專利名稱：一種高純度乳酸鏈球菌素的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物產(chǎn)物的分離純化方法，特別是涉及乳酸鏈球菌素的分離純化方法，特別是一種用有機溶劑萃取的方法從乳酸鏈球菌素的發(fā)酵技術培養(yǎng)物以及乳酸鏈球菌素產(chǎn)品中分離純化乳酸鏈球菌素的方法。
背景技術：
乳酸鏈球菌素是由一些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)在代謝過程中合成和分泌的具有很強抑菌作用的多肽，分子量約為3510Da。由于它對許多革蘭氏陽性菌，尤其對引起食品腐敗的芽孢桿菌、梭菌、葡萄球菌、李斯特氏菌等有強烈抑制作用，加之其可被消化道中酶降解，是一種對人體無毒的天然食品防腐劑，已被廣泛應用于乳制品、罐裝食品、 肉制品和飲料的防腐保鮮劑。乳酸鏈球菌素的產(chǎn)品是由可生產(chǎn)乳酸鏈球菌素的乳酸乳球菌經(jīng)發(fā)酵生產(chǎn)所獲得的發(fā)酵液，再經(jīng)分離、提取、純化、干燥而得。在大規(guī)模生產(chǎn)過程中其分離、提取、純化制備一直是一個棘手的問題，乳酸鏈球菌素純品的效價為40000IU/mg，市場上的產(chǎn)品為乳酸鏈球菌素與氯化鈉的復配品，效價> 900IU/mg，純度為2. 5%左右。目前乳酸鏈球菌素制備工藝主要為吸附分離法和膜分離法。中國專利001299 . X公布了一種從乳酸乳球菌的發(fā)酵液中分離提取乳鏈菌肽 (即乳酸鏈球菌素)的方法，具體地公布了采用釋放乳鏈菌肽、吸附、解吸附及干燥的方法， 從乳酸乳球菌的發(fā)酵液中提取乳鏈菌肽。該方法生產(chǎn)工藝復雜，耗時長，成本較高，得到的乳酸鏈球菌素純度較低。中國專利200510066481公布了一種從乳酸乳球菌的發(fā)酵液中分離乳酸鏈球菌素的方法。該方法包括釋放乳酸鏈球菌素，分離和噴霧干燥，在溫度10 55°C和壓力0. 5 2. 5MPa條件下，采用孔徑10-60萬的管式膜過濾從發(fā)酵液中去除菌體和分子量比乳酸鏈球菌素分子量大的物質(zhì)；用孔徑為0. 2-4萬的卷式膜超濾從發(fā)酵液中去除分子量比乳酸鏈球菌素分子量小的物質(zhì)，得到發(fā)酵液濃縮物。由于發(fā)酵技術培養(yǎng)物成分復雜，采用膜分離的方法，在操作過程中膜面易發(fā)生污染，使膜性能降低，還要配以工藝相應的膜面清洗方法，而且單采用膜分離技術效果有限，得到的產(chǎn)品純度較低。文獻((Development of Purification Method Identification of a PeptideAntibiotic Produced by Lactococcus lactis 10—1》 艮道了 Hiromi Matsusaki 等人經(jīng)預處理、固液分離、硫酸銨鹽析、透析、離子交換層析和制備色譜純化得到乳酸鏈球菌素產(chǎn)品。此方法步驟復雜，成本過高，不適合工業(yè)化生產(chǎn)放大。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用有機溶劑從乳酸鏈球菌素發(fā)酵技術培養(yǎng)物以及乳酸鏈球菌素產(chǎn)品中分離純化乳酸鏈球菌素的方法。該方法操作簡便、耗時短、制備的乳酸鏈球菌素純度較高，克服了現(xiàn)有技術的缺點。
本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的一種從乳酸鏈球菌素發(fā)酵技術培養(yǎng)物以及市售乳酸鏈球菌素產(chǎn)品中分離純化乳酸鏈球菌素的方法，包括發(fā)酵技術培養(yǎng)物的預處理與固液分離或乳酸鏈球菌素產(chǎn)品的預處理、萃取和干燥過程，其中，采用有機溶劑作為萃取劑進行萃取，所用的有機溶劑為C4 C8的烷基醇，或者是烷基醇與烷基酸所形成的C4 C8的酯。優(yōu)選地，所述有機溶劑選自正丁醇、異丁醇、正戊醇、乙酸乙酯或乙酸丁酯，其中， 更優(yōu)選正丁醇。優(yōu)選地，從乳酸鏈球菌素發(fā)酵技術培養(yǎng)物以及市售乳酸鏈球菌素產(chǎn)品中分離純化乳酸鏈球菌素，可以通過如下步驟進行a.預處理與固液分離發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵技術培養(yǎng)物的pH至2. 0 3. 0，優(yōu)選用鹽酸、硫酸或草酸，加熱發(fā)酵技術培養(yǎng)物至70 100°C，維持10 60分鐘，使乳酸鏈球菌素完全釋放于發(fā)酵技術培養(yǎng)物中并迅速鈍化蛋白酶，確保乳酸鏈球菌素的穩(wěn)定性，得到發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理液。發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理液的固液分離發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理液通過固液分離得到澄清的濾液。乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理用pH 2. 0 3. 0的鹽酸溶液將乳酸鏈球菌素產(chǎn)品溶解，得到乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理液。b.萃取向濾液(或產(chǎn)品預處理液)中加入濾液(或產(chǎn)品預處理液)體積的40 80% (體積百分數(shù))的萃取劑，萃取劑可以為C4 C8的烷基醇或烷基醇與烷基酸形成的C4 C8 的酯，優(yōu)選正丁醇，異丁醇，正戊醇，乙酸乙酯或乙酸丁酯，特別優(yōu)選正丁醇；充分混勻后，用堿調(diào)節(jié)pH至6. 0 8. 0，優(yōu)選用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，優(yōu)選調(diào)節(jié)pH至7，靜置分層，乳酸鏈球菌素從濾液(或產(chǎn)品預處理液)轉移到萃取相中。取萃取相，用與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液洗滌至少三次，將萃取相中的部分雜質(zhì)反萃取至萃取劑飽和水溶液中，隨后加入與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液，充分混勻后，用酸調(diào)節(jié)PH至2. 