具有增強(qiáng)酸感受離子通道1a電流作用的多肽及其用途的制作方法

專利名稱：具有增強(qiáng)酸感受離子通道1a電流作用的多肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一組能與酸感受離子通道(ASICs)特異性結(jié)合并增強(qiáng)ASICla同聚體電流的多肽。
背景技術(shù)：
酸感受離子通道(acid sensing ion channels，ASICs)是H+門控的陽離子通道，位于細(xì)胞膜上，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛表達(dá)。ASICs通道是鈉通道ENaC/ DEG (epithelial Na+channel/degenerin)家族重要成員之一，雖然它們與家族中其他成員只有20%-25%的同源性，但卻具有了家族成員的所有特征。到目前為止，共發(fā)現(xiàn)由4個(gè)基因編碼的6個(gè)亞基，它們分別是ASICla，ASIClb，ASIC2a，ASIC2b，ASIC3*ASIC4。每個(gè)亞基的長(zhǎng)度都在500個(gè)氨基酸左右。其結(jié)構(gòu)包括兩個(gè)疏水跨膜區(qū)，位于細(xì)胞內(nèi)的羧基端和氨基端，以及胞外作為受體接受H+的刺激信號(hào)的一段富含半胱氨酸的長(zhǎng)鏈。ASICs由3個(gè)亞基組成，通道位于它們中央。亞基組合形式多種多樣，可以是同聚體也可以是異聚體通道(其中ASIC2b和ASIC4不能形成功能性同聚體)。這些由不同亞基組合形成的離子通道，其電生理學(xué)、藥理學(xué)特性和離子選擇性各有不同。當(dāng)胞外組織液pH值下降時(shí)，ASICs被激活而開放，細(xì)胞外Na+或Ca2+通過其開放的離子通道進(jìn)入胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞去極化而興奮。ASICs 在外周感覺神經(jīng)元的生物學(xué)功能涉及痛覺、觸覺、和酸味覺的形成；而在中樞神經(jīng)元，其功能則涉及突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶等活動(dòng)。在病理情況下，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心腦組織缺氧缺血、肌肉勞累、癲癇發(fā)作導(dǎo)致局部組織的酸增高或酸中毒時(shí)，ASICs開放，不僅形成和傳導(dǎo)傷害性感受信息，同時(shí)還可加重這些病理因素對(duì)相關(guān)組織造成的損傷。酸感受離子通道Ia(ASICla)主要在中樞的大腦皮層、海馬、小腦、上丘腦、脊髓和外周的背根節(jié)神經(jīng)元等部位表達(dá)，在外周軟骨組織、人類造骨細(xì)胞和味蕾細(xì)胞中也有表達(dá)。 亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，ASICla遍及胞體并沿著神經(jīng)元軸突和樹突的分支分布，但在突觸小體或突觸膜上分布很少。無論在中樞還是外周神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)活動(dòng)很活躍的地方以及神經(jīng)信號(hào)高頻傳導(dǎo)的局部，均為ASICla高表達(dá)區(qū)域。ASICla同聚體通道對(duì)H+敏感性較高(激活閾值pH為7. 0-6. 8)，對(duì)Na+和Ca2+都有較高的通透性。近年來，ASICla亞基引起了越來越多研究者的注意。研究表明，ASICla參與了多種疾病的病例過程。首先，在大腦缺血過程中，由于血液供應(yīng)不足，引起組織細(xì)胞缺氧，導(dǎo)致了組織液的酸化。這種酸化可激活A(yù)SICla同聚體通道，導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+超載，進(jìn)而形成神經(jīng)元的損傷。在動(dòng)物模型中，已經(jīng)證實(shí)了該通道的特異性阻斷劑狼蛛毒素PcTXl具有缺血性神經(jīng)保護(hù)作用；該基因敲除后也可有效保護(hù)酸化所致的神經(jīng)損傷。