專利名稱：一種花生種子中凝集素的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及營養(yǎng)與食品加工領(lǐng)域，尤其是一種花生種子中凝集素的純化方法。
背景技術(shù)：
植物凝集素是一種含有非催化結(jié)構(gòu)域并能可逆結(jié)合到特異單糖或寡糖上的植物 (糖)蛋白。凝集素最早于1888年由俄國Porpat大學(xué)的Stillmark最先在植物種子蓖麻 籽中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時取名為蓖麻素(ricin)。后來經(jīng)對凝集素的深入研究了解而幾經(jīng)改名，目前 仍沿用的名稱有l(wèi)ectin和agglutinin。植物的種子含有最大量的凝集素，但在根、葉、皮、 花、鱗莖、根莖等部位也都發(fā)現(xiàn)有凝集素。凝集素廣泛存在于各種植物當(dāng)中，除了豆科植物， 其它植物如禾本科的稻、麥的種胚，延命菊的葉，黃瓜、南瓜、甜瓜等的韌皮部，馬鈴薯的塊 根，蕃茄果實(shí)的汁，萌發(fā)期稻的胚芽、胚根等都能檢測到凝集素的存在。一種植物并不是只 含有一種凝集素，有些植物體內(nèi)存在多種凝集素。凝集素最大的特點(diǎn)是能促使細(xì)胞凝集。比較直觀的表現(xiàn)是使紅血球凝集，但來源 不同的凝集素能凝集的紅血球也不一樣。此外，凝集素的其它作用還有促使細(xì)胞有絲分 裂，在其所在的機(jī)體內(nèi)還有許多生理功能，如細(xì)胞與細(xì)胞間粘著，變體介導(dǎo)的胞飲，細(xì)菌感 染宿主，巨噬細(xì)胞清除入侵的細(xì)菌，胚胎發(fā)育和機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)控制，精子與卵細(xì)胞間的識 別與結(jié)合，分子或離子的傳遞，雌蕊受粉，共生固氮，植物防御病原體侵入等，都可能包含了 凝集素的作用。凝集素是廣泛存在于生物體內(nèi)的蛋白或糖蛋白(sugar binding protein)，它們 能使細(xì)胞凝集和(或)沉淀糖蛋白。在植物界的各種組織和器官中含有多種形式的植物凝 集素，它們在進(jìn)化過程中高度保守，而且表現(xiàn)出嚴(yán)格的時間和空間專一性。雖然凝集素的 研究已逾百年，但直到本世紀(jì)60年代，人們認(rèn)識到凝集素在生物體內(nèi)具有多種重要生理功 能，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)上具有巨大應(yīng)用前景，凝集素的研究文獻(xiàn)才開始大量涌現(xiàn)。目前植物凝集 素已被廣泛的應(yīng)用于細(xì)胞分裂、白細(xì)胞的分離、血漿的制備、含糖基生物大分子的檢測和癌 化學(xué)的研究領(lǐng)域。純化和研究花生中凝集素的功能和應(yīng)用，對于了解花生的生理生長特性 非常重要，同時也會有巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開一種可以純化花生種子中凝集素的新方法，利用這種方法 對凝集素進(jìn)行純化，凝集素吸附量大、產(chǎn)品純度高、純化倍數(shù)高。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)—種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于包含以下步驟(1)花生粉的制備將原料花生清洗干凈，在鼓風(fēng)干燥箱中30°C干燥，干燥后的原 料花生去衣，用植物粉碎機(jī)粉碎，粉碎物過50目篩，收集篩下物作為純化花生種子中凝集 素的花生粉；(2)濾渣的制備將所得花生粉加入石油醚，恒溫水浴振蕩處理一定時間，抽濾，棄濾液，保留濾渣，并將濾渣通風(fēng)櫥中晾干；(3)初次沉淀物的制備在上述制得的濾渣中加入緩沖液溶解得到溶液，靜置12 小時以上；然后對溶液以10000轉(zhuǎn)超速離心20分鐘，棄上清液，保留初次沉淀物；(4)透析溶液的制備初次沉淀物中再次加入緩沖液溶解，得到混和溶液，混和溶 液再用緩沖液透析12小時以上，得到透析溶液；(5)洗脫液的制備將透析溶液以1-1. 5ml/min的流速通過半乳糖苷-瓊脂糖親 和填充柱；用緩沖液洗脫除去雜質(zhì)，再用含有乳糖的緩沖液洗脫得到洗脫液，洗脫流速為 1-1. 5ml/min ；(6)花生種子中凝集素純品的制備將洗脫液濃縮、冷凍干燥，得到花生種子中凝 集素純品。上述所述花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(2) 第一濾渣的制 備中所述的石油醚，其加入量為花生粉質(zhì)量的20-30倍，恒溫水浴處理花生粉的溫度為 30-50°C，處理時間為3-5h。上述所述花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(3)初次沉淀物 的制備中所述的緩沖液，其原料成份及重量比為=Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 8 1.81 0. 24 1000。