專利名稱：一種高純度丹酚酸a的批量制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高純度丹酚酸A的批量制備方法。
背景技術(shù)：
丹參是我國心腦血管病的基本治療藥物，因療效確切，丹參已成為我國用量最大 (1. 5萬噸/年)、銷售額最高、制劑生產(chǎn)廠最多的中藥(制劑生產(chǎn)廠960家，劑型主要有丹參滴丸、丹參注射液、丹參片、丹參顆粒、丹參沖劑和丹參膠囊)，此外丹參還與其它藥材復(fù)方，用于肺心病、高脂血癥、高血粘度綜合征、哮喘、支氣管肺炎、肝炎、肝硬化、腎病綜合征、 關(guān)節(jié)炎、糖尿病循環(huán)障礙、各種細菌性和病毒性感染、抗內(nèi)毒素、腫瘤、硬皮病、皮膚炎、銀屑病、過敏性紫癜、紅斑狼瘡、血栓閉塞性脈管炎、痤瘡、難治性癲癇、視網(wǎng)膜病變等多種疾病的治療。丹參的主要有效成分是丹酚酸?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹酚酸是以抗氧化、抗炎(通過NF-κ β途徑抑制多種炎性細胞因子表達)為特點、同時具有保護脈管內(nèi)皮細胞、降脂、 升高高密度脂蛋白、保護心肌缺血缺氧、擴張冠脈血管、改善微循環(huán)、抑制血小板聚集、抑制纖維蛋白原合成、激活纖溶、抑制血栓形成、螯合鈣鐵離子等多種藥理作用。在所有已知酚類化合物中(包括黃酮類化合物)丹酚酸類化合物的抗氧化活性最強，其中又以丹酚酸 A(salvianolic acid A，SA)的活性最佳〔《中草藥現(xiàn)代研究》II，1996，498-533. Yi Yang Hu et al. ， World JGastroentero, 2000 ；6 (3) :402-404. Cheng Hai Liu et al. ， World J Gastroentero,2000 ；6 (3) :361-364. Yun-Lian Lin et al. J. Nat. Prod. 2002,65,745-747. Lin YL et al. . J. Ethnopharmaco1. 2005.Chen YF et al. . J. Chromatogr A.2005 ； 1088(1-2) :140-5. Hsu YC et al. . J Biomed Sci. 2005 ；12(1) :185-95. Lay IS et al.. J Surg Res. 2003 ；115 (2) :279-85. Lay IS et al. . Planta Med. 2003 ；69(1) :26-32. Chen YL et al. . J CellBiochem. 2001 ；83 (3) :484-93. Chen YH et al. . J Cell Biochem. 2001 ； 82(3) :512-21. Hung HH et al.. Histol Histopathol. 2001 ；16(1) :175-83. Wu YJ et al.. ArteriosclerThromb Vasc Biol. 1998 ；18 (3) :481-6.〕，但是，丹參中丹酚酸 A 的天然含量及其純化技術(shù)一直制約著丹酚酸A的研發(fā)。丹參藥材中，主要含丹酚酸B，丹酚酸A的含量約為0.03% 0.06%。在高溫處理丹參提取物制備丹酚酸A的技術(shù)建立，基本解決了其資源供給后，丹酚酸A的開發(fā)利用主要面臨批量分離純化的挑戰(zhàn)。中國專利CN1830947首次公開了的條件為101 140°C處理0. 5 M小時。隨后， CN100999470對CN1830947條件進行了細化，公開了丹參提取物或丹參總酚酸在pH3. 5 6. OUlO 130°C下處理1 6小時制備丹酚酸A的條件。我國學(xué)者李連良首次用制備薄層餼譜自丹參藥材中制備了丹酚酸A(Lian-Niang L et al. Planta Med. 1984 50(3) :227-8.)。臺灣學(xué)者林云蓮(Lin YL et al. J Nat Prod. 2002 ；65 (5) :745-7. 19. Journal of the Chinese Chemical Society,2003,50, 1079-108)報道了由大孔樹脂HP20結(jié)合葡聚糖疑膠s印hadex LH-20制備丹酚酸A方法。