其次，該亞基同聚體還與癲癇發(fā)作的持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)。過表達(dá)該基因可有效縮短癲癇的持續(xù)時(shí)間，傳統(tǒng)的CO2療法也依賴于ASICla。第三，該通道還涉及抑郁癥病理，其拮抗劑對(duì)抑郁癥有較好的治療效果。 綜上所述，該通道已經(jīng)成為了多種疾病的靶標(biāo)分子，針對(duì)ASICla亞基進(jìn)行激動(dòng)劑或拮抗劑的篩選具有重要的意義。近幾十年來，多肽在人體中的作用已引起科學(xué)界的高度重視，涉及人體的激素、神經(jīng)、細(xì)胞生長(zhǎng)和生殖等各個(gè)領(lǐng)域。多肽類藥物的主要特點(diǎn)是用量小、生物活性強(qiáng)，對(duì)癌癥、自身免疫性疾病、記憶力減退、精神失常、高血壓和某些心血管及代謝等疾病有顯著的療效和廣泛的應(yīng)用前途。獲取特異多肽最經(jīng)典和最有效的手段是噬菌體肽庫展示技術(shù)，該技術(shù)是將外源DNA通過基因工程技術(shù)克隆到適當(dāng)?shù)氖删w載體上，使外源DNA片段對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物融合在噬菌體的衣殼蛋白上形成融合蛋白，呈現(xiàn)在噬菌體表面。利用靶分子采用適當(dāng)?shù)奶韵捶椒ㄏ慈シ翘禺惤Y(jié)合的噬菌體，最終從噬菌體文庫中篩選出能結(jié)合靶分子的目的噬菌體。目前已廣泛用于抗原表位分析、分子間相互識(shí)別、新型疫苗及藥物開發(fā)等各個(gè)方面。這項(xiàng)技術(shù)通過“吸附一洗脫一擴(kuò)增”的親和篩選過程，可以將展示特異性外源肽的噬菌體從噬菌體肽庫篩選出來，經(jīng)擴(kuò)增可以得到上千倍乃至IO8的倍的富集，從而可以很容易地對(duì)所篩選的克隆進(jìn)行序列測(cè)定，最終確定表達(dá)的外源肽的氨基酸序列。 由于篩選ASICla亞基的激動(dòng)劑或拮抗劑具有重要的實(shí)用價(jià)值，我們希望利用噬菌體表面肽庫能夠篩選到新的ASICla亞基的激動(dòng)劑或拮抗劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用噬菌體表面展示技術(shù)，以ASICla胞外區(qū)為靶標(biāo)，篩選具有激動(dòng)或抑制其電流的多肽。應(yīng)用這些多肽，一方面可以開展ASICla相關(guān)的基礎(chǔ)研究，另一方面還可以探索以其為靶標(biāo)治療相關(guān)疾病的可行性。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明通過表達(dá)、純化酸感受離子通道Ia胞外區(qū)，得到純化蛋白，然后以該蛋白為靶標(biāo)，篩選環(huán)七肽庫和十二肽庫，得到了 14種與胞外區(qū)結(jié)合活性較高的多肽，通過與GST融合表達(dá)，得到了相應(yīng)的GST融合表達(dá)肽，將GST融合表達(dá)肽用 GSTrap FF純化柱進(jìn)行純化。通過爪蟾卵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和體外急性分散培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元系統(tǒng)，使用雙電極電壓鉗和全細(xì)胞記錄技術(shù)檢測(cè)了融合表達(dá)肽和合成肽的活性。發(fā)現(xiàn)在特異性表達(dá)ASICla亞基的爪蟾卵母細(xì)胞和培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上，單純使用 GST-P13不能誘發(fā)出任何電流，但能夠使胞外H+誘發(fā)的內(nèi)向電流幅度明顯增加，其作用是可逆的?；谝陨霞夹g(shù)方案和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本發(fā)明涉及以下幾個(gè)方面本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種具有酸感受離子通道Ia結(jié)合活性的多肽，其選自SEQ ID NO 1-10中的至少一種。序號(hào)氨基酸序列
