測定，掃 描波長區(qū)間250-700nm。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計上測定，激發(fā)波長580nm，熒 光掃描范圍為600-700nm。在紫外區(qū)，APC標(biāo)記熒光抗抗體的吸光度明顯高于對照APC，吸 收峰位置相同，這是因為APC表面交聯(lián)了抗抗體分子，而抗抗體在280nm有較強的光吸收； 450-600nm范圍內(nèi)，交聯(lián)物的吸收光譜與對照APC的吸收峰位置及吸光度無差別，因為抗抗 體在此范圍內(nèi)無光吸收。通過吸收光譜檢測可判定交聯(lián)成功，同時交聯(lián)反應(yīng)沒有導(dǎo)致APC 變性。APC標(biāo)記熒光抗抗體與對照APC在580nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于 660 nm，具有APC的特征熒光發(fā)射光譜，沒有發(fā)生斯托克位移的改變，且熒光亮度無明顯降 低(附圖2)。APC標(biāo)記熒光抗抗體的效價檢測對流免疫電泳法檢測APC標(biāo)記熒光抗抗體的免 疫學(xué)活性。取10-15mL熔化的的離子瓊脂(0.03M pH 8. 6的巴比妥緩沖液配制)趁熱 倒在電泳板槽中，待冷卻后打孔?？字睆郊s為4mm，孔間距約為5mm。打孔后在酒精燈上烘 烤背面，使瓊脂層與電泳板貼緊。用生理鹽水稀釋雞IgG為0. 5mg/mL,吸取20_40uL注于 正極端各孔；用生理鹽水稀釋APC標(biāo)記熒光抗抗體成lmg/mL，吸取20_40uL，注于負極端孔 中。在電泳板正、負電極端與電極槽緩沖液間用濾紙搭橋，150V穩(wěn)壓電泳4h。APC標(biāo)記熒光 抗抗體與雞IgG形成天藍色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察到沉淀線的位置(附圖 3)。天藍色免疫沉淀線的形成，進一步說明抗抗體成功地與APC進行了交聯(lián)，同時也說明交 聯(lián)反應(yīng)對抗抗體的免疫學(xué)活性影響不大，交聯(lián)物仍然保留較高的抗體活性。APC標(biāo)記熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上進行，分離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%，218V恒壓電泳，用0. 25% (w/v)考馬斯亮藍R-250 染色。APC標(biāo)記熒光抗抗體既具有APC的α、β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶(附 圖4)，電泳結(jié)果證實APC與抗抗體交聯(lián)成功，且純度達電泳純。APC標(biāo)記熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的APC標(biāo)記熒光抗抗體中加入0. 02 %疊 氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價，觀察熒光亮度和抗體活性 的變化。研制的APC標(biāo)記熒光抗抗體在0. 05mol/L的磷酸緩沖液中4°C保存60天，熒光抗 抗體的熒光強度保持不變，隨后隨著保存時間推移熒光強度緩慢降低，但降幅較小。4°C保 存90天，熒光抗抗體的抗體效價維持在5Log 2，然后抗體效價隨著保存時間延長而緩慢降 低(附圖5)。實施方式2 =APC標(biāo)記的抗豬IgG熒光抗抗體的制備方法別藻藍蛋白(APC)的制備APC由鈍頂螺旋藻(Spirulina platensis)中分 離純化。藻體細胞加入5倍體積(V/w)20mM磷酸緩沖液(pH6. 8-7.0)，反復(fù)凍融3次， 40C IOOOOrpm離心，上清液中加入硫酸銨至終濃度為60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，離心， 沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH7)中，20mM的磷酸緩沖液(pH7)透析，透析液上DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換色譜柱層析，離子交換柱經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5. 0，含 50mM NaCl)預(yù)平衡，洗脫液為20mM醋酸緩沖液(pH3.6，含50mM NaCl)，洗脫速度為60mL/ h，收集天藍色液體即為純化的螺旋藻別藻藍蛋白。純化的螺旋藻APC純度達電泳純，純度 指數(shù)A650A280 >5，結(jié)構(gòu)式為(α β)3，分子量約為IlOkDa,最大吸收峰位于650歷，620歷處 有一肩峰，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于660nm，純化的APC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為5-10mg/mL。