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CN1397276公開了聚酰胺或大孔樹脂+硅膠兩次色譜法純化丹酚酸A的方法。 CN1830947和CN1887849公開了大孔樹脂、離子交換樹脂、葡聚糖疑膠s印hadex LH-20、反相樹脂MCI-GEL-CHP-20P、C8或C18 —次色譜法制備丹酚酸A的方法。CN1958555公開了大孔樹脂、聚酰胺、離子交換樹脂、葡聚糖疑膠s印hadex LH-20、反相樹脂MCI-GEL-CHP-20P、 C8或C18兩次色譜制備丹酚酸A的方法。CN100999470公開了大孔樹脂+硅膠、聚酰胺或葡聚糖疑膠s印hadexLH-20的兩次色譜制備丹酚酸A的方法。但由于丹酚酸A水溶性高、不結(jié)晶、共存大量性質(zhì)相近化合物和擬“膠體”類雜質(zhì)， 目前文獻報道和專利公開的純化技術(shù)或不能批量制備(如葡聚糖疑膠s印hadex LH-20價格高昂、流速低、處理量?。籆8或Q8處理量小、壽命短)，或產(chǎn)品達不到安全可控的藥用要求，致使丹酚酸A至今沒有得到實際應(yīng)用。根據(jù)色譜行為(附圖1和附圖2)，丹A待分離體系的化學(xué)物質(zhì)分為四大類1、前沿雜質(zhì)(主要是以丹參酮為代表的低極性物質(zhì))；2、酚酸類雜質(zhì)(主要是丹參素、原兒茶醛和丹B) ；3、丹A鄰近雜質(zhì)；4、擬“膠體”類雜質(zhì)(主要是以在TLC分析中原點處物質(zhì)為代表的一類雜質(zhì))。前沿雜質(zhì)較容易分離，大孔吸附樹脂便可有效實現(xiàn)；酚酸類雜質(zhì)無論在反相色譜或正相色譜上均具有滿足批量制備的分離度(分離度>2)，分離難度不大。丹A原料藥制備所面臨的挑戰(zhàn)是鄰近雜質(zhì)和擬“膠體”類雜質(zhì)的分離。其中，擬“膠體”類雜質(zhì)是從色譜行為上對植物中目前尚未給出明確化學(xué)表征的一類物質(zhì)。該類物質(zhì)在正相和反相TLC上均主要集中于原點，卻又少量全程分布于正相和反相TLC上；在TLC上沒有明確的斑點，在HPLC又無明確的UV吸收峰；在任何極性的洗脫液洗脫時，都有少量被洗脫。這一獨特的行為使擬“膠體”類雜質(zhì)去除成為天然產(chǎn)物分離純化關(guān)鍵問題之一，特別是對那些不能結(jié)晶的化合物。它的去除與否在很大程度上決定了目標化合物的純度是否滿足藥用要求。作為口服制劑，只有在腸道游離的目標化合物才能被吸收，膠體與目標化合物相互作用強，影響生物利用度；作為注射劑，刺激、過敏、凝聚試驗和異常毒性均可能與這類物質(zhì)密切相關(guān)。目前，分離擬“膠體”類化合物的相關(guān)技術(shù)有1、膜分離技術(shù)；2、CW反相色譜；3、溶劑萃??；膜分離技術(shù)盡管能有效去除擬“膠體”類雜質(zhì)，但因其屬于非切向力分離技術(shù)，目標化合物往往與這類雜質(zhì)有極高親和力，而導(dǎo)致目標化合物損失嚴重。此外，膜技術(shù)用于這類雜質(zhì)的分離時，還面臨膜孔阻塞和膜壽命的問題。溶劑萃取技術(shù)中溶劑的選擇性至關(guān)重要，效果也不理想。傳統(tǒng)的C18反相色譜因使用上樣量小、pH范圍有限、不能進行有效再生、壽命短、受限于成本等因素，不能廣泛使用。綜上所述，目前迫切需要一個產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控、成本可接受、可供注射藥用的丹酚酸A的批量生產(chǎn)方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一個產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控、成本可接受、可供注射藥用的丹酚酸A的批量生產(chǎn)方法。
