專利名稱：一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的制備 方法。
背景技術(shù)：
手足口病(Hand-Footand Mouth Disease, HFMD)于 1957 年在新西蘭首次報道， 1958年分離出柯薩奇病毒，1959年提出HFMD命名，60年代以后，許多國家和地區(qū)多次報道 該病的流行。早期發(fā)現(xiàn)的手足口病的病原體主要是CoxAie型，1969年分離出EV71病毒并 首次被確認(rèn)。此后CoxAie感染和EV71感染交替出現(xiàn)，成為手足口病的主要病原體。20世 紀(jì)70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼暴發(fā)以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主要臨床特征的EV71流行。 20世紀(jì)90年代后期，EV71開始在東南亞地區(qū)流行。我國于1981年在上海首次報道本病。 此后，北京、河北、天津、福建、吉林和廣東等10幾個省市均有報道。1995年武漢病毒研究 所從手足口病人中分離出EV71，1998年深圳市衛(wèi)生防疫站從患者標(biāo)本中分離出EV71病毒。 近年來EV71病毒的流行呈上升趨勢，不斷引起嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，導(dǎo)致兒童死亡。手足口病是由多種腸道病毒引起的急性傳染病，最主要的病原體是EV71和柯薩 奇病毒A16型(CoxAie)，多發(fā)生于嬰幼兒，成人也偶見發(fā)生，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部 位的皮疹或皰疹，具有很強(qiáng)的傳染性，可以通過玩具、食具、鼻咽分泌物、飛沫等多種途徑傳 染。其癥狀表現(xiàn)為急性起病，發(fā)熱，手掌或腳掌部出現(xiàn)斑丘疹和皰疹，臀部或膝蓋也可出現(xiàn) 皮疹。皮疹周圍有炎性紅暈，皰內(nèi)液體較少；口腔粘膜出現(xiàn)散在的皰疹，疼痛明顯。部分患 兒伴有咳嗽、流涕、食欲不振、惡心、嘔吐和頭疼等癥狀。手足口病的癥狀較重，而且可并發(fā) 無菌性腦膜炎、腦炎、癱瘓等與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的疾病以及心肌炎、肺水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥，個 別重癥患兒病情進(jìn)展快，易發(fā)生死亡。所以，積極治療HFMD，防止其繼發(fā)感染、暴發(fā)流行均具 有重要價值，而且研發(fā)一種有效預(yù)防、治療手足口病的新型藥物成為世界醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域的 一個新的課題和挑戰(zhàn)。目前，雖然已有針對預(yù)防HFMD的疫苗，但是尚無特異性藥物，臨床用藥主要有抗 病毒藥、中藥和抗菌藥等，治療效果不理想，而且有副作用，影響兒童健康，預(yù)防傳染和治療 HFMD成為醫(yī)學(xué)上的難題。本發(fā)明所制備的抗手足口病IgY是治療手足口病的特異性生物制 品，不但能有效治療手足口病，而且沒有副作用，不會損害兒童身體健康，同時還有鑒別診 斷和緊急預(yù)防接種等作用，當(dāng)免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失敗時，可利用卵黃抗體注射、口 服替代主動免疫接種，發(fā)揮抗病作用，因此抗手足口病IgY的發(fā)明具有重大的社會意義。
發(fā)明內(nèi)容