PlMPSFNYQ(SEQ ID NO:1)
P2HSILTTY(SEQ ID NO2)
P3PSHRPFM(SEQ ID NO3)
P6THHTHEH(SEQ ID NO4)
P7HHGSARH(SEQ ID NO5)
P8HYQHMHSRLGVH(SEQ ID NO6)
P9EGTVEMIffAYSI(SEQ ID NO7)
PllHYFSNQA(SEQ ID NO8)
P13ISffEIQYKSLPL(SEQ ID NO:9)
P14AATLYQRPISPM(SEQ ID NO:10)
4
根據(jù)以上所述的多肽，其為SEQ ID NO 9所示的多肽。本發(fā)明另一方面涉及一種融合肽，其可操作地連接有一個(gè)或幾個(gè)SEQ ID NO=I-IO 中所示的肽，所述肽可以相同或不相同。本發(fā)明的另一方面涉及一種融合蛋白，其可操作地連接有一個(gè)或幾個(gè)SEQ ID NO 1-10中所示的肽，所述肽可以相同或不相同，以及一種起靶向作用的蛋白或方便純化的蛋白。其中，起靶向作用的蛋白是指靶向于特異器官或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的分子，方便純化的蛋白是指標(biāo)簽如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)和多聚組氨酸(HIQ等。本發(fā)明的另一方面涉及一種DNA或RNA序列，其編碼如上所述的多肽或蛋白。本發(fā)明的另一方面涉及一種載體，其含有上述的DNA或RNA序列。本發(fā)明還涉及如上所述多肽或蛋白在制備酸感受離子通道Ia靶向治療藥物中的用途。本發(fā)明還涉及SEQ ID NO 9所示的多肽作為酸感受離子通道Ia激動(dòng)劑的用途。本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其含有如上所述多肽或蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。發(fā)明的有益效果本發(fā)明篩選出的多肽對(duì)ASICla具有較高的親和力并且對(duì)ASICla功能有明顯的影響，提示這些多肽對(duì)以ASICla為靶標(biāo)的疾病防治具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。


圖 1 純化的 GST-ASICla 胞外區(qū) SDS-PAGE 圖(A)及純度圖(B)。1. GST-ASICla 胞外區(qū)；2.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Da)圖2通過ELISA鑒定篩選噬菌體隨機(jī)肽庫得到的GST-ASICla胞外區(qū)結(jié)合噬菌體。圖3結(jié)合噬菌體展示的多肽序列。圖4純化的GST融合多肽的SDS-PAGE圖。圖5雙電極電壓鉗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GST-P13對(duì)爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的ASICla同聚體電流的激動(dòng)作用。A圖表示所記錄的電流對(duì)阿米洛利(Amiloride)敏感，這與該電流特征相符；同時(shí)GST對(duì)該電流無明顯影響，表明用GST融合多肽測(cè)試多肽對(duì)電流的影響是可行的。 B所示GST-P13對(duì)ASICla同聚體電流的激動(dòng)作用。圖6膜片鉗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)合成P13對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元ASIC電流的激動(dòng)作用。當(dāng)胞外液PH值下降時(shí)，可記錄到ASIC電流，給予合成的P13后，電流增大，而重新給予低pH值刺激時(shí)，電流恢復(fù)，表明P13對(duì)海馬中表達(dá)的ASIC電流的增強(qiáng)作用是可逆的。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例1 ASICla胞外區(qū)的克隆、表達(dá)與純化