一種高純度丹酚酸A的批量制備方法，其包含下列步驟(1)采用聯(lián)合色譜法初步純化丹酚酸A，所述的聯(lián)合色譜法為大孔樹脂前沿色譜與大孔樹脂置換色譜聯(lián)用；(2)反相色譜進一步純化丹酚酸A ；(3)正相色譜精制丹酚酸A。其中，步驟(1)所述前沿色譜中的填料選自大孔吸附樹脂ADS-5、DlOl或DM130， 所述置換色譜的填料選自大孔吸附樹脂ADS-8或HPD100，前沿色譜的填料與置換色譜的填料重量比為(0.5 1) 4。優(yōu)選的，步驟(1)前沿色譜填料為大孔吸附樹脂ADS-5，置換色譜填料為ADS-8，前沿色譜的填料與置換色譜的填料重量比為1 5。其中，步驟(1)所述的聯(lián)合色譜法是前沿色譜柱與置換色譜柱串聯(lián)，丹參酚酸B 轉(zhuǎn)化液按先前沿色譜柱后置換色譜柱的順序上樣后，用20% 25%的醇溶液洗脫至洗脫液中檢出丹參酚酸A，斷開兩柱，置換色譜柱用30-50%的醇溶液洗脫收集丹參酚酸A至丹參酚酸A微量，再用50-70 %的醇洗脫收集含雜質(zhì)的丹參酚酸A，前沿色譜柱直接再生使用。優(yōu)選的，步驟(1)所述的色譜聯(lián)用方法是前沿色譜柱與置換色譜柱串聯(lián)，丹參酚酸B轉(zhuǎn)化液按先前沿色譜柱后置換色譜柱的順序上樣后，用22%的醇溶液洗脫至洗脫液中檢出丹參酚酸A，斷開兩柱，置換色譜柱用40%的醇溶液洗脫收集丹參酚酸A至丹參酚酸A 微量，再用60%的醇洗脫收集含雜質(zhì)的丹參酚酸A，前沿色譜柱直接再生使用。其中，丹參酚酸A與置換色譜填料的重量比為1 (30 50)。優(yōu)選的，丹參酚酸A與置換色譜填料的重量比為1 40。其中，步驟⑵所述的反相色譜填料為反相樹脂CG161、SBC-MCI-GEL或 MCI-GEL-CHP-20P,丹參酚酸A與反相色譜填料的重量比為1 (30 50)。優(yōu)選的，丹參酚酸A與反相色譜填料的重量比為1 40，反相色譜填料為CG161。其中，步驟( 所述的反相色譜操作為上樣后，用20% 25%醇溶液洗脫至洗脫液中檢出丹參酚酸A，再用35% 40%醇溶液洗脫收集丹參酚酸A至丹參酚酸A微量，最后用50 70%醇溶液洗脫收集含雜質(zhì)的丹參酚酸A。優(yōu)選的，步驟( 所述的反相色譜操作為上樣后，用22%醇溶液洗脫至洗脫液中檢出丹參酚酸A，再用38 %醇溶液洗脫收集丹參酚酸A至丹參酚酸A微量，最后用60 %醇溶液洗脫收集含雜質(zhì)的丹參酚酸A。其中，所述醇溶液為甲醇、乙醇或丙醇水溶液。其中，步驟(3)所述的正相色譜填料為色譜硅膠，粒度100 200目。其中，步驟(3)所述的正相色譜操作為乙酸乙酯萃取經(jīng)步驟(2)純化的丹參酚酸 A水溶液，濃縮乙酸乙酯萃取液至固含量約20% 30%，加入丹參酚酸A含量2 2. 5倍的色譜硅膠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥制成流動性固體樣品，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端，硅膠濕柱依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯，或者8/2或7/3的正己烷/丙酮，或者95/5 或98/2的氯仿/甲醇，或者95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脫完雜質(zhì)，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯，或者7/3或6/4的正己烷/丙酮，或9/1的氯仿/甲醇，或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脫收集丹參酚酸A，最后用6/4或5/5的正己烷/乙酸乙酯，或者6/4或5/5 正己烷/丙酮，或85/15氯仿/甲醇或85/15 二氯甲烷/甲醇洗脫合并的含雜質(zhì)的丹參酚酸A。