一種重組人血白蛋白及其融合蛋白的分離純化工藝的制作方法

專利名稱：一種重組人血白蛋白及其融合蛋白的分離純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)領(lǐng)域，特別是對重組的人血白蛋白的純化。
背景技術(shù)：
人血白蛋白(HSA)，是血漿中含量最多的蛋白質(zhì)，占血漿總蛋白的40% -60%，它是血漿中很重要的載體，在體液PH7. 4的環(huán)境中，白蛋白為負(fù)離子，每分子可以帶有200個(gè)以上負(fù)電荷。許多水溶性差的物質(zhì)可以通過與白蛋白的結(jié)合而被運(yùn)輸。這些物質(zhì)包括膽紅素、長鏈脂肪酸(每分子可以結(jié)合4-6個(gè)分子)、膽汁酸鹽、前列腺素、類固醇激素、金屬離子 (如Cu2+、Ni2+、Ca2+)藥物(如阿司匹林、青霉素等)。另一個(gè)作用為維持滲透壓。白蛋白的分子結(jié)構(gòu)已于1975年闡明，為含585個(gè)氨基酸殘基的球狀蛋白質(zhì)，分子量為66458Da，分子中含17個(gè)二硫鍵，不含有糖的組分。人血白蛋白基因位于4號(hào)染色體上有16961對堿基對，分為15個(gè)間隔區(qū)。經(jīng)過RNA加工拼接后表達(dá)的m RNA可以編碼一個(gè)具有585個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。人血白蛋白有很大的應(yīng)用及臨床應(yīng)用價(jià)值。例如作為藥物可用于治療因血清白蛋白合成障礙和創(chuàng)傷失血造成的白蛋白含量下降引起的低蛋白血癥；可以作為細(xì)胞培養(yǎng)基的添加成份，可以作為藥物的輔劑，賦型劑；具有活性的激素或藥物當(dāng)與白蛋白結(jié)合時(shí)，可以不表現(xiàn)其活性，而視為其儲(chǔ)存形式，由于這種結(jié)合的可逆性和處于動(dòng)態(tài)平衡，因此在調(diào)節(jié)這些激素和藥物的代謝上，具有重要意義。現(xiàn)在人類是從人血液中分離純化人血白蛋白的。然而這一方法存在巨大的問題， 例如血源的短缺、受到乙肝病毒、AIDS病毒等病原微生物的污染，因此基于重組DNA的技術(shù)方法生產(chǎn)重組人血白蛋白(rHA)的多種方法獲得研發(fā)。利用微生物體重組表達(dá)人血白蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和純化方法可行。這種方法最近已經(jīng)得到了開發(fā)。為數(shù)不少的重組方法可以使用，但從發(fā)酵液中提純r(jià)HA仍是至關(guān)緊要的且隨時(shí)有待提高的步驟。從人血液中分離純化人血白蛋白，抗原性物質(zhì)少，對提純的技術(shù)要求相對較低。 與之相比，利用基因工程重組技術(shù)表達(dá)的白蛋白，外源性物質(zhì)較多，而且由于人血白蛋白注射劑量較大，微量的抗原性物質(zhì)都可能引起過敏反應(yīng)，甚至危害患者的生命安全，因此對基因工程重組人血白蛋白的純度要求更高，純化技術(shù)難度更大。EP0612761公開了一種生產(chǎn)高純度重組人血白蛋白的方法，其產(chǎn)品中不含自由的非抗原性雜質(zhì)。這一方法在特定環(huán)境下運(yùn)用了疏水層析色譜(HIC)，還有其它步驟如離子交換色譜，硼酸或硼酸鹽處理，超濾及加熱處理。然而，這一方法因步驟多而太復(fù)雜，從而難于滿足大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的要求。EP0570916公開了用基因操作技術(shù)生產(chǎn)rHA的方法，該方法包括超濾發(fā)酵上清液、加熱處理、酸處理和再次超濾，隨后使用陽離子交換、疏水層析和陰離子交換以及鹽析等一系列純化步驟。然而，因與EP0612761存在相似的問題，純化過程太復(fù)雜、周期長、成本高而不能成為大規(guī)模生產(chǎn)的有效方法。EP0699687公開的rHA純化方法為加熱細(xì)胞培養(yǎng)液以滅活蛋白酶，再經(jīng)陽離子交換微粒的流化床處理，洗脫液再經(jīng)超濾、HIC和陰離子交換層析而得到純r(jià)HA。然而，流化床對設(shè)備的要求與常規(guī)裝填的層析設(shè)備不同，因而，仍需更經(jīng)濟(jì)有效的方法從發(fā)酵液中純化 rHA。所以，開發(fā)一種穩(wěn)定的、高效的、用于重組人血白蛋白及其融合蛋白的分離純化方