1.材料GSTrap FF純化柱購自于Pharmacia Biotech公司；溶菌酶購自于 Promega公司；超聲破碎儀購自于寧波新芝科技有限公司，高保真Taq酶和內(nèi)切酶購自 TAKARA公司。原核表達(dá)載體pGEX-4T2購自于Pharmacia Biotech公司。2.實(shí)驗(yàn)方法(1) PCR和表達(dá)載體的構(gòu)建以大鼠全腦總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。上游引物為5' -CGCGGATCCACTgAgCgTgTgC AgTACT-3 ‘ (SEQ ID NO 11)；下游引物為 5' -GCGCTCGAGTCATTCAgCgCTgCAggCCTC-3 ‘ (SE Q ID NO: 12)，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?95°C，5分鐘；以94°C，1分鐘，55°C，1分鐘，72°C，1分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。將得到的PCR產(chǎn)物純化，然后和pGEX-4T2同時(shí)用BioI和BamHI酶切，連接后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE!3)菌株中。對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序。(2)表達(dá)菌株的培養(yǎng)與目標(biāo)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)取上述構(gòu)建好的載體菌株20 μ 1接種于LB培養(yǎng)基中，37°C空氣搖床培養(yǎng)過夜，次日按5% (體積百分比)的比例轉(zhuǎn)種于LB培養(yǎng)基，37°C空氣搖床培養(yǎng)約3小時(shí)，當(dāng)0D600值達(dá)到0. 7時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG誘導(dǎo)4_5個(gè)小時(shí)，收獲細(xì)菌。(3) ASICla胞外區(qū)蛋白的純化將上述收獲的細(xì)菌離心后棄去上清，將菌體進(jìn)行超聲破碎，將超聲處理后的菌液于4°C，12，000r/min離lOmin。SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)形式，證明目的蛋白以可溶性形式存在，分子量約為38kD。將離心上清用GSTrap FF親和純化柱進(jìn)行純化。首先將樣品結(jié)合于純化柱，然后用10倍體積的PBS洗去非特異結(jié)合的雜蛋白，用lOmmol/L還原型谷胱甘肽(用50mmol/L的Tris-HCl緩沖液配制，pH8. 0)洗脫目的蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)純化效果，并進(jìn)行了純度測(cè)定(圖1)。結(jié)果表明獲得了與預(yù)期分子量相符并且純度較高的靶標(biāo)蛋白。實(shí)施例2 ASICla胞外區(qū)結(jié)合肽的篩選1.材料噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫和十二肽庫均購自New EnglandBiolab。2.實(shí)驗(yàn)方法在得到實(shí)施例1中純化的ASICla胞外區(qū)蛋白的基礎(chǔ)上，以其為靶標(biāo)從噬菌體隨機(jī)環(huán)七肽庫和十二肽庫中，分別經(jīng)過三輪篩選得到了特異的與ASICla胞外區(qū)蛋白結(jié)合的肽 (篩選方法參照隨機(jī)肽庫說明書)。利用ELISA對(duì)篩選得到的結(jié)合肽噬菌體進(jìn)行鑒定。具體方法為，用濃度為50 μ g/ml的GST-ASICla胞外區(qū)融合蛋白和50g/ml的GST蛋白100 μ 1 4°C包被酶聯(lián)板過夜，每個(gè)孔設(shè)平行對(duì)照。