0 3. 0，優(yōu)選用鹽酸、 硫酸或磷酸，然后靜置分層，乳酸鏈球菌素從萃取劑中轉移至水相中。取水相作為料液，重復以上萃取循環(huán)至少一次即可得到較純的乳酸鏈球菌素水溶液。C.干燥將萃取后的乳酸鏈球菌素水溶液在溫度為40 70°C，-0. 08至_0. IMPa的真空度下濃縮，濃縮至原體積的10 30%。濃縮液進行噴霧干燥，獲得純度70%以上粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法(參考QB2394-2007中的瓊脂擴散法)測定的效價為 28000IU/mg 以上。本發(fā)明的效果及優(yōu)點通過此方法制備的乳酸鏈球菌素純度在70%以上，以及經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為28000IU/mg以上。萃取后的有機溶劑可以回收重復利用。本發(fā)明工藝方法安全、簡便、實用，可用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)過程中。
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明的方法和效果進行較為詳細的說明。
實施例1a.預處理與固液分離發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理取乳酸乳球菌乳酸亞種CGMCC1. 1936 (中國普通微生物菌種保藏管理中心購買，經(jīng)常規(guī)物理化學誘變手段和培養(yǎng)基優(yōu)化使效價提高至6000IU/mL 左右)發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液，效價為6380IU/mL，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 0， 加熱發(fā)酵技術培養(yǎng)物至80°C，維持30分鐘，得到乳酸鏈球菌素預處理液。發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理液的固液分離預處理液通過離心去除發(fā)酵技術培養(yǎng)物中的菌體碎片等固型物，得到澄清的濾液，取IL濾液用于萃取。b.萃取向濾液中加入460mL的正丁醇，充分混勻后，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0，靜置分層，乳酸鏈球菌素從濾液轉移到萃取相中。取萃取相，用460mL正丁醇飽和的水溶液洗滌三次，將萃取相中的部分雜質(zhì)反萃取至萃取劑飽和的水溶液中，隨后加入460mL正丁醇飽和的水溶液，充分混勻后，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至2. 0，靜置分層，乳酸鏈球菌素從正丁醇相轉移至水相中。取水相作為料液，重復以上萃取循環(huán)一次即可得到較純的乳酸鏈球菌素水溶液。c.干燥將萃取后的乳酸鏈球菌素水溶液在溫度為50°C，-0. IMPa的真空度下濃縮，濃縮至50mL。濃縮液進行噴霧干燥，獲得純度78. 6%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為31443IU/mg。實施例2a.乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理乳酸鏈球菌素產(chǎn)品為市售的含乳酸鏈球菌2. 5%左右的乳酸鏈球菌素產(chǎn)品，其來源鄭州奇泓生物科技有限公司生產(chǎn)，品名為乳酸鏈球菌素，效價為1094IU/mg。稱取5. Og乳酸鏈球菌素產(chǎn)品用IL pH 2. 0的鹽酸水溶液溶解，得到乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理液，效價為M70IU/mL。b.萃取向產(chǎn)品預處理液中加入產(chǎn)品預處理液體積的460mL的正丁醇，充分混勻后，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至7. 0，靜置分層，乳酸鏈球菌素從產(chǎn)品預處理液轉移到萃取相中。取萃取相，用460mL正丁醇飽和的水溶液洗滌三次，將萃取相中的部分雜質(zhì)反萃取至正丁醇飽和的水溶液中，隨后加入460mL正丁醇飽和的水溶液，充分混勻后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至2. 0，靜置分層，乳酸鏈球菌素從正丁醇相轉移至水相中。取水相作為料液，重復以上萃取循環(huán)步驟一次即可得到較純的乳酸鏈球菌素水溶液。c.干燥將萃取后的乳酸鏈球菌素水溶液在溫度為50°C，-0. IMPa的真空度下濃縮，濃縮至50mL。濃縮液進行噴霧干燥，獲得純度83. 9%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為33561IU/mg。實施例3所用方法同實施例1，不同之處在于發(fā)酵技術培養(yǎng)物為乳酸鏈球菌素發(fā)酵濃縮液， 濃縮液效價為5160IU/mL，獲得純度74. 8%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為29923IU/mg。
a.預處理與固液分離發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理取乳酸乳球菌CGMCC1. 2030(從中國普通微生物菌種保藏管理中心購買，并經(jīng)常規(guī)物理化學誘變手段使效價提高至1000IU/mL左右)發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液，效價為1030IU/mL，將發(fā)酵液濃縮至效價為5160IU/mL，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至2. 0，加熱發(fā)酵技術培養(yǎng)物至80°C，維持30分鐘，得到乳酸鏈球菌素預處理液。發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理液的固液分離預處理液通過離心去除發(fā)酵技術培養(yǎng)物中的菌體碎片等固型物，得到澄清的濾液，取IL濾液用于萃取。b.