綜上所述，本發(fā)明通過將含丹酚酸A的丹酚酸B轉(zhuǎn)化液經(jīng)聯(lián)合色譜、反相色譜和正相硅膠色譜三次色譜純化，分離鄰近雜質(zhì)的主要策略是正相色譜與反相色譜聯(lián)用，從而在正相色譜上不能有效分離的非同類物質(zhì)往往在反相色譜上極易分離，丹A待分離體系中的鄰近雜質(zhì)是非酚酸類化合物，剛好滿足這一要求，另外，本發(fā)明進一步通過反相色譜和正相硅膠色譜，并合理的配置各種填料的加入量，從而大大提高了分離丹A擬“膠體”類雜質(zhì)的效率，并且成本大大降低。采用本發(fā)明提供的方法，可有效去除提取物中大量的擬“膠體”類雜質(zhì)，經(jīng)濟方便，大大降低了后續(xù)分離負荷。并且待分離體系與樹脂適應(yīng)性好時，也能用于單體化合物的純化，從而為大批量生產(chǎn)丹酚酸A提供了產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控、成本可接受、可供注射藥用的方法。使用本方法制備的丹酚酸A含量>98%，丹酚酸A總收率> 10% (以丹酚酸B計)，總產(chǎn)率彡0.5% (以丹參藥材計)。
圖1丹參化學(xué)成分的TLC圖譜圖2丹參化學(xué)成分的HPLC圖譜圖3丹酚酸A制備的工藝流程4工藝流程圖-丹A的樹脂純化圖5工藝流程圖-丹A的反相色譜純化
圖6工藝流程圖-丹A的正相色譜純化圖7產(chǎn)品樣品的TLC圖譜圖8產(chǎn)品樣品的HPLC圖譜圖9產(chǎn)品樣品的紫外吸收光譜圖10產(chǎn)品樣品的紅外吸收光譜圖11產(chǎn)品樣品的高分辨質(zhì)譜圖譜圖12產(chǎn)品樣品的電噴霧電離負離子質(zhì)譜圖譜圖13產(chǎn)品樣品的1H-NMR圖譜圖14產(chǎn)品樣品的"C-NMR圖譜其中，附圖1中的各數(shù)字所代表的含義和具體條件為，1 丹酚酸B ；2 丹酚酸A ；3 丹參水提物；4 :65%丹酚酸B ；色譜條件C18柱(4. 6mmX 250mm，5 μ m)，流速1. Oml/min， 檢測波長觀011111，流動相梯度為0 8分鐘，8 18%B;8 15分鐘，18 21 % B ； 14 40 分鐘，21 34% B ；溶劑劑 A =H3PO4 H2O = 0. 02 100 ；溶劑劑 B =H3PO4 CH3CN = 0. 02 100]。附圖8中的具體條件為色譜條件ODS柱(4. 6mmX 250mm, 5 μ m)；流動相乙腈-O. 2%磷酸水(30 70)；檢測波長:285nm ；柱溫:30°C ；流速1. Oml/min。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖詳細對本發(fā)明進行描述。經(jīng)過系統(tǒng)的填料篩選、單元技術(shù)優(yōu)化和單元技術(shù)組合的優(yōu)化，本發(fā)明提供了一種高純度丹酚酸A的批量制備方法，其過程包含以下步驟
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1、大孔樹脂前沿色譜與大孔樹脂置換色譜聯(lián)用初步純化丹酚酸A ；2、反相色譜色譜進一步純化丹酚酸A ；3、正相色譜聯(lián)用精制丹酚酸A。步驟1所述前沿色譜的填料選自大孔吸附樹脂ADS_5、D101或DM130，所述置換色譜的填料選自大孔吸附樹脂ADS-8或HPD100，前沿色譜的填料與置換色譜的填料重量比為 (0. 5 1) 4。步驟1所述的色譜聯(lián)用方法是丹B轉(zhuǎn)化液(pH3. 0)—上樣串聯(lián)色譜柱(ADS-5樹脂前沿色譜柱與HPD-100樹脂置換色譜柱串聯(lián))—20%酸性乙醇(lmoL/L H3PO4調(diào)pH至 3. 0)洗脫至純丹A出現(xiàn)(按柱體積收集洗脫液，TLC定性檢測，分雜質(zhì)和前雜丹A兩段合并)一斷開兩柱。