上述所述花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(4)透析溶液的制備 中第一次加入的緩沖液，其原料成份及重量比為=Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O= (6 10) (1.6-2. 0) (0.15 0.25) 1000 ；第二次加入的緩沖液，其原料成份及重量比 % =Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O= (6 10) (1. 6 2. 0) (0. 15 0. 25) 1000。上述所述花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(5)洗脫液的制備中 第一次使用的緩沖液，其原料成份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O= (6 10) (1.6-2. 0) (0.15 0.25) 1000 ；第二次使用的緩沖液，其原料成份及重量比 為乳糖氯化鈉磷酸氫鈉磷酸二氫鉀純水=200 8 1. 81 0. 24 1000。本發(fā)明提供了利用半乳糖苷_瓊脂糖親和層析柱對花生種子中凝集素進(jìn)行特異 性吸附，再根據(jù)乳糖和半乳糖與凝集素結(jié)合的能力不同，利用乳糖進(jìn)行洗脫，從而達(dá)到凝集 素純化的目的。本方法的優(yōu)點(diǎn)是吸附快、解吸快、吸附容量大、所得產(chǎn)品純度高、花生種子中 凝集素的活性能夠得到有效抑制、適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。以本發(fā)明制得的凝集素能夠 顯著地凝集唾液酸酐酶處理后的人的A、B、0型血細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，以助于理解本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于包含以下步驟(1)花生粉的制備取無霉?fàn)€、無蟲蛀的花生種子用清水清洗干凈，在鼓風(fēng)干燥箱 中30°C干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎機(jī)粉碎，粉碎物過50目篩，收集篩下物作 為純化花生種子中凝集素的花生粉；(2)濾渣的制備將所得花生粉加入石油醚，其加入量為花生粉質(zhì)量的20倍，恒 溫水浴處理花生粉的溫度為30°C，處理時間為5h ；恒溫水浴振蕩處理一定時間，抽濾，棄濾液，保留濾渣，并將濾渣通風(fēng)櫥中晾干；(3)初次沉淀物的制備在上述制得的濾渣中加入緩沖液溶解得到溶液，其原料 成份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 8 1. 81 0. 24 1000，靜置 12 小 時以上；然后對溶液以10000轉(zhuǎn)超速離心20分鐘，棄上清液，保留初次沉淀物；(4)透析溶液的制備初次沉淀物中再次加入緩沖液溶解，緩沖液原料成份及 重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 8 1. 81 0. 24 1000 ；得到混和溶 液，混和溶液再用緩沖液透析12小時以上，該次加入的緩沖液原料成份及重量比為 Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 8 1. 81 0. 24 1000 ；得到透析溶液；(5)洗脫液的制備將透析溶液以lml/min的流速通過半乳糖苷-瓊脂糖親和填 充柱；用緩沖液洗脫除去雜質(zhì)，緩沖液原料成份及重量比為=Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O =8 1.81 0.24 1000;再用含有乳糖的緩沖液洗脫得到洗脫液，該次使用 的緩沖液原料成份及重量比為乳糖氯化鈉磷酸氫鈉磷酸二氫鉀純水= 200 8 1. 81 0. 24 1000，洗脫流速為 lml/min ；(6)花生種子中凝集素純品的制備將洗脫液濃縮、冷凍干燥，得到花生種子中凝 集素純品。實(shí)施例2一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于包含以下步驟(1)花生粉的制備取無霉?fàn)€、無蟲蛀的花生種子用清水清洗干凈，在鼓風(fēng)干燥箱 中30°C干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎機(jī)粉碎，粉碎物過50目篩，收集篩下物作 為純化花生種子中凝集素的花生粉；(2)濾渣的制備將所得花生粉加入石油醚，其加入量為花生粉質(zhì)量的25倍，恒 溫水浴處理花生粉的溫度為40°C，處理時間為4h ；恒溫水浴振蕩處理一定時間，抽濾，棄濾 液，保留濾渣，并將濾渣通風(fēng)櫥中晾干；(3)初次沉淀物的制備在上述制得的濾渣中加入緩沖液溶解得到溶液，其原料 成份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 8 1. 81 0. 24 1000，靜置 12 小 時以上；然后對溶液以10000轉(zhuǎn)超速離心20分鐘，棄上清液，保留初次沉淀物；(4)透析溶液的制備初次沉淀物中再次加入緩沖液溶解，緩沖液原料成份 及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 6 1. 