到目前為止，尚未出現(xiàn)應(yīng)用IgY技術(shù)治療手足口病的研究報道，本發(fā)明首次提供 一種新的治療手足口病的特異性方法，即應(yīng)用抗手足口病特異性IgY。本發(fā)明涉及一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的制備方法，其特征在于通過超 聲波粉碎法將滅活純化的EV71的B型、C型以及CoxAie三個病毒株制備成可溶性抗原，獲得針對手足口病的復(fù)合抗原；用該抗原注射免疫產(chǎn)蛋母雞，獲得抗手足口病免疫蛋；提取 抗手足口病特異性卵黃抗體粗品，并對其進(jìn)行純化處理后，獲得抗手足口病特異性IgY純 品；對所述抗手足口病特異性IgY純品進(jìn)行過濾處理，以濾除各種細(xì)菌和病毒，得到抗手足 口病特異性IgY成品。本發(fā)明所制備的雞卵黃抗體，具有安全方便、簡單易得、產(chǎn)率高、成本低、特異性 強(qiáng)、不與IgG發(fā)生交叉血清學(xué)反應(yīng)；且耐熱、耐酸，巴氏滅菌溫度下不會失活且在PH值小于 3時也能保持穩(wěn)定活性，這些獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)使雞卵黃抗體在臨床和基礎(chǔ)科學(xué)的應(yīng)用中起著重 要的作用。因此雞卵黃抗體在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到人類的關(guān)注，抗手足口病特異性 雞卵黃抗體的研制對手足口病的預(yù)防與治療具有重要意義。
具體實施例方式下面的實施實例進(jìn)一步說明本發(fā)明。實施方式一抗手足口病特異性雞卵黃抗體的制備(1)手足口病抗原的制備通過超聲波粉碎法將滅活純化的EV71的B型、C型以及CoxAie三個病毒株制備 成可溶性抗原，獲得針對手足口病的復(fù)合抗原。將冷凍干燥的抗原用O.Olmol/L磷酸鹽緩 沖液PBS(pH = 7.2)稀釋成lmg/ml，并且與福氏佐劑按照1 1 (V/V)充分乳化后制得免疫 抗原。(2)用手足口病復(fù)合抗原免疫產(chǎn)蛋母雞取20周齡產(chǎn)蛋母雞15只，將乳化好的手足口病復(fù)合抗原經(jīng)雞雙翼或胸肌處多點(diǎn) 注射；首次免疫采用福氏完全佐劑，其余采用福氏不完全佐劑；首次免疫前收集未免疫蛋 作為陰性對照品，9天后免疫第二次，以后每隔8天免疫一次，每次免疫劑量為0. 5ml/只； 第二次免疫22天后收集雞蛋，連續(xù)收集3個月(收集的雞蛋編號)，存放于4°C。(3)抗手足口病特異性IgY的提純敲破獲得的抗手足口病免疫蛋，去除蛋清及蛋黃膜，留取蛋黃部分，測定所收集的 蛋黃體積，邊磁力攪拌邊加入16%的氯化鈉，體積為蛋黃體積的9倍，充分?jǐn)嚢韬螅?°C條件 下靜置過夜，9000r/min離心30min，取上清液，并用紗布過濾，測定濾液的體積；在上述濾液中稍慢速度攪拌下加入40%的PEG6000，體積為濾液體積的0. 5倍，充 分?jǐn)嚢璋雮€小時后，將此混合物分裝于IOml離心管中，置于高速冷凍離心機(jī)中，在10°C下 以9690r/min，離心30min，傾去上清液，沉淀部分即為抗手足口病特異性IgY粗提物；用0. 8 %磷酸鹽緩沖液PBS溶解沉淀至上清液初體積，再在緩慢攪拌下加入初 體積一半的飽和度為33 %的硫酸銨溶液，靜置3h，再次離心，棄去上清液，將沉淀部分 在-60°C下真空冷凍干燥12h，干粉成品即為制得的抗手足口病特異性雞卵黃抗體純品；將抗手足口病特異性IgY純品進(jìn)行過濾處理，以濾除各種細(xì)菌和病毒，得到抗手 足口病特異性IgY成品，將所制得的IgY成品分裝后于-20°C保存。實施方式二 抗手足口病特異性IgY的效價檢測采用ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試驗)法檢測本發(fā)明工藝制取的抗手足口病特異性IgY 的效價。檢測結(jié)果表明，抗手足口病特異性IgY的效價達(dá)到了 1 6400。實施方式三抗手足口病特異性IgY的純度鑒定