10%奶粉37°C封閉Ih ；然后每孔各加100μ 1 (約 IO11 pfu/ml)單克隆噬菌體上清，37°C作用Ih;每孔加1 5000倍稀釋的HRP-抗M13 二抗 100μ 1，37°C反應(yīng)Ih ；加入100μ 1 TMB顯色液顯色，反應(yīng)IOmin后加50 μ 1 2Μ的H2S04終止反應(yīng)，測(cè)0W450nm)值。由圖2可以看出，有10個(gè)噬菌體克隆表現(xiàn)出了對(duì)靶標(biāo)融合蛋白較高的親和力，與陰性對(duì)照(標(biāo)簽蛋白GST)的親和力差異顯著，表明它們與ASICla胞外區(qū)結(jié)合而不是與標(biāo)簽蛋白GST結(jié)合。通過DNA序列分析，推斷出相應(yīng)的結(jié)合肽氨基酸序列，共得到了 10種ASICla胞外區(qū)結(jié)合肽(圖3)。實(shí)施例3 GST-多肽融合蛋白的表達(dá)和純化為了探討篩選到的ASICla胞外區(qū)結(jié)合肽能否具有調(diào)控ASICla電流的活性，將多肽(ASICla胞外區(qū)結(jié)合肽)分子分別與GST融合表達(dá)并純化。1.材料GSTrap FF純化柱購自于Pharmacia Biotech公司；溶菌酶購自于 Promega公司；超聲破碎儀購自于寧波新芝科技有限公司。原核表達(dá)載體pGEX_4T2購自于 Pharmacia Biotech2.實(shí)驗(yàn)方法(I)GST-多肽融合蛋白重組質(zhì)粒的構(gòu)建為了不影響結(jié)合肽本身的結(jié)構(gòu)，在合成結(jié)合肽編碼序列時(shí)引入了三個(gè)甘氨酸和一個(gè)絲氨酸密碼子，并在此序列的兩端加上了 BamH I和)(h0 I酶切位點(diǎn)。將合成的多肽基因片段的兩互補(bǔ)序列分別溶于滅菌的去離子水中，使其終濃度為1 μ g/μ ，各取5 μ 1，加入 40 μ 1滅菌去離子水中，終體積為50 μ 1，混勻后放入95°C水浴中5分鐘，然后緩慢降至室溫使兩互補(bǔ)片段退火。將經(jīng)BamH I和)(h0 I酶切回收的pGEX_4T2載體片段與上述退火的結(jié)合多肽基因片段按1 5的摩爾比連接，并轉(zhuǎn)化E. coli BL2KDE3)感受態(tài)細(xì)胞。挑單克隆測(cè)序。(2) GST-多肽融合蛋白的表達(dá)與純化將上述經(jīng)測(cè)序鑒定正確的重組菌菌液按1 100接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 4-0. 5，加入終濃度為0. 1-0. 5mmol/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá) 3小時(shí)，離心后，棄去上清，將菌體進(jìn)行超聲破碎，將超聲處理后的菌液于4°C，12，000r/min 離心IOmin0將離心上清用GSTrap FF親和純化柱進(jìn)行純化。首先將樣品結(jié)合于純化柱，然后用10倍體積的PBS洗去非特異結(jié)合的雜蛋白，用lOmmol/L還原型谷胱甘肽(用50mmol/L 的Tris-HCl緩沖液配制，pH8. 0)洗脫目的蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)純化效果(圖4)，表明已得到GST-多肽融合蛋白。實(shí)施例4 GST-融合多肽對(duì)ASICla電流的影響為了進(jìn)一步探索這些GST-融合多肽對(duì)ASICla電流的影響，需要將轉(zhuǎn)錄好的 ASICla cRNA注射入爪蟾卵母細(xì)胞，記錄電流，觀察多肽對(duì)電流產(chǎn)生的效應(yīng)。1.材料反轉(zhuǎn)錄試劑盒 Reverse Transcription System A3500 購自 Promega 公司；成熟雌性非洲爪蟾購自中國(guó)科學(xué)院；雙電極電壓鉗裝置(放大器、示波器、AD轉(zhuǎn)換板、 兩電極探頭)購自美國(guó)Axor^nstrument ；膠原酶(typelA)購自SIGMA公司；微電極拉制儀 (pp-830型)購自日本Narishige公司。pcDNA3. 1載體購自hvitrogen公司。2.實(shí)驗(yàn)方法(I)ASICla 表達(dá)載體 pcDNA3. 