法非常重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種區(qū)別于目前常用的從人血漿中提純?nèi)搜椎鞍椎姆椒ǎ景l(fā)明是一種適合大規(guī)模操作的從發(fā)酵液或哺乳動(dòng)物培養(yǎng)液中分離提純重組人血白蛋白的方法。本發(fā)明可以通過以下層析步驟達(dá)到(1)將含重組人血白蛋白的發(fā)酵上清液進(jìn)行固定化金屬螯合親和層析，(2)將步驟(1)的產(chǎn)物經(jīng)過疏水層析，(3)將步驟O)的產(chǎn)物經(jīng)過陰離子交換層析(疏水型陰離子交換層析)。1975年，Poroth首次提出“固定化金屬螯合親和層析(Immobilized Metal-ChelatedAffinity Chromatography) ”的概念，首次成功地在瓊脂糖上偶聯(lián)了亞氨基二乙酸(IDA)鈉。IDA鈉鹽與金屬離子如Cu++螯合后，可與生物分子如蛋白質(zhì)結(jié)合，不同的蛋白質(zhì)與金屬離子結(jié)合力不同，從而將蛋白質(zhì)分離。后來的研究表明經(jīng)固定的金屬離子不僅與基質(zhì)以螯合形式結(jié)合，還可以離子鍵、共價(jià)鍵形式結(jié)合，或分散在固體基質(zhì)中以膠體狀存在。1983年P(guān)oroth把凡是固定在基質(zhì)上的金屬(不管是否以離子狀態(tài)存在)與溶質(zhì)的親和作用定義為“固定化金屬親和層析(IMAC) ”。目前，固定化金屬螯合親和層析技術(shù)已成為蛋白質(zhì)，特別是基因重組蛋白和多肽分離純化最有效的工具之一。固定化金屬螯合親和層析的基本原理是過渡金屬離子能與電子供體氮、硫、氧等原子以配位鍵結(jié)合，金屬離子上剩余的空軌道是電子供體的配位點(diǎn)，在溶液中被水分子或陰離子占據(jù)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表面氨基酸殘基與金屬離子的結(jié)合力比它們更強(qiáng)時(shí)，則蛋白質(zhì)取代它們與金屬離子形成復(fù)合物，從而使生物分子被吸附。用某種與吸附蛋白質(zhì)競爭結(jié)合的溶質(zhì)洗脫親和基質(zhì)，特異性地將吸附的各種蛋白質(zhì)分別洗脫下來，如咪唑。IMAC填料的基質(zhì)可以選自瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羥乙基甲基丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸環(huán)氧烷、樹脂及上述物質(zhì)的衍生物和共聚物，此外還有大孔硅膠、多孔玻璃、磷灰石等無機(jī)材料。IMAC填料的基質(zhì)上含有配基，常用的配基有亞氨基二乙酸(IDA)、三羥甲基乙二胺(TED)，還有次氨基三乙酸(NTA)、羧甲基取代天冬氨酸(TEPA)及CMASP、CMDASA。已加好配基的IMAC填料有市售的，其中配基為三羥甲基乙二胺(TED)的填料商品名稱為IMAC Sepharose 6Fast Flow，配基為亞氨基二乙酸(IDA)的填料商品名稱為 Chelating Sepharose Fast Flow。與IMAC填料螯合的金屬離子有Cu2+、Ni2+、Zn2\ Co2+等，以Cu2+為最好。本發(fā)明的步驟(1)按照下述工藝進(jìn)行操作我們從GE公司購買IMAC填料(IMAC Sepharose 6Fast Flow 1升)，來裝填 XK50/30層析柱，然后，在IMAC填料上螯合金屬離子。方法是使用0. 5倍層析柱體積的0. 