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的制備抗豬IgG抗體購自Sigma公司，用20mM磷 酸緩沖液(PH6. 8-7. 0)透析，調(diào)整抗體濃度為10mg/mL。以DMSO溶解SPDP配制SPDP母液， 現(xiàn)配現(xiàn)用。將SPDP按摩爾比分別為50 1,60 1與APC、抗豬IgG抗體混勻，鋁箔封好后 于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按60 1的摩爾比與抗抗體衍生 物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除去多余的DTT。抗抗體-HS與APC衍生物以摩 爾比1 1混勻、液相交聯(lián)，鋁箔封好后于20-25°C振蕩反應(yīng)20h。用10mg/ml的NEM溶液 20ul封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。反應(yīng)中的NEM不用除去。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的純化和交聯(lián)效率分析液相色譜工作站上采 用HPLC法進行交聯(lián)效率分析和純化，采用分子篩高壓液相色譜柱純化，液相柱型號TSK G3000sw(規(guī)格 7. 5mmX60cm)，流動相為 50mM PBS pH 7. 5，流速 0. 5mL/min，檢測波長 190-800nm。洗脫順序依次為熒光抗抗體、游離的抗抗體、游離的APC，洗脫曲線與APC標(biāo)記 的抗雞IgG熒光抗抗體(附圖1)基本一致，洗脫峰分別出現(xiàn)在19. 57,27. 32,31. 26min。這 是由于抗雞IgG抗體與抗豬IgG抗體分子量相同。收集19. 57min出現(xiàn)的洗脫峰，即為APC 標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體。第一個洗脫峰的面積占所有洗脫峰面積的比例即交聯(lián)效率為 90%。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的光譜檢測吸收光譜在紫外_可見光分光光度計 上測定，掃描波長區(qū)間250-700nm。室溫?zé)晒獍l(fā)射光譜在熒光分光光度計上測定，激發(fā)波長 580nm，熒光掃描范圍為600-700nm。光譜檢測結(jié)果與附圖2相同。APC標(biāo)記熒光抗抗體在紫 外區(qū)的吸光度高于對照APC，吸收峰位置相同；450-600nm范圍內(nèi)，交聯(lián)物的吸收光譜與APC
7的吸收峰及吸光度無差別。通過吸收光譜檢測可判定交聯(lián)成功，且交聯(lián)反應(yīng)沒有導(dǎo)致APC 變性。APC標(biāo)記熒光抗抗體與對照APC在580nm激發(fā)光的激發(fā)下，室溫?zé)晒獍l(fā)射波長均位于 660nm,沒有發(fā)生斯托克位移的改變，仍具有APC的特征熒光，且熒光亮度無明顯降低。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的效價檢測取10_15mL熔化的的離子瓊脂 (0. 03MpH 8.6的巴比妥緩沖液配制)趁熱倒在電泳板槽中，待冷卻后打孔?？字睆郊s為 4mm，孔間距約為5mm。打孔后在酒精燈上烘烤背面，使瓊脂層與電泳板貼緊。用生理鹽水 稀釋雞IgG為0. 5mg/mL,吸取20_40uL注于正極端各孔；用生理鹽水稀釋APC標(biāo)記抗豬IgG 熒光抗抗體為lmg/ml，吸取20-40uL，注于負極端孔中。在電泳板正、負電極端與電極槽緩 沖液間用濾紙搭橋，接通電源，150V穩(wěn)壓電泳4h。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體與豬IgG抗 體同樣形成天藍色免疫沉淀線，不用染色就可清晰地觀察到沉淀線的位置。免疫沉淀線的 形成說明抗抗體與APC交聯(lián)成功，同時交聯(lián)物仍然保留較高的抗體活性。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的電泳檢測=SDS-PAGE在垂直板不連續(xù)電泳裝置上 進行，分離膠濃度為12. 5%，濃縮膠濃度為5%。218V恒壓電泳，用0. 25% (w/v)考馬斯亮 藍R-250染色，脫色后觀察結(jié)果。SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)APC標(biāo)記熒光抗抗體既具有APC的α、 β亞基條帶，又具有抗體的H、L鏈條帶，表明APC與抗豬IgG抗體交聯(lián)成功。APC標(biāo)記抗豬IgG熒光抗抗體的穩(wěn)定性檢測純化的APC標(biāo)記熒光抗抗體中加入 0. 02%疊氮化鈉，4°C避光保存，每隔30天測定一次熒光光譜和抗體效價。APC標(biāo)記抗豬IgG 熒光抗抗體穩(wěn)定性與APC標(biāo)記抗雞IgG熒光抗抗體相近，4°C保存60天熒光強度保持不變， 隨后緩慢降低；4°C保存90天，熒光抗抗體的抗體效價維持在5Log2，然后隨著保存時間延 長而緩慢降低。