1-rASICla 的構(gòu)建以大鼠全腦總RNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。所用引物為上游5’ -CggATCCATggAATTgAAg ACCgAggA-3 ‘ (SEQ ID NO 13)和下游5，-CgATATCTgCAggTAAAgTCCTCAAACg-3 ‘ (SEQ ID NO 14)，PCR程序?yàn)?95°C，5分鐘；以94°C，1分鐘，55°C，1分鐘，72°C，2分鐘，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。將得到的PCR產(chǎn)物純化，然后和pcDNA 3. 1同時(shí)用EcoRV和BamHI酶切，連接后轉(zhuǎn)化， 對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序，即獲得ASICla表達(dá)載體pcDNA3. 1-rASICla。(2)目標(biāo)基因的體外轉(zhuǎn)錄按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcription System的要求，首先將上述獲得的 pcDNA3. Ι-rASICla線性化，按試劑盒所述體系將cDNA體外轉(zhuǎn)錄成cRNA，然后純化cRNA，測(cè)濃度備用。(3)爪蟾卵母細(xì)胞的注射手術(shù)器械在75%乙醇溶液中浸泡30分鐘，取出晾干，沸水中消毒5-0絲線10分鐘；將爪蟾掩埋于碎冰下40分鐘使其麻醉；把已麻醉的爪蟾腹部向上放置于碎冰托盤上， 用碎冰掩埋其頭部和四肢；酒精棉球消毒下腹部皮膚，然后用針頭挑起下腹部皮膚，用眼科剪剪開一個(gè)Icm左右小口，再剪開肌肉層；小心取出Icm3左右的卵巢小葉，放入0R-2溶液(NaCl 82mM ；KCl 2. 5mM ；MgC12 1. OmM ；HEPES 5. OmM，pH7. 6)中，分別縫合肌肉層和皮膚層。用干凈的移液管將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入無菌的玻璃離心管中，反復(fù)用0R-2溶液清洗，去除殘留血液，然后加入膠原酶溶液振搖1小時(shí)，再更換新的膠原酶溶液繼續(xù)振搖1小時(shí)；除去消化液，用0R-2溶液清洗5 6次，轉(zhuǎn)入盛有ND-96溶液(NaCl 96mM ；KCl 2. OmM ；CaCl2 1. 8mM ；MgCl2 1. OmM ；HEPES 5. OmM ；Na-pyrnvate 2. OmM, ρΗ7· 6)的培養(yǎng)皿中，在顯微鏡下觀察并挑選出外型較圓、色澤清晰、有一定張力、細(xì)胞表面光滑、無殘留纖維組織及毛細(xì)血管的V、VI期成熟卵母細(xì)胞，將挑選出的好的細(xì)胞放入盛有ND-96溶液的培養(yǎng)皿中，置于生化培養(yǎng)箱中18 22°C保存?zhèn)溆?。將專用注射針用兩步法電極拉制儀拉制好后，在干凈的薄面巾紙上刺一下，使針尖的口徑變粗，并在拋光儀上拋光，使得針尖光滑平整。根據(jù)上述所得原始cRNA的濃度，調(diào)整注射濃度大約為2ng/nl。取1 μ 1混合好的cRNA小心滴在干凈的parafilm上，用微量注射儀將cRNA吸入到注射用針中。將挑選好的健康的V、VI期成熟卵母細(xì)胞置入底部粘有網(wǎng)格的培養(yǎng)皿中。仔細(xì)調(diào)節(jié)三維微操縱儀，使針尖接觸細(xì)胞表面。將50nl cRNA注射入卵母細(xì)胞，注射后細(xì)胞會(huì)輕微鼓脹。注射好的卵母細(xì)胞置于ND-96溶液中，在生化培養(yǎng)箱(20°C 左右)培養(yǎng)4 后，可記錄表達(dá)電流。(3) GST-融合多肽對(duì)ASICla電流的影響卵母細(xì)胞置于容積約Iml的記錄槽中，各種不同細(xì)胞外液持續(xù)灌流的速度為:3ml/ min。使用微電極拉制儀拉制玻璃微電極，灌充3mol/LKCl溶液，電阻為0. 5 5ΜΩ。將拉制好的兩根玻璃微電極分別插入到放大器的探頭上。使用微操動(dòng)儀分別將兩只電極放入記錄槽中，當(dāng)電極尖端進(jìn)入液面后，將放大器面板上的mV、V2調(diào)節(jié)至零電位，同時(shí)測(cè)量電極的電阻是否滿足實(shí)驗(yàn)需要。