2M金屬離子溶液，優(yōu)選為銅離子溶液，流過層析柱，銅離子會(huì)與配基結(jié)合，再用純化水洗去未與配基結(jié)合的金屬離子。然后用含10-200mmol/L磷酸鹽、10-1500mmol/L氯化鈉、pH6-8的緩沖液A平衡層析柱，優(yōu)選含20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、pH7. 5的緩沖液A，直到流入層析柱的緩沖液與流出層析柱的緩沖液的電導(dǎo)值、PH值相同，可視為已經(jīng)平衡好。然后將含有重組人血白蛋白的樣品調(diào)整到與緩沖液A相同的條件，優(yōu)選含 10-IOOmmol/L 磷酸鹽、10-1500mmol/L 氯化鈉、pH6_8。然后將調(diào)整好的含有重組人血白蛋白樣品的液體通過層析柱，用緩沖溶液A洗去未被層析柱吸附的物質(zhì)。然后用含10-200mmol/L 磷酸鹽、10-1500mmol/L 氯化鈉、0. 1-1. OM 咪唑，pH6_8 的緩沖液B來洗脫目標(biāo)蛋白，優(yōu)選為20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、0. 3M咪唑、pH7. 5的緩沖液B，收集緩沖溶液B的洗脫峰。其重組人血白蛋白的純度可達(dá)65% -70%。在進(jìn)入步驟(1)前，可以在穩(wěn)定劑和還原劑存在的條件下，對發(fā)酵上清液進(jìn)行熱處理。其中穩(wěn)定劑是辛酸鈉，還原劑是半胱氨酸。本發(fā)明的步驟(1)使用了 IMAC柱層析，適用于各種鹽濃度下的重組蛋白質(zhì)的純化，并允許含較高鹽濃度的發(fā)酵上清液直接上樣，甚至高達(dá)1. 5M鹽濃度的樣品也可以直接上樣。這一優(yōu)點(diǎn)可有效減少上樣液總體積或省去超濾脫鹽的步驟而降低成本。還可以在 PH6-8的條件下吸附重組白蛋白，避免了在低PH值條件下(pH3-5)重組白蛋白被蛋白酶降解。IMAC柱層析還適用于實(shí)驗(yàn)室、中試及工業(yè)化生產(chǎn)的重組人血白蛋白的有效分離和純化工作。本發(fā)明的另一個(gè)目的是除去重組人血白蛋白中的蛋白降解產(chǎn)物及降低色素含量， 以便進(jìn)一步提高終產(chǎn)品的純度。將步驟(1)獲得的目標(biāo)蛋白進(jìn)一步經(jīng)過步驟O)的疏水層析，可以達(dá)到上述目的。疏水層析(HIC)是眾所周知的色譜技術(shù)，其分離原理是基于蛋白表面疏水性的差異。許多被認(rèn)為是親水性的生物大分子，仍然有足夠多的疏水基團(tuán)暴露在外面，使其與連接于色譜基質(zhì)的疏水基團(tuán)相互作用。例如在專利EP0699687中，疏水層析早被建議用于重組人血白蛋白的純化。本發(fā)明步驟O)的疏水層析可以除去重組人血白蛋白中的重組人血白蛋白的降解產(chǎn)物，這些降解產(chǎn)物分子量通常在10-50Kda。應(yīng)用疏水層析吸附重組人血白蛋白的降解產(chǎn)物，而全長的重組人血白蛋白在未結(jié)合部分被洗脫。重組人血白蛋白的降解產(chǎn)物與介質(zhì)疏水基團(tuán)之間的疏水作用強(qiáng)度可以通過小幅度提高所使用的緩沖液的離子強(qiáng)度而得以加強(qiáng)。目前許多市售的疏水介質(zhì)都是可以使用的，生產(chǎn)廠家有美國通用公司(GE公司) 和日本東曹達(dá)公司(T0S0H公司)等，本發(fā)明對疏水介質(zhì)不限定任何特定的基質(zhì)和/或基質(zhì)上的配基。疏水介質(zhì)的實(shí)例比如但不限于美國通用公司的Wienyl Sepharose 6FF high sub, Phenyl S印harose 6FF low sub, ButylS印harose FF ；日本 TOSOH 公司的 Butyl-650M、Pheny 1-650M、Ether-650S 等等。所用基質(zhì)可為有機(jī)材料或無機(jī)材料。有機(jī)材料例如天然聚合物如瓊脂糖、葡聚糖、 纖維素、淀粉等，或合成聚合物如二乙烯苯、苯乙烯。