權(quán)利要求
一種別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法，包括陰離子交換層析法分離純化螺旋藻APC，分別用摩爾比為20 50∶1、50 100∶1的化學(xué)交聯(lián)劑SPDP將APC、抗抗體衍生，抗抗體的SPDP衍生物經(jīng)摩爾比50 100∶1的DTT還原獲得帶 HS的抗抗體，帶 HS的抗抗體與APC的SPDP衍生物以摩爾比1∶1 2液相交聯(lián)，經(jīng)HPLC純化制備出熒光抗抗體，制備的熒光抗抗體得率高、純度高、穩(wěn)定性好、熒光呈明亮的紅色，可作為通用熒光探針用于雞、豬傳染病的快速免疫熒光檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中APC由鈍頂螺旋藻(Spirulinaplatensis)中分離純 化，制備過稱為藻體細胞加入5倍體積(v/w) 20mM磷酸緩沖液(pH6. 8 7. 0)，反復(fù)凍融 3次，4°C IOOOOrpm離心，上清液中加入硫酸銨至終濃度為60% (w/v)，4°C冰箱放置24h，離 心，沉淀溶于20mM的磷酸緩沖液(pH7)中，20mM的磷酸緩沖液(pH7)透析，透析液經(jīng)DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析純化，離子交換柱經(jīng)20mM醋酸緩沖液(pH5. 0，含 50mM NaCl)預(yù)平衡，洗脫液為20mM醋酸緩沖液(pH3.6，含50mM NaCl)，洗脫速度為60mL/ h，收集天藍色液體即為純化的螺旋藻別藻藍蛋白，純化的螺旋藻APC純度達電泳純，純度 指數(shù)A650A280 >5，結(jié)構(gòu)式為(α β)3，分子量約為IlOkDa,最大吸收峰位于650nm，在620nm 處有一肩峰，室溫?zé)晒獍l(fā)射峰位于660nm，純化的APC硫酸銨沉淀4°C避光保存，使用前用 50mM pH7. 5PBS充分透析除鹽，調(diào)整濃度為5_10mg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中抗抗體為抗雞IgG抗體、抗豬IgG抗體，購自Sigma公 司，電泳檢測純度達電泳純，對流免疫電泳法檢測抗抗體具有良好的生物學(xué)活性，使用時用 PBS透析，調(diào)整蛋白濃度為5-10mg/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中熒光抗抗體采用化學(xué)交聯(lián)法在液相體系中交聯(lián)制備， 制備步驟為調(diào)整APC、抗抗體的濃度為5-10mg/ml，以DMSO準(zhǔn)確配制SPDP母液，分別用雙 功能化學(xué)交聯(lián)劑SPDP衍生APC、抗抗體，SPDP與APC、抗抗體的摩爾比分別為20-50 1、 50-100 1，混勻、鋁箔封好后于室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2h，超濾離心除去多余的SPDP。取DTT按 50-100 1的摩爾比與抗抗體衍生物充分混勻，室溫靜置反應(yīng)lh，超濾離心除去多余的 DTT,抗抗體-HS與APC衍生物以摩爾比1 1-2混勻，鋁箔封好后于20_25°C振蕩反應(yīng)20h。 加NEM封閉多余巰基，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)60min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中熒光抗抗體經(jīng)HPLC純化，純化在液相色譜工作站上進 行，液相柱型號 TSK G3000SW (規(guī)格 7. 5mmX 60cm)，流動相為 50mM pH 7. 5PBS，流速 0. 5ml/ min，檢測波長190-800nm，收集洗脫19. 57min出現(xiàn)的產(chǎn)物峰，經(jīng)光譜、電泳、抗體活性檢測 合格置4°C避光保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)標(biāo)記的熒光抗抗體的制備方法。制備過程包括陰離子交換層析法分離純化螺旋藻APC，用化學(xué)交聯(lián)劑SPDP分別將APC、抗抗體衍生，兩種衍生物再以適宜摩爾比液相交聯(lián)，經(jīng)高壓液相色譜純化制備出APC標(biāo)記的熒光抗抗體。本發(fā)明制備的熒光抗抗體交聯(lián)效率高、純度高、紅色熒光明亮、穩(wěn)定性好、靈敏度高，可作為通用熒光探針用于雞、豬等動物傳染病的間接免疫熒光檢測。
文檔編號C07K14/405GK101980019SQ20101028433
公開日2011年2月23日 申請日期2010年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月17日
發(fā)明者呂愛杰, 姚強, 朱麗萍, 趙守山, 顏世敢 申請人:顏世敢