置換色譜柱一40%乙醇溶液洗脫至丹A微量(按柱體積收集洗脫液，TLC 定性檢測)一60%乙醇溶液洗脫殘留丹A至無丹A (按柱體積收集洗脫液，TLC定性檢測， 分純丹A、后雜丹A和雜質(zhì)三段合并)。分別合并I級純丹A、雜質(zhì)丹A和雜質(zhì)三段一專用納濾機過濾濃縮一I級純丹A濃縮液、雜質(zhì)丹A濃縮液和雜質(zhì)濃縮液(濾過液可重復(fù)使用)。 雜質(zhì)丹A濃縮液一減壓濃縮(50°C)回收乙醇一無醇雜質(zhì)丹A濃縮液一并入下次丹B轉(zhuǎn)化液一再次分離。雜質(zhì)濃縮液一減壓濃縮(50°C)回收乙醇一無醇雜質(zhì)濃縮液一棄去(附圖 4)。置換色譜柱一>80%乙醇洗脫3BV再生一去離子水洗脫2BV—下次使用。前沿色譜柱一> 80%乙醇洗脫3BV —去離子水洗脫2BV — 2% NaOH溶液洗脫2BV —水洗至中性 —下次使用。醇洗脫液一減壓濃縮(70°C)回收乙醇一殘液一棄去(附圖4)。步驟2中所述反相色譜的填料選自反相樹脂CG161、SBC_MCI_GEL或 MCI-GEL-CHP-20P，優(yōu)選CG161，丹酚酸A與反相色譜填料的重量比為1 (30 50)。步驟2所述的反相色譜操作為經(jīng)步驟(1)初步純化的I級純丹酚酸A濃縮液一減壓濃縮(50°C )回收乙醇一無醇丹A濃縮液一調(diào)pH至3. 0 —上樣CG161M相樹脂柱至黃色前沿為0. 5柱床高度一水洗25個柱體積一20%酸性乙醇(lmoL/LH3P04調(diào)pH至3. 0)洗脫(按柱體積收集洗脫液，TLC定性檢測，分雜質(zhì)和前雜丹A兩段合并)一40%醇溶液洗脫至丹A微量(按柱體積收集洗脫液，TLC定性檢測，合并)一60%醇溶液洗脫至無丹A(按柱體積收集洗脫液，TLC定性檢測，分為后雜丹A和雜質(zhì)二段合并)。分別合并純丹A、雜質(zhì)丹A和雜質(zhì)三段一專用納濾機過濾濃縮一II級純丹A濃縮液、雜質(zhì)丹A濃縮液和雜質(zhì)濃縮液(濾過液可重復(fù)使用)。>80%乙醇洗脫液經(jīng)減壓濃縮回收乙醇。雜質(zhì)丹A濃縮液一減壓濃縮(50°C)回收乙醇一無醇雜質(zhì)丹A濃縮液一再次分離。雜質(zhì)濃縮液一減壓濃縮(70°C )回收乙醇一無醇雜質(zhì)濃縮液一棄去(附圖5)。步驟3正相色譜填料為色譜硅膠，粒度100 300目，100目巳滿足分離要求。步驟3所述的正相色譜操作為乙酸乙酯萃取經(jīng)步驟( 純化的II級純丹酚酸A 濃縮液一減壓濃縮(50°C)回收乙醇一無醇丹A濃縮液一乙酸乙酯萃取3次(乙酸乙酯與無醇丹A濃縮液的體積比為1 4)—乙酸乙酯萃取液一減壓濃縮(50°C)回收乙酸乙酯至小體積一丹A乙酸乙酯濃縮液(固含量約25 30%)—加入硅膠O 2. 5倍)拌勻一旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥(50°C)—流動性固體樣品一硅膠濕柱(正己烷預(yù)裝)一7/3正己烷/ 叔丁基甲基醚(7/3的正己烷/乙酸乙酯、7/3正己烷/丙酮、98/2氯仿/甲醇或98/2 二氯甲烷/甲醇)洗脫至丹A檢出(按柱體積收集洗脫液，TLC定性檢測，分雜質(zhì)和丹A兩段合并)一6/4正己烷/叔丁基甲基醚(6/4的正己烷/乙酸乙酯、6/4正己烷/丙酮、9/1氯仿 /甲醇或9/1 二氯甲烷/甲醇)洗脫至丹A微量(按柱體積收集洗脫液一TLC定性檢測一合并)。丹A段一減壓濃縮(50°C)回收溶劑至干一丹A產(chǎn)品。雜質(zhì)段一減壓濃縮(50°C) 回收溶劑至干一殘渣一棄去(附圖6)。下面，參照附圖3，結(jié)合具體實施方式