6 0. 15 1000;得到混和溶 液，混和溶液再用緩沖液透析12小時以上，該次加入的緩沖液原料成份及重量比為 Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 6 1. 6 0. 15 1000 ；得到透析溶液；(5)洗脫液的制備將透析溶液以lml/min的流速通過半乳糖苷-瓊脂糖親和填 充柱；用緩沖液洗脫除去雜質(zhì)，緩沖液原料成份及重量比為=Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O =6 1.6 0.15 1000;再用含有乳糖的緩沖液洗脫得到洗脫液，該次使用 的緩沖液原料成份及重量比為乳糖氯化鈉磷酸氫鈉磷酸二氫鉀純水= 200 8 1.81 0. 24 1000，洗脫流速為 1. 5ml/min ；(6)花生種子中凝集素純品的制備將洗脫液濃縮、冷凍干燥，得到花生種子中凝 集素純品。實(shí)施例3—種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于包含以下步驟
(1)花生粉的制備取無霉?fàn)€、無蟲蛀的花生種子用清水清洗干凈，在鼓風(fēng)干燥箱 中30°C干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎機(jī)粉碎，粉碎物過50目篩，收集篩下物作 為純化花生種子中凝集素的花生粉；(2)濾渣的制備將所得花生粉加入石油醚，其加入量為花生粉質(zhì)量的30倍，恒 溫水浴處理花生粉的溫度為50°C，處理時間為3h ；恒溫水浴振蕩處理一定時間，抽濾，棄濾 液，保留濾渣，并將濾渣通風(fēng)櫥中晾干；(3)初次沉淀物的制備在上述制得的濾渣中加入緩沖液溶解得到溶液，其原料 成份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 8 1. 81 0. 24 1000，靜置 12 小 時以上；然后對溶液以10000轉(zhuǎn)超速離心20分鐘，棄上清液，保留初次沉淀物；(4)透析溶液的制備初次沉淀物中再次加入緩沖液溶解，緩沖液原料成份及 重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 10 2. 0 0. 25 1000 ；得到混和溶 液，混和溶液再用緩沖液透析12小時以上，該次加入的緩沖液原料成份及重量比為 Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 10 2. 0 0. 25 1000 ；得到透析溶液；(5)洗脫液的制備將透析溶液以1. 5ml/min的流速通過半乳糖苷_瓊脂糖親和填 充柱；用緩沖液洗脫除去雜質(zhì)，緩沖液原料成份及重量比為=Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O =10 2.0 0. 25 1000;再用含有乳糖的緩沖液洗脫得到洗脫液，該次使用 的緩沖液原料成份及重量比為乳糖氯化鈉磷酸氫鈉磷酸二氫鉀純水= 200 8 1.81 0. 24 1000，洗脫流速為 1. 5ml/min ；(6)花生種子中凝集素純品的制備將洗脫液濃縮、冷凍干燥，得到花生種子中凝 集素純品。上述所述任一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(2)濾渣的制 備中所述的石油醚，其加入量為花生粉質(zhì)量的20-30倍，恒溫水浴處理花生粉的溫度為 30-50°C，處理時間為3-5h。上述所述任一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(3)初次沉淀 物的制備中所述的緩沖液，其原料成份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 8 1.81 0. 24 1000。上述所述任一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(4)透析溶液 的制備中第一次加入的緩沖液，其原料成份及重量比為=Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O =(6 10) (1.6 2.0) (0.15 0.25) 1000 ；第二次加入的緩沖液，其原料成 份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O= (6 10) (1. 6 2. 0) (0. 15 0.25) 1000。上述所述任一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(5)洗脫液的制 備中第一次使用的緩沖液，其原料成份及重量比為=Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O= (6 10) (1.6-2. 0) (0.15 0.25) 1000 ；第二次使用的緩沖液，其原料成份及重量比 為乳糖氯化鈉磷酸氫鈉磷酸二氫鉀純水=200 8 1. 81 0. 24 1000。