無機(jī)材料有大孔硅膠、多孔玻璃等，其中硅膠是眾所周知的廣泛使用的一種。基質(zhì)上的配基可以是苯基、丁基、辛基、醚、異丙基等。步驟⑵的疏水介質(zhì)與重組人血白蛋白之間可以有一個(gè)或多個(gè)作用位點(diǎn)。優(yōu)選以瓊脂糖為基質(zhì)的介質(zhì)，優(yōu)選含有苯基、丁基如正丁基、辛基如正辛基等的配基。還優(yōu)選以二乙烯苯為基質(zhì)、以醚、異丙基或苯基為配基的介質(zhì)，例如GE公司的Source 。步驟(2)最優(yōu)為應(yīng)用交聯(lián)瓊脂糖連結(jié)苯基配基的介質(zhì)，商品名稱為美國通用公司生產(chǎn)的 Phenyl S印harose 6FF high sub。步驟( 的疏水層析可以在pH4_8，優(yōu)選pH6. 5-7,鹽濃度0. 1-0. 5M之間進(jìn)行。過程是先用含10-100讓01/1磷酸鹽、10-500讓01/1氯化鈉、？!16-8的緩沖液C來平衡疏水層析柱，優(yōu)選含50mmol/L磷酸鹽、0. 5M氯化鈉、pH6. 5的緩沖液C ；然后將步驟(1)得到的樣品調(diào)節(jié)到緩沖液C的條件；然后將樣品流過疏水層析柱，并用緩沖液C洗脫未與層析柱吸附的部分；最后，收集流穿和未與層析柱吸附的部分。在步驟⑵之前，可以在穩(wěn)定劑，還原劑和金屬螯合劑存在下，對步驟⑴得到的產(chǎn)物進(jìn)行熱處理。其中穩(wěn)定劑是辛酸鈉，還原劑是半胱氨酸，金屬螯合劑是EDTA。與疏水作用分離原理相似的反相色譜相比，疏水層析使用的配基濃度低得多。這一特點(diǎn)提高了其選擇性，并且可使用溫和的洗脫條件以助于保持目的蛋白的生物活性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是有效地去除rHA聚體，同時(shí)去除內(nèi)毒素。將步驟O)獲得的目標(biāo)蛋白進(jìn)一步經(jīng)過步驟(3)的陰離子交換層析，可以達(dá)到上述目的。陰離子交換層析介質(zhì)可以使用GE公司的Q Sepharose Fast Flow、QSepharose high preformance>DEAE Sepahrose Fast Flow、Q Sepharose highpreformance 或Capto adhere ；或 T0S0H 公司的 T0Y0PEARL 樹脂QAE、SuperQ、DEAE ；或 BIO-RAD 公司的 UN0SPHERE Q ；或 PALL 公司的 Q CeramicHyperD 20、Q Ceramic HyperF^DEAE Ceramic HyperD F 等填料。Q介質(zhì)除了具有去除雜蛋白及色素的功能，還具有去除融合蛋白樣品中聚合物和濃縮樣品的功能。復(fù)合型填料Capto adhere具有陰離子交換和疏水作用的雙重性質(zhì)，它至少包含了與目的物作用的兩個(gè)位點(diǎn)，一個(gè)提供電荷相互作用，一個(gè)提供基于氫鍵和/或疏水的相互作用。此介質(zhì)能有效地去除核酸、宿主蛋白、二聚體、多聚體、病毒。在步驟C3)之前，可以將步驟( 得到的產(chǎn)物經(jīng)過IOK的超濾膜脫鹽，將溶液里的鹽脫掉。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，在步驟(3)陰離子交換層析之前，使用硼酸鹽和氯化鈣，在PH9.0條件下處理步驟( 得到的層析液0. 5-M小時(shí)，能有效地降低糖及宿主蛋白的殘留量，同時(shí)能促使重組人血白蛋白的聚體向重組人血白蛋白單體轉(zhuǎn)化。本發(fā)明提供了一種從發(fā)酵液或哺乳動(dòng)物培養(yǎng)液中分離提純重組人血白蛋白及其融合蛋白的方法。在本申請中，發(fā)酵上清液是通過克隆技術(shù)構(gòu)建含人血白蛋白基困的畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，得到發(fā)酵液，然后用日立大容量高速冷凍離心機(jī)(型號(hào)CR21G)在IOOOOg條件下，離心20分鐘，取上清液體除菌過濾后得到。