再進一步給出本發(fā)明完整的工藝過程。其中附圖3中已經(jīng)明確示出的內(nèi)容不再重復(fù)描述。需要說明的是，下面只是將其中涉及的重點內(nèi)容進一步加以描述，但以下所有的過程及其工藝條件并不是作為必要條件加以描述的。步驟1 樹脂處理將本工藝所用的ADS-5、HPD100、ADS-8大孔吸附樹脂和CG-161反相樹脂分別裝入各自的色譜柱內(nèi)一加入丙酮淹沒樹脂一真空脫氣一丙酮洗脫至流出丙酮清澈一95%乙醇洗脫至流出乙醇加水不顯渾濁為標準一去離子水洗脫至流出液無醇味(一般為洗脫5個柱體積)一4% NaOH浸泡過夜一4% NaOH洗脫2個柱體積(BV)—去離子水洗脫至中性 —4% HCl浸泡過夜一4% HCl洗脫2BV —去離子水洗脫至中性(流速均為2cm/min)。樹脂再生使用后的大孔吸附樹脂仍保留有一定量的強吸附物質(zhì)，使樹脂吸附分離能力大幅度下降，需將其去除，以再生樹脂的吸附分離能力。再生方法視強吸附物質(zhì)的種類和量而異。對污染嚴重的前沿色譜柱樹脂ADS-5的再生方法為乙醇進行洗脫至近無色一去離子水洗脫3BV — 2% NaOH洗脫至近無色一去離子水洗脫至中性。對污染較輕的置換色譜樹脂HPD100和CG161的再生方法為乙醇進行洗脫至近無色一去離子水洗脫至中性(流速均為2cm/min)即可。使用3 5次后，若樹脂吸附能力明顯下降后，按ADS-5的再生方法處理1次。步驟2:丹酚酸B的提取丹參藥材(含丹酚酸B 6.1%)—干燥、粉碎過篩GO目，40公斤)一水提取 (100°C，480LX3)—水提取液(丹酚酸B 2318克、含量11. 36%，固體總重20. 4公斤，溶液濃 1. 61mg/ml)。步驟3:丹酚酸B的純化丹參水提液(1.6mg SB/ml, pH 3. 0，1440L)—串連色譜柱(Φ 100X 1000ADS-5 與 Φ200Χ1500ΗΡ -100串連)一去離子水洗脫3BV —斷開兩柱一70%甲醇洗脫分別洗脫 3BV—濃縮至干(固體總重觀78克，含丹酚酸B 65. 3%、共1878克)步驟4 催化轉(zhuǎn)化丹酚酸B生成丹酚酸A丹酚酸B粗品Q878g，65. 3% SB) — 180L水溶解一加入尿素(79g，為0. 5丹酚酸 B摩爾數(shù))一溶解一110°C轉(zhuǎn)化4小時一降至室溫一調(diào)pH至3. 0 —丹酚酸B轉(zhuǎn)化液[固體總重3264克，含丹酚酸A 21%、共685. 4克，產(chǎn)率36. 5% (以丹酚酸B計)]。步驟5 丹酚酸A的初步純化丹酚酸B 轉(zhuǎn)化液(3.81mg SA/mL，pH 3· 0，180L)—串連色譜柱(Φ 100X 500ADS-5 與Φ200Χ1000ΗΡ0100串連)一20%酸性乙醇(pH 3.0)洗脫前雜至純SA出現(xiàn)(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC定性檢測和合并濃縮干燥一A段)一斷開兩柱。40%醇溶液洗脫置換色譜柱至SA微量(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC定性檢測和合并濃縮干燥一B段)一60%醇溶液洗脫殘留SA至無SA(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC定性檢測和合并濃縮干燥一C段)。B段總重502克，丹酚酸A 410. 2克，含量81. 7%，收率 61%。A+C段總重457克，丹酚酸A 137. 1克，含量30. 1 %，收率20%。步驟6 丹酚酸A的反相色譜純化丹酚酸A粗品(B段502克，含量81.7% )—溶于水中(IOmg SA/mL, pH3. 0, 41L) — CG161S反相樹脂柱(Φ 200 X 500，柱床高15cm) —20%酸性乙醇(pH 3.0)洗脫前雜至純SA出現(xiàn)(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC定性檢測和合并濃縮干燥一A 段)一40%醇溶液洗脫至SA微量(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC定性檢測和合并濃縮干燥一B段)一60%醇溶液洗脫殘留SA至無SA(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC定性檢測和合并濃縮干燥一C段)。B段總重346. 5克，丹酚酸A 328. 1克，含量 94. 7%，收率80%。A+C段總重145克，丹酚酸A 61. 5克，含量42. 4%，收率15%。