萃取向濾液中加入460mL的正丁醇，充分混勻后，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7. 0，靜置分層，乳酸鏈球菌素從濾液轉移到萃取相中。取萃取相，用460mL正丁醇飽和的水溶液洗滌三次，將萃取相中的部分雜質(zhì)反萃取至正丁醇飽和的水溶液中，隨后加入460mL正丁醇飽和的水溶液，充分混勻后，用鹽酸調(diào)節(jié)PH至2. 0，靜置分層，乳酸鏈球菌素從正丁醇相轉移至水相中。取水相作為料液，重復以上萃取循環(huán)一次即可得到較純的乳酸鏈球菌素水溶液。c.干燥將萃取后的乳酸鏈球菌素水溶液在溫度為50°C，-0. IMPa的真空度下濃縮，濃縮至50mL。濃縮液進行噴霧干燥，獲得純度74. 8%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為29923IU/mg。實施例4所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵技術培養(yǎng)物的pH至2.0 3.0，所用酸為硫酸，向濾液中加入濾液體積40% (體積百分數(shù))的正丁醇， 獲得純度72. 6%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為29043IU/mg。實施例5所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵技術培養(yǎng)物的pH至2.0 3.0，所用酸為草酸，向濾液中加入濾液體積40% (體積百分數(shù))的正丁醇， 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH至8. 0，獲得純度70. 1 %粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為28040IU/mg。實施例6所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于向濾液中加入濾液體積 80% (體積百分數(shù))的正丁醇，在加入與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液，充分混勻后， 用酸調(diào)節(jié)pH至2. 0 3. 0，所用酸為硫酸，獲得純度70. 3%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為28120IU/mg。實施例7所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于向濾液中加入濾液體積 46% (體積百分數(shù))的乙酸乙酯，在加入與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液，充分混勻后，用酸調(diào)節(jié)pH至2. 0 3. 0，所用酸為磷酸，獲得純度71. 2%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為28483IU/mg。實施例8所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于向濾液中加入濾液體積 46% (體積百分數(shù))的正戊醇，獲得純度70. 5%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為28201IU/mg。實施例9所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于向濾液中加入濾液體積 46% (體積百分數(shù))的異丙醇，獲得純度71. 6%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為28640IU/mg。實施例10所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于向濾液中加入濾液體積 46% (體積百分數(shù))的乙酸丁酯，獲得純度71. 4%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為28562IU/mg。對比例1以乳酸乳球菌乳酸亞種CGMCC1. 1936發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液為原料，重復中國專利001299 . X的實施例1，獲得的乳酸鏈球菌素純度為15. 3%，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為6123IU/mg。對比例2以乳酸乳球菌乳酸亞種CGMCC1. 1936發(fā)酵產(chǎn)生的含有乳酸鏈球菌素的發(fā)酵液為原料，重復中國專利200510066481的實施例1，獲得的乳酸鏈球菌素純度為10. 1%，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為4031IU/mg。對比例3所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于向濾液中加入濾液體積 100% (體積百分數(shù))的正丁醇，獲得純度15. 2%粉末狀的乳酸鏈球菌素，乳酸鏈球菌素的效價為 6081IU/mg。對比例4所用方法和發(fā)酵技術培養(yǎng)物同實施例1，不同之處在于向濾液中加入濾液體積 15% (體積百分數(shù))的乙酸乙酯，獲得純度37. 5%粉末狀的乳酸鏈球菌素，即經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為15011IU/mg。通過以上實施例和對比例可以看出，通過本發(fā)明的方法制備的乳酸鏈球菌素純度在70%以上，經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為^OOOIU/mg以上。該方法中，萃取后的有機溶劑可以回收重復利用。本發(fā)明工藝方法安全、簡便和實用，可用于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)過程中。雖然以上通過具體實施例進行了說明，但不僅僅限于這些實施例，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以有更多變化或改進的其他實施例，而這些變化和改進都屬于權利要求所要求的范圍。