與以往方法相比，操作步驟少、操作穩(wěn)定、 純化方法簡單、具有獨(dú)特性。各步驟建立在等度洗脫的基礎(chǔ)上，因此適于實(shí)驗(yàn)室、中試及工業(yè)化生產(chǎn)放大。特別是步驟(1)使用的IMAC柱層析，適用于各種鹽濃度下的重組蛋白質(zhì)的純化，允許含較高鹽濃度的發(fā)酵上清液直接上樣。有效減少了上樣液總體積，省去超濾脫鹽的成本。還可以在PH6-8的條件下吸附重組白蛋白，避免了在低PH值條件下(ρΗ34)重組白蛋白被蛋白酶降解。


附圖1、純化前的發(fā)酵液樣品分析圖譜發(fā)酵液樣品經(jīng)TSK-SW3000分析，顯示純度12%設(shè)備Agilent1200 液相色譜儀，液相色譜柱 TSK-GEL G3000SffXL 7. 8 X 300mm 色譜條件流動(dòng)相含1 %異丙醇的pH7. 0的0. 2mol/L磷酸鹽緩沖液(取0. 5mol/L磷酸二氫鈉200ml,0. 5mol/L磷酸氫二鈉420ml、異丙醇15. 5ml及水914. 5ml，混勻)流速0. 6ml/ min，檢測波長280nm，進(jìn)樣量20 μ 1，運(yùn)行時(shí)間等度運(yùn)行30分鐘，柱溫室溫附圖2、經(jīng)過本專利工藝純化后的樣品分析圖譜經(jīng)過實(shí)施例1方法獲得的樣品純化后樣品經(jīng)TSK-SW3000分析，顯示純度99%以上附圖3、非還原電泳SDS-PAGE圖譜其中分離膠濃度(12% )、上樣量(8ug) 由左至右由左至右IMaker2參照的人血白蛋白樣品3發(fā)酵液4金屬螯合層析目的蛋白收集液5疏水層析樣品6陰離子層析后樣品7Capto adhere 層析后樣品
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例公用于說明本發(fā)明而不限制于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1 步驟(1)用固定化金屬螯合親和層析(IMAC)來捕獲樣品填料IMAC Sepharose 6Fast Flow 1升購自于GE公司，自己裝填層析柱，XK50/30 柱子，柱直徑5cm，填料高度15cm，用純化水沖掉保存液(20%乙醇)。用0. 5倍柱體積的0. 2M硫酸銅溶液過柱，用純化水沖掉未被吸附的銅離子。然后使用緩沖液A :20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、pH7. 5，平衡層析柱。把含人血白蛋白的發(fā)酵上清液加入磷酸鹽、氯化鈉、使之的達(dá)到20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L 氯化鈉、pH7. 5。然后使用AKTATMPurify層析系統(tǒng)上樣，流速50ml/min。上樣后，用緩沖液A洗滌， 至吸收值達(dá)到基點(diǎn)。用緩沖液B :20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、0. 3M咪唑、PH7. 5來洗脫目標(biāo)蛋白，收集緩沖溶液B的洗脫峰。
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步驟( 用疏水層析(HIC)進(jìn)行純化對步驟(1)收集的B緩沖溶液洗脫峰進(jìn)行疏水層析純化。用苯基疏水層析介質(zhì)Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub) (GE 公司)來裝填直徑5cm的層析柱，柱高15cm。利用其它疏水性介質(zhì)也具有相同的分離效果，但其疏水性與苯基介質(zhì)的疏水性有所不同，試驗(yàn)者可根據(jù)所分離的目標(biāo)蛋白的疏水性來選擇。介質(zhì)在使用前需用3倍柱體積的緩沖液C :50mmol/L磷酸鹽、0. 5M氯化鈉、PH6. 5平衡。向步驟(1)得到含目標(biāo)蛋白的B緩沖溶液的洗脫液中加入去離子水，稀釋至 0. 