步驟7 丹酚酸A的正相色譜精制丹酚酸A粗品(94. 7% SA, 346. 5g)—溶于少量乙酸乙酯(約800ml)—加入800g 硅膠拌勻一旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥成流動性粉未(50°C )—硅膠濕柱(Φ 100X 1000，正己烷預(yù)裝1500g硅膠)一正己烷/叔丁基甲基醚(7/ 洗脫至SA檢出(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC定性檢測和合并濃縮干燥一A段)一正己烷/叔丁基甲基醚(6/4)洗脫至SA微量(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC定性檢測和合并濃縮干燥一B段)一正己烷/叔丁基甲基醚(5/ 洗脫至洗脫液無色(按柱體積收集洗脫液一HPLC定量、TLC 定性檢測和合并濃縮干燥一C段)。B段總重209. 1克(金黃色粉未)，丹酚酸A 201. 2克， 含量96. 2%，收率61. 3 %。A+C段總重98克，丹酚酸A 49. 2克，含量50. 2 %，收率14. 7 %。步驟8 丹酚酸A的結(jié)構(gòu)確認對步驟7所得產(chǎn)品進行了相關(guān)的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)檢測，結(jié)果如下。下述數(shù)據(jù)與文獻(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，中草藥現(xiàn)代研究，第二卷.1996，P 496 ；Li LNet al.Planta Medica 50,227 228 ；Lin, Yun-Lian. Journal of the Chinese ChemicalSociety (Taipei,Taiwan)2003, 50(5) :1079-1083 ；Chunbo Ai et al. Journal of NaturalProducts,1988,51(1) 145 ；Yinshi Sun et al. Journal of Chromatography B 2009,877 :733-737)報道的 salvianolic acid A 的數(shù)據(jù)一致。1、產(chǎn)品樣品的TLC檢測(圖7)2、產(chǎn)品樣品的HPLC檢測(圖8)3、產(chǎn)品樣品的旋光性表1丹酚酸A的旋光性
序號溶劑濃度C (g/100mL)測定管長度/ (dm)旋光度a旋光度平均值α比旋光度[α]1 3甲醇 (19.9 0C) 無水乙醇 (16°C)0.2284g/100mL 0.1032g/100mL1.0 1.0-0.082 -0.087 -0.086 0.043 0.043 0.044-0.085 0.043-37.22 +41.67
4、產(chǎn)品樣品的紫外吸收光譜(圖9)表2產(chǎn)品樣品的摩爾消光系數(shù)
權(quán)利要求
1.一種高純度丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于包含下列步驟(1)采用聯(lián)合色譜法初步純化丹參酚酸A，所述的聯(lián)合色譜法為大孔樹脂前沿色譜與大孔樹脂置換色譜聯(lián)用；(2)反相色譜進一步純化丹參酚酸A；(3)正相色譜精制丹參酚酸A。
2.按照權(quán)利要求1所述丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于步驟(1)所述前沿色譜中的填料選自大孔吸附樹脂ADS-5、D101或DM130，所述置換色譜的填料選自大孔吸附樹脂ADS-8或HPD100，前沿色譜的填料與置換色譜的填料重量比為(0.5 1) 4。