權利要求
1.一種高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，包括發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理及固液分離或乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理，萃取和干燥過程，其特征在于，采用有機溶劑作為萃取劑進行萃?。凰鲇袡C溶劑為C4 C8的烷基醇，或者是烷基醇與烷基酸所形成的C4 C8的酯。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述有機溶劑是正丁醇、異丁醇、正戊醇、乙酸乙酯或乙酸丁酯。
3.如權利要求1或2所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵技術培養(yǎng)物的預處理中，用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵技術培養(yǎng)物的pH至2. 0 3. 0，加熱至70 100°C，維持10 60分鐘，得到發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理液；發(fā)酵技術培養(yǎng)物預處理液通過固液分離得到澄清的濾液。
4.如權利要求1所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，所述乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理中，用PH 2. 0 3. 0的鹽酸溶液將乳酸鏈球菌素產(chǎn)品溶解，得到乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理液。
5.如權利要求1 4任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，在萃取過程中，向所述濾液或乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理液中加入濾液或產(chǎn)品預處理液體積的 40 80%體積的有機溶劑作為萃取劑，充分混勻后，用堿調(diào)節(jié)pH至6. 0 8. 0，靜置分層； 取萃取相，用與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液洗滌至少三次，隨后加入與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液，充分混勻后，用酸調(diào)節(jié)PH至2. 0 3. 0，靜置分層，取水相；取水相作為料液，重復以上萃取循環(huán)至少一次，得到乳酸鏈球菌素水溶液。
6.如權利要求1 5任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，在干燥過程中，將萃取后的乳酸鏈球菌素水溶液濃縮，濃縮液噴霧干燥后獲得純度70%以上粉末狀的乳酸鏈球菌素，其經(jīng)瓊脂擴散法測定的效價為28000IU/mg以上。
7.如權利要求書1 6任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，所述乳酸鏈球菌素發(fā)酵技術培養(yǎng)物為乳酸鏈球菌素發(fā)酵液，或乳酸鏈球菌素發(fā)酵液通過濃縮得到的乳酸鏈球菌素發(fā)酵濃縮液。
8.如權利要求書1 6任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，所述乳酸鏈球菌素產(chǎn)品為含乳酸鏈球菌素重量百分數(shù)2. 5%左右的產(chǎn)品。
9.如權利要求書1 8任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，所述萃取劑是正丁醇。
10.如權利要求1 9任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，所述萃取劑體積為濾液或產(chǎn)品預處理液體積的46%。
11.如權利要求5 10任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，所述堿為氫氧化鈉，調(diào)節(jié)PH為7。
12.如權利要求5 11任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，在加入與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液，充分混勻后，用酸調(diào)節(jié)PH至2. 0 3. 0中，所用酸為鹽酸、硫酸或磷酸。
13.如權利要求3 12任一所述的高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，其特征在于，用酸調(diào)節(jié)發(fā)酵技術培養(yǎng)物的pH至2. 0 3. 0中，所用酸為鹽酸、硫酸或草酸。
全文摘要
一種高純度乳酸鏈球菌素的制備方法，包括預處理發(fā)酵技術培養(yǎng)物及固液分離得到濾液或乳酸鏈球菌素產(chǎn)品預處理液；向濾液或產(chǎn)品預處理液中加入其體積的40～80％體積的萃取劑，充分混勻后，用堿調(diào)節(jié)pH至6.0～8.0，靜置分層取萃取相；用與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液洗滌萃取相三次，隨后加入與萃取相等體積的萃取劑飽和水溶液，充分混勻后，用酸調(diào)節(jié)pH至2.0～3.0，靜置分層，取水相；取水相作為料液，重復以上萃取循環(huán)至少一次；再將萃取后的乳酸鏈球菌素水溶液濃縮，濃縮液噴霧干燥得到乳酸鏈球菌素，其純度為70％以上。該方法簡便、耗時短，有機溶劑可重復利用，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)過程。
文檔編號C07K1/14GK102199200SQ20101013060
公開日2011年9月28日 申請日期2010年3月22日 優(yōu)先權日2010年3月22日
發(fā)明者嚴宇媛, 趙文杰, 趙波, 那可, 顧敏, 魏曉東 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院