5MNaCl的濃度，用磷酸調(diào)pH值至6. 5。用AKTA Purify層析系統(tǒng)上樣，流速50ml/min，上樣結(jié)束后，用2倍柱體積的緩沖液C :50mmol/L磷酸鹽、0. 5M氯化鈉、PH6. 5繼續(xù)洗脫。收集流穿峰和用緩沖液C的洗脫峰。 與疏水層析柱結(jié)合的部分，用2倍柱體積的去離子水洗脫，流出液丟棄。將疏水層析柱收集液，加入終濃度為0. IM的四硼酸鈉和氯化鈣溶液，調(diào)節(jié)pH至 9. 0，處理0. 5-24小時(shí)，然后IOOOOrpm離心20min，取上清液，用MIPP0RE公司的IOK超濾膜脫鹽。步驟(3)使用陰離子交換層析精制樣品裝Q S印harose High Preformance ±真料于一根直徑2. 6cm、高15cm的層析柱子中，填料體積80毫升。用2倍柱體積的去離子水洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液E(50mM PB, pH7. 0)平衡。上樣后使用2個(gè)柱體積的緩沖液E洗滌。然后用0-0. 5M NaCl經(jīng)10倍柱體積梯度洗脫，收集主峰。實(shí)施例2:步驟(1)用金屬螯合層析介質(zhì)的層析柱來捕獲樣品填料Chelating購自于GE公司，自己裝填層析柱，直徑5cm，填料高度15cm，用純化水沖掉保存液(20%乙醇)然后用0. 5倍柱體積的0. 2M硫酸銅溶液過柱，然后用純化水沖掉未被吸附的銅離子。使用平衡液A :20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、pH7. 5平衡層析柱，然后把含目標(biāo)蛋白的樣品調(diào)整到緩沖液與A相同的條件，即20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、 PH7. 5。然后使用AKTA Purify層析系統(tǒng)上樣，流速50ml/min。上樣后，用平衡液A洗滌，至吸收值達(dá)到基點(diǎn)，流出液棄去。然后用緩沖液B :20mmol/L磷酸鹽、600mmol/L氯化鈉、0. 3M咪唑、PH7. 5的緩沖液來洗脫目標(biāo)蛋白，收集緩沖溶液B的洗脫峰。步驟( 利用疏水層析填料(HIC)進(jìn)行純化用實(shí)施例(1)中收集的B緩沖溶液洗脫峰的純化，來說明利用疏水性介質(zhì)來純化目標(biāo)蛋白。用苯基(Phenyl Sepharose 6Fast Flow (high sub)GE公司)層析介質(zhì)來裝填直徑5cm的層析柱，柱高15cm，用于疏水性分離。其它疏水性介質(zhì)也具有相同的分離效果，但疏水性與苯基的疏水性有所不同，試驗(yàn)者可根據(jù)所分離的目標(biāo)蛋白的疏水性來選擇。
介質(zhì)在使用前需用3倍柱體積的緩沖液C :50mmol/L磷酸鹽緩沖液、0. 5M氯化鈉、 PH6.5平衡，將實(shí)施例(1)步驟(1)中得到的含目標(biāo)蛋白的溶液加入去離子水稀釋至0.5M NaCl的濃度，用磷酸調(diào)pH值至6. 5。用AKTA Purify層析系統(tǒng)上樣，流速50ml/min。上樣結(jié)束后，用2倍柱體積的緩沖液-C :50mmol/L磷酸鹽緩沖液、0. 5M氯化鈉、PH6. 5繼續(xù)洗脫。收集流穿峰和用緩沖液C 的洗脫峰。與疏水層析柱結(jié)合部分用2倍柱體積的去離子水洗脫，流出液棄去。將疏水層析柱收集液，加入終濃度為0. IM的四硼酸鈉和氯化鈣，調(diào)節(jié)pH至9. 0， 處理0. 5-24小時(shí)，然后IOOOOrpm離心20min，取上清液，用Millipore公司的IOK超濾膜脫鹽。步驟(3)使用離子交換介質(zhì)精制樣品裝 Q Sepharose High Preformance 介質(zhì)于一根直徑 2. 6cm 高 15cm 的層析柱子 (填料體積80毫升)中。用2倍柱體積的去離子水洗滌，然后用5倍柱體積的緩沖液E (50mM PB，pH7. 0)平衡。上樣后使用2個(gè)柱體積的緩沖液E洗滌。然后用0-0. 5MNaCl經(jīng)10倍柱體積梯度洗脫，收集主峰。Q介質(zhì)除了具有去除雜蛋白的功能，還具有去除融合蛋白樣品中聚合物和濃縮樣品的功能。