采樣軟件為pClamp7.0(AXonInStrumentS公司產(chǎn)品)。所有實(shí)驗(yàn)在室溫Ol 23°C)下進(jìn)行。GST-融合多肽及GST的工作濃度為5μΜ，其中GST為陰性對(duì)照。由圖5Α可以看出，當(dāng)胞外液ρΗ值下降時(shí)，可記錄ASICla電流，該電流對(duì)阿米洛利敏感，符合文獻(xiàn)報(bào)道中的電流特性，融合多肽GST-P13對(duì)ASICla電流有增強(qiáng)作用(n = 3，圖 5Β)，而單獨(dú)的標(biāo)簽蛋白GST則對(duì)電流沒有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在篩選得到的十個(gè)多肽中，多肽Ρ13具有增強(qiáng)H+誘發(fā)ASICla同聚體電流激動(dòng)活性的作用。實(shí)施例5多肽Ρ13對(duì)海馬神經(jīng)元ASIC電流的影響為進(jìn)一步求證Ρ13對(duì)ASICla的作用，本實(shí)驗(yàn)選擇海馬神經(jīng)元作為模型。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)告，海馬神經(jīng)元中酸感受離子通道電流中ASICla同聚體所占比例較大。另外，為去除其它因素的干擾，本實(shí)驗(yàn)所用的多肽為公司合成的純品。1.材料Wistar大鼠(出生12h以內(nèi))，二級(jí)，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供。 L-多聚賴氨酸和阿糖胞苷購自Sigma公司。N-2添加劑和B-27添加劑購自Gibcol。放大器(Axopatch 1-D)、AD轉(zhuǎn)換板(1200series)和電極探頭(CV-4)均購自美國(guó)Axon公司。 微操縱儀(Mo-203)購自日本Narishige公司。P13多肽由賽百盛公司合成。2.實(shí)驗(yàn)方法(1)大鼠海馬神經(jīng)元培養(yǎng)取當(dāng)天新生Wistar大鼠，用75%乙醇消毒。在無菌條件下取腦，剝離出海馬置于冰浴的解剖液(葡萄糖 3. Og，蔗糖 7. 5g，NaCl 8. Og, KCl 0. 4g，Na2HP04 · 7H20 0. 18g， KH2P04 0. 03g，青鏈霉素個(gè)10萬單位，用含9. OmM HEPES的緩沖液溶解，加水到1000ml，調(diào) PH值為7. 3。用0.2μπι的微孔濾膜過濾，4°C保存?zhèn)溆?中。將海馬剪成l_2mm3的組織塊，用含0.25% (質(zhì)量/體積百分比)胰蛋白酶的解剖液在37°C下消化30min，然后將消化好的組織塊移入種植液(DMEM培養(yǎng)基79%，馬血清10%，胎牛血清10%，谷氨酰胺儲(chǔ)備液1%，青鏈霉素100單位/ml，使用前池配制，放在37°C 10% C02培養(yǎng)箱中備用)中終止消化，在種植液中用適當(dāng)口徑(尖端直徑2mm)的滴管吹打細(xì)胞，使之均勻分散，制成細(xì)胞懸液，取少量懸液以臺(tái)盼藍(lán)染液記數(shù)細(xì)胞。加入適量種植液，將細(xì)胞按1 XlO5Ail的密度接種在涂有多聚賴氨酸的35mm培養(yǎng)皿中，置于36°C 10%的二氧化碳培養(yǎng)箱中過夜，24h后更換培養(yǎng)基，將種植液換為2ml飼養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基約86%，馬血清10%，N_2 1%, B-27 2%， 谷氨酰胺儲(chǔ)備液1 %，青鏈霉素100單位/ml，使用前池配制，放在37°C、10% C02培養(yǎng)箱中備用)。以后每3天半量換液一次，培養(yǎng)細(xì)胞在12-15天期間用于膜片鉗實(shí)驗(yàn)。為抑制非神經(jīng)元過度增殖，在培養(yǎng)的第3天向培養(yǎng)基中加入適量阿糖胞苷。(2)膜片鉗方式記錄ASIC電流將培養(yǎng)好的海馬細(xì)胞加入1. 5-2. Oml細(xì)胞外液(NaCl 150mM, KC15mM, MgCl2 2mM, CaCl2 2mM，葡萄糖 10mM，HEPES 10mM，pH7. 45，CNQX20mM，犬尿烯酸 IOmM)。