3.按照權(quán)利要求1所述丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于步驟(1)所述的聯(lián)合色譜法是前沿色譜柱與置換色譜柱串聯(lián)，丹參酚酸B轉(zhuǎn)化液按先前沿色譜柱后置換色譜柱的順序上樣后，用20% 25%的醇溶液洗脫至洗脫液中檢出丹參酚酸A，斷開兩柱，置換色譜柱用30-50%的醇溶液洗脫收集丹參酚酸A至丹參酚酸A微量，再用50-70%的醇洗脫收集含雜質(zhì)的丹參酚酸A，前沿色譜柱直接再生使用。
4.按照權(quán)利要求1所述丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于丹參酚酸A與置換色譜填料的重量比為1 (30 50)。
5.按照權(quán)利要求1所述丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于步驟(2)所述的反相色譜填料為反相樹脂CG161、SBC-MCI-GEL或MCI-GEL-CHP-20P，丹參酚酸A與反相色譜填料的重量比為1 (30 50)。
6.按照權(quán)利要求1所述丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于步驟(2)所述的反相色譜操作為上樣后，用20% 25%醇溶液洗脫至洗脫液中檢出丹參酚酸A，再用35% 40 %醇溶液洗脫收集丹參酚酸A至丹參酚酸A微量，最后用50 70 %醇溶液洗脫收集含雜質(zhì)的丹參酚酸A。
7.按照權(quán)利要求3或6所述丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于所述醇溶液為甲醇、乙醇或丙醇水溶液。
8.按照權(quán)利要求1所述丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于步驟(3)所述的正相色譜填料為色譜硅膠，粒度100 200目。
9.按照權(quán)利要求1所述丹參酚酸A的批量制備方法，其特征在于步驟(3)所述的正相色譜操作為乙酸乙酯萃取經(jīng)步驟( 純化的丹參酚酸A水溶液，濃縮乙酸乙酯萃取液至固含量約20% 30%，加入丹參酚酸A含量2 2. 5倍的色譜硅膠旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中減壓干燥制成流動性固體樣品，將固體樣品置于硅膠濕柱頂端洗脫。
10.按照權(quán)利要求9所述丹參酚酸A的批量制備方法，硅膠濕柱依次用8/2或7/3的正己烷/乙酸乙酯、或者8/2或7/3的正己烷/丙酮、或者95/5或98/2的氯仿/甲醇、或者 95/5或98/2的二氯甲烷/甲醇洗脫完雜質(zhì)，用7/3或6/4的正己烷/乙酸乙酯、或者7/3 或6/4的正己烷/丙酮、或9/1的氯仿/甲醇、或9/1的二氯甲烷/甲醇洗脫收集丹參酚酸 A，最后用6/4或5/5的正己烷/乙酸乙酯、或者6/4或5/5正己烷/丙酮、或85/15氯仿/ 甲醇、或85/15 二氯甲烷/甲醇洗脫合并的含雜質(zhì)的丹參酚酸A。
全文摘要
本發(fā)明基于丹參化學(xué)成分的理化性質(zhì)、色譜行為及其與單元分離技術(shù)適應(yīng)性，提供了一種高純度丹酚酸A的批量制備方法，其中含丹酚酸A的丹酚酸B轉(zhuǎn)化液經(jīng)聯(lián)合色譜、反相色譜和正相硅膠色譜三次色譜純化，聯(lián)合色譜法為大孔樹脂前沿色譜與大孔樹脂置換色譜聯(lián)用。該方法制備的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可控、成本可接受、可供注射藥用。使用本方法制備的丹參酚酸A含量≥98％，丹參酚酸A總收率≥10％(以丹參酚酸B計)，總產(chǎn)率≥0.5％(以丹參藥材計)。
文檔編號C07C67/56GK102212002SQ20101014365
公開日2011年10月12日 申請日期2010年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月6日
發(fā)明者何克江, 劉軍鋒, 劉珂, 張祁, 陳棟, 韓飛 申請人:山東靶點藥物研究有限公司, 海南鑫鴻凱實業(yè)有限公司