采用SDS-PAGE(十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠)電泳法，使用5%濃縮膠， 12%分離膠，對以上工藝所制取的抗手足口病特異性IgY的粗提物進(jìn)行檢測，結(jié)果含IgY 52-60 %。IgY粗提物經(jīng)過飽和度為33 %的硫酸銨鹽析純化后，經(jīng)SDS-PAGE分析，純度達(dá)到 92-95%。實施方式四體外抑菌試驗取5支裝有IOmL液體培養(yǎng)基的試管，分別加入ImL指示菌懸液，使細(xì)菌濃度為 108cfu/mL。向其中4支試管各加入ImL不同濃度的抗手足口病IgY，使抗體的終濃度分別 為2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和16mg/mL，剩下的一支作為對照，加入ImL無菌的PBS。將5支 試管置于37°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在第2h、4h和6h取培養(yǎng)液，用稀釋平板法計算活 菌數(shù)。結(jié)果證明，制備的抗手足口病IgY的濃度達(dá)到8mg/mL時，對手足口病的生長具有明 顯的抑制作用。實施方式五抗手足口病特異性IgY的應(yīng)用利用抗手足口病特異性IgY，可以制成各種預(yù)防、治療手足口病的制劑，包括干粉 制劑、液態(tài)制劑、顆粒制劑、膠囊或片劑等，可應(yīng)用于制備預(yù)防和治療手足口病感染的藥物、 保健品、飲品。另一種應(yīng)用是在制備免疫檢測試劑中的應(yīng)用，具體包括免疫電泳、ELISA、免疫沉 淀、免疫印跡、抗體芯片、時間分辨熒光免疫分析和免疫細(xì)胞學(xué)等一系列免疫診斷技術(shù)，用 以檢測相應(yīng)的手足口病抗原。
權(quán)利要求
一種制備抗手足口病特異性IgY的方法，其特征在于，采用超聲波粉碎法將將滅活純化的EV71的B型、C型以及CoxA16三個病毒株制備成可溶性抗原，獲得針對手足口病的復(fù)合抗原。
2.將上述步驟(1)中所獲得的抗原用O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液(PhosphateBuffered Saline,PBS pH = 7. 2)稀釋，并且與福氏佐劑按照1 1 (V/V)充分乳化后制得免疫抗原。 用乳化好的抗原雙翼或胸肌處多點(diǎn)注射免疫20周齡產(chǎn)蛋母雞；首次免疫采用福氏完全佐 劑，其余采用福氏不完全佐劑；首次免疫前收集未免疫蛋作為陰性對照品，8-10天后免疫 第二次，以后每隔7-9天免疫一次，每次免疫劑量為0. 4-0. 6ml/只；第二次免疫22天后收 集雞蛋，連續(xù)收集2-3個月(收集的雞蛋編號)，于4°C保存。
3.將獲得的抗手足口病免疫蛋，去除蛋清及蛋黃膜，留取蛋黃部分，通過14-16% 氯化鈉稀釋獲得水溶性組分，并用40-50%聚乙二醇6000(polyethyleneglycol 6000， PEG6000)提取獲得卵黃抗體粗提物，上述粗提物用飽和度為30-33%的硫酸銨溶液或 140g/L的硫酸鈉溶液進(jìn)行純化后，得到抗手足口病特異性IgY純品，將IgY純品進(jìn)行過濾處 理，以濾除各種細(xì)菌和病毒，得到抗手足口病特異性IgY成品，將所制得的IgY成品分裝后 于-20°C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗手足口病特異性雞卵黃抗體的制備及其提純方法，該抗體可以由下述方法制備1.采用超聲波粉碎法將滅活純化的EV71的B型、C型以及CoxA16三個病毒株制備成可溶性抗原，獲得針對手足口病的復(fù)合抗原；2.用制得的手足口病復(fù)合抗原對產(chǎn)蛋母雞進(jìn)行注射免疫，獲得抗手足口病免疫蛋；3.提取抗手足口病特異性雞卵黃抗體粗品，并對其進(jìn)行純化、過濾處理后，即制得抗手足口病特異性雞卵黃抗體(Immunoglobulin of Egg Yolk，IgY)成品。所得的抗手足口病卵黃抗體成本低、產(chǎn)量高，具有高特異性，利用這些特異性IgY可以制成各種預(yù)防、治療手足口病的制劑。
文檔編號C07K16/10GK101880323SQ201010191490
公開日2010年11月10日 申請日期2010年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月31日
發(fā)明者劉端, 趙肅清, 鄭輝, 陳文彪 申請人:廣東京豪醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司;廣東工業(yè)大學(xué)