在倒置相差顯微鏡下，通過微操縱儀將充滿電極內(nèi)液的記錄電極輕輕壓向細(xì)胞表面，并通過示波器和放大器的聲音監(jiān)控裝置監(jiān)測(cè)電極電阻的變化。通過記錄電極內(nèi)部施加10-30cmH20負(fù)壓，使電極和細(xì)胞表面形成緊密封接。調(diào)節(jié)放大器進(jìn)行電容補(bǔ)償，建立細(xì)胞貼附式記錄，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)施加負(fù)壓或用1.5V 5-lOms的短時(shí)脈沖擊破細(xì)胞膜，即形成全細(xì)胞記錄。在給予酸性細(xì)胞外液(PH6. 0)后，可記錄到ASIC電流，在酸性胞外液中加入濃度為10μΜ的P13多肽，發(fā)現(xiàn)該多肽對(duì)海馬神經(jīng)元本身的ASIC電流也有刺激作用(n = 3)，當(dāng)換回酸性胞外液時(shí)，可見電流恢復(fù)，表明這種增強(qiáng)作用是可逆的，見圖6。盡管本發(fā)明的具體實(shí)施方式
已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)那些細(xì)節(jié)進(jìn)行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。
權(quán)利要求
1.一種具有酸感受離子通道Ia結(jié)合活性的多肽，其為選自SEQID N0:l_10中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其為SEQID NO :9所示的多肽。
3.一種融合肽，其可操作地連接有一個(gè)或幾個(gè)SEQ ID NO :1-10中所示的肽，所述肽可以相同或不相同。
4.一種融合蛋白，其可操作地連接有一個(gè)或幾個(gè)SEQ ID NO :1-10中所示的肽，所述肽可以相同或不相同，以及一種起靶向作用的蛋白或方便純化的蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的融合蛋白，其中起靶向作用的蛋白是指靶向于特異器官或細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的分子，方便純化的蛋白是指谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶和多聚組氨酸。
6.一種DNA或RNA序列，其編碼權(quán)利要求1_4所述的多肽或蛋白。
7.一種載體，其含有權(quán)利要求6中所述的DNA或RNA序列。
8.權(quán)利要求1-4中所述多肽或蛋白在制備酸感受離子通道Ia靶向治療藥物中的用途。
9.權(quán)利要求2所述的多肽作為酸感受離子通道Ia激動(dòng)劑的用途。
10.一種藥物組合物，其含有權(quán)利要求1-4中所述多肽或蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一組與酸感受離子通道1a(ASIC1a)亞基具有特異性結(jié)合能力及生物學(xué)活性的多肽類分子的序列。使用細(xì)胞電生理技術(shù)證明，其中一個(gè)多肽P13能明顯增加胞外pH值下降誘發(fā)的ASIC1a同聚體電流。本發(fā)明還涉及編碼這些多肽的基因序列以及含有多肽的融合蛋白。本發(fā)明還涉及這些多肽在制備酸感受離子通道1a靶向治療藥物中的用途以及多肽P13作為酸感受離子通道1a激動(dòng)劑的用途。這些多肽在探索ASIC1a離子通道的生物學(xué)功能、研究ASIC1a相關(guān)疾病的病理機(jī)制及其治療方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K19/00GK102234316SQ20101017000
公開日2011年11月9日 申請(qǐng)日期2010年5月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月7日
發(fā)明者于金梅, 劉曉燕, 吳寶紅, 張樹卓, 李昕, 鄭建全, 閆海濤, 馬曉蕓, 魏曉莉 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所