權(quán)利要求
1.一種純化重組人血白蛋白的方法，該方法包括以下層析步驟(1)將含重組人血白蛋白的發(fā)酵上清液，進(jìn)行固定化金屬螯合親和層析，(2)將步驟(1)的產(chǎn)物經(jīng)過疏水層析，(3)將步驟O)的產(chǎn)物經(jīng)過陰離子交換層析(疏水型陰離子交換層析)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中固定化金屬螯合親和層析填料的基質(zhì)選自下列的一種或多種瓊脂糖、纖維素、葡聚糖、聚酰胺、聚碳酸酯、聚羥乙基甲基丙烯酸酯、聚砜、聚乙烯醇、聚丙烯酸環(huán)氧烷、樹脂、或上述物質(zhì)的衍生物和共聚物、或大孔硅膠、多孔玻璃、磷灰石。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，所述基質(zhì)材料是瓊脂糖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，固定化金屬螯合親和層析填料的基質(zhì)上含有的配基選自亞氨基二乙酸、三羥甲基乙二胺和次氨基三乙酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中配基選自三羥甲基乙二胺或亞氨基二乙酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，與固定化金屬螯合親和層析填料螯合的金屬離子選自 Cu++、Ni++、Zn++ 或 Co++。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述金屬離子為Cu++。
8.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中在進(jìn)入步驟(1)前，在穩(wěn)定劑和還原劑存在的條件下，對發(fā)酵上清液進(jìn)行熱處理。
9.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中在步驟( 之前，在穩(wěn)定劑，還原劑和金屬螯合劑存在下，對步驟(1)得到的產(chǎn)物進(jìn)行熱處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的方法，其中穩(wěn)定劑是辛酸鈉，還原劑是半胱氨酸，金屬螯合劑是EDTA。
11.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中步驟( 所使用疏水層析介質(zhì)是含有苯基、脂肪族和/或雜環(huán)為配基的疏水層析介質(zhì)。
12.根據(jù)前面任一權(quán)利要求所述的方法，其中在步驟(3)之前，將步驟(2)得到的產(chǎn)物經(jīng)過超濾膜脫鹽。
全文摘要
本發(fā)明區(qū)別于目前常用的從人血漿中提純?nèi)搜椎鞍椎姆椒?，提供了一種從發(fā)酵液或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)液中分離提純重組人血白蛋白的簡單方法。本發(fā)明使用的固定化金屬螯合親和層析(IMAC)步驟，適用于各種鹽濃度下的重組蛋白質(zhì)的純化，允許含較高鹽濃度的發(fā)酵上清液直接上樣，有效地減少了上樣液總體積，降低成本。本發(fā)明方法穩(wěn)定、高效，并適于實(shí)驗(yàn)室、中試及工業(yè)化生產(chǎn)放大。
文檔編號(hào)C07K1/20GK102234332SQ20101015498
公開日2011年11月9日 申請日期2010年4月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月26日
發(fā)明者王歡, 白驊, 聶磊, 蔡秀云, 郭婷婷 申請人:浙江海正藥業(yè)股份有限公司