上述所述任一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(5)洗脫液的 制備中，透析溶液通過半乳糖苷-瓊脂糖親和填充柱的流速為1-1. 5ml/min ；洗脫流速為 1-1. 5ml/min。本發(fā)明提供了利用半乳糖苷_瓊脂糖親和層析柱對花生種子中凝集素進(jìn)行特異性吸附，再根據(jù)乳糖和半乳糖與凝集素結(jié)合的能力不同，利用乳糖進(jìn)行洗脫，從而達(dá)到凝集 素純化的目的。本方法的優(yōu)點(diǎn)是吸附快、解吸快、吸附容量大、所得產(chǎn)品純度高、花生種子中 凝集素的活性能夠得到有效抑制。以本發(fā)明制得的凝集素能夠顯著地凝集唾液酸酐酶處理 后的人的A、B、O型血細(xì)胞。當(dāng)然，本發(fā)明方法還適用于其它含脂量豐富的物質(zhì)的凝集素的純化提出，如大豆、黃豆等。本文具體說明了本發(fā)明示例性實(shí)施實(shí)例和目前的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā) 明的構(gòu)思可以按其他種種形式實(shí)施運(yùn)用，它們同樣落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于包含以下步驟(1)花生粉的制備將原料花生清洗干凈，在鼓風(fēng)干燥箱中30℃干燥，干燥后的原料花生去衣，用植物粉碎機(jī)粉碎，粉碎物過50目篩，收集篩下物作為純化花生種子中凝集素的花生粉；(2)濾渣的制備將所得花生粉加入石油醚，恒溫水浴振蕩處理一定時間，抽濾，棄濾液，保留濾渣，并將濾渣通風(fēng)櫥中晾干；(3)初次沉淀物的制備在上述制得的濾渣中加入緩沖液溶解得到溶液，靜置12小時以上；然后對溶液以10000轉(zhuǎn)超速離心20分鐘，棄上清液，保留初次沉淀物；(4)透析溶液的制備初次沉淀物中再次加入緩沖液溶解，得到混和溶液，混和溶液再用緩沖液透析12小時以上，得到透析溶液；(5)洗脫液的制備將透析溶液以1-1.5ml/min的流速通過半乳糖苷-瓊脂糖親和填充柱；用緩沖液洗脫除去雜質(zhì)，再用含有乳糖的緩沖液洗脫得到洗脫液，洗脫流速為1-1.5ml/min；(6)花生種子中凝集素純品的制備將洗脫液濃縮、冷凍干燥，得到花生種子中凝集素純品。
2.如權(quán)利要求1所述的花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(2)第一濾渣 的制備中所述的石油醚，其加入量為花生粉質(zhì)量的20-30倍，恒溫水浴處理花生粉的溫度 為30-50°C，處理時間為3-5h。
3.如權(quán)利要求1所述的花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(3)初次沉 淀物的制備中所述的緩沖液，其原料成份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = 8 1.81 0. 24 1000。
4.如權(quán)利要求1所述的花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(4)透析溶 液的制備中第一次加入的緩沖液，其原料成份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O =(6 10) (1.6 2.0) (0.15 0.25) 1000 ；第二次加入的緩沖液，其原料成 份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O= (6 10) (1. 6 2. 0) (0. 15 0.25) 1000。
5.如權(quán)利要求1所述的花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于步驟(5)洗脫液的 制備中第一次使用的緩沖液，其原料成份及重量比為Nacl Na2HPO4 KH2PO4 H2O = (6 10) (1.6 2.0) (0.15 0.25) 1000 ；第二次使用的緩沖液，其原料成份及重 量比為乳糖氯化鈉磷酸氫鈉磷酸二氫鉀純水=200 8 1. 81 0. 24 1000。
全文摘要
本發(fā)明涉及營養(yǎng)與食品加工領(lǐng)域，尤其是一種花生種子中凝集素的純化方法，其特征在于包含以下步驟(1)花生粉的制備；(2)濾渣的制備；(3)初次沉淀物的制備；(4)透析溶液的制備；(5)洗脫液的制備；(6)花生種子中凝集素純品的制備。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明方法提取的凝集素吸附快、解吸快、吸附容量大、所得產(chǎn)品純度高、花生種子中凝集素的活性能夠得到有效抑制、適用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。以本發(fā)明制得的凝集素能夠顯著地凝集唾液酸酐酶處理后的人的A、B、O型血細(xì)胞。
文檔編號C07K14/42GK101817876SQ20101013418
公開日2010年9月1日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月26日
發(fā)明者于麗娜, 孫杰, 張初署, 朱鳳, 楊慶利, 畢潔 申請人:山東省花生研究所