喹唑啉酮類生物堿及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：喹唑啉酮類生物堿及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及喹唑啉酮類生物堿及其制備方法和用途。本發(fā)明用從海南儋州白馬井近海的海泥樣品中分離得到的蠟樣芽胞桿菌(Bacillus Cereus)041381生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)新穎的 上述類型化合物，并通過(guò)化學(xué)合成方法制備了此類化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類化合物具有抗 白色念珠菌的活性，其最小抑制濃度MIC為1. 3-10. 2 μ M，可作為白色念珠菌的抑制劑。
背景技術(shù)：
白色念珠菌隸屬酵母菌目、酵母菌科、假絲酵母屬，廣泛地存在于人體的皮膚表 面、小腸、空腔以及濕潤(rùn)部位。白色念珠菌是一種條件致病菌，當(dāng)人體的抵抗力降低時(shí)， 可以誘發(fā)多種感染疾病，如鵝口瘡等，危害著人類的生命安全，是真菌感染的首要病原 菌(Edwards JE Jr.Management of severe candidal infections !integration and review of current guidelines for treatment and prevention. Curr. Clin.Top. Infect.Dis. 2001，21 :135_147 ；Klepser ME，Lewis RE, Pfaller MA. Therapy of Candida infections :susceptibility testing， resistance， and therapeutic options.Ann. Pharmacother. 1998，32 :1353_1361 ；Reyes G.，Ghannoum MA. Antifungalsusceptibility testing of yeasts :uses and limitations. Drug Resist. Updates，2000，3 :14_19)。隨 著廣譜抗生素的普遍應(yīng)用，器官移植中免疫抑制治療的廣泛開展，以及艾滋病等免疫缺陷 患者的增多，白色念珠菌感染率在近幾年迅速增加，深部念珠菌感染已經(jīng)成為重癥患者死 亡的重要原因(White TC, Marr ΚΑ. Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance. Clin. Microbiol. Rev. 1998,11 382-402 ； Law D, Moore CB, Wardle HM, Ganguli LA, Keaney MG, Denning Dff. High prevalence of antifungalresistance in Candida spp. from patients with AIDS. J Antimicrob chemother, 1994, 34 (5) 659-668) 0目前針對(duì)白色念珠菌感染的藥物主要有酮康唑、克 霉唑或氟康唑等(Kowalsky SF, Dixon DM. Fluconazole -.a newantifungal agent. Clin Pharm. 1991,10:179-94 ；Palacin C,Tarrago C,Agut J,Guglietta,A. In vitro activity ofsertaconazole, fluconazole, ketoconazole, fenticonazole, clotrimazole and itraconazole against pathogenic vaginalyeast isolates. Methods Find Exp Clin Pharmacol, 2001, 23 61-64)。但是隨著藥物的濫用，白色念珠菌對(duì)這些藥物產(chǎn)生了抗藥性 和耐藥性，成為臨床治療的一大難題，急需尋找結(jié)構(gòu)新穎、作用高效的抗白色念珠菌感染藥 物。本發(fā)明人從廣西山口、防城、北海紅樹林樣品分離的498株海洋細(xì)菌中，發(fā)現(xiàn)了一株能 夠產(chǎn)生抗白色念珠菌活性物質(zhì)的蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)041381，且活性物質(zhì)為 生物堿類化合物。從其液體發(fā)酵物中，分離并鑒定了這類生物堿為結(jié)構(gòu)新穎的喹唑啉酮類 生物堿?；钚詼y(cè)試表明，此類喹唑啉酮類生物堿具有較強(qiáng)的白色念珠菌抑制活性，最小抑制 濃度MIC為1. 3-10. 2 μ Μ,可作為白色念珠菌抑制劑用于由白色念珠菌感染所導(dǎo)致的疾病 的治療，還可作為抑制白色念珠菌的低分子生物探針用于生命科學(xué)研究。目前尚未見對(duì)該 化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)及抗白色念珠菌活性的報(bào)道，因此市場(chǎng)上也尚未見有與此有關(guān)的藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一類結(jié)構(gòu)獨(dú)特的具有抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮類生物堿。本發(fā)明的目的還在于提供這類新化合物的制備方法及其在制備白色念珠菌抑制 劑中的用途。本發(fā)明首次從蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)041381發(fā)酵物中發(fā)現(xiàn)了一類抗白 色念珠菌活性的喹唑啉酮類生物堿，如式I、II所示 其結(jié)構(gòu)特征是化合物的基本骨架為在2-位上帶有3-庚基取代片段的喹唑啉酮 生物堿，其中禮、r2、R3、R4、R5、R6為氫、烴基、氨基、烷氧基、羥基、?；ⅤＱ趸?、酰氨基或芳 香基團(tuán)，1，2-位為單鍵或雙鍵。優(yōu)選的本發(fā)明化合物之一是所述的式I化合物(R2、R3、R4、R5和R6均為 氫):R-(+)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(1)> S-(-)-2-(heptan-3-yl) quinazolin-4(3H) -one (3)及其外消旋(士)_2_ (h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (5) 優(yōu)選的本發(fā)明化合物之二是所述的式II化合物(札、R2、R3、R4、R5和R6均為氫):(2R， 3 ‘ R) + (2S. 3 ‘ R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2), (2R, 3' S) + (2S，3' S) -2-(heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (4)及其消旋物 (+ )-2- (heptan-3-yl)~2, 3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(6)。上述發(fā)明中最優(yōu)選的化合物是由海南儋州白馬井的近海海泥來(lái)源的細(xì)菌-蠟樣 芽胞桿菌(Bacilluscereus)041381的液體發(fā)酵物經(jīng)大孔樹脂柱層析，以乙醇、水為溶劑梯 度洗脫，乙醇-水70 30洗脫物具有抗白色念珠菌的活性；此部分再經(jīng)反相硅膠柱層析， 甲醇、水為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，其中甲醇-水80 20洗脫物為活性組分，再經(jīng)S印hadex LH-20柱層析，所得氯仿-甲醇1 1洗脫產(chǎn)物，最后經(jīng)HPLC分離純化(甲醇-水75 25) 洗脫得式 I 化合物 R-(+)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (1)和式 II 的一對(duì)非對(duì) 映體混合物(2R，3' R) + (2S，3' R) -2- (heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -on e(2)。上述發(fā)明中最優(yōu)選的化合物還可以由合成方法獲得，由R-(-)-2-乙基己酸為原 料，經(jīng)草酰氯制為酰氯后，與鄰氨基苯甲酰胺反應(yīng)，所得到的反應(yīng)物在碳酸氫鈉飽和溶液中 回流或與六甲基二硅胺(HMDS)和I2反應(yīng)，所得產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離純化(甲醇-水75 25 洗脫)得式 I 化合物 R- (+) -2- (heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1)?；衔?1 經(jīng) NaBH4還原，所得產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離純化(甲醇-水70 30洗脫)得式II的一對(duì)非對(duì)映 體混合物(2R，3' R) + (2S，3' R)-2-(heptan-3-yl)-2, 3-dihydroquinazolin-4(IH)-on e(2)。同樣條件，由S-(+)-2-乙基己酸為原料，制得式I化合物3-(-)-2-0!印切11-311) quinazolin-4 (3H)-one (3)和式 II 的一對(duì)非對(duì)映體混合物(2R, 3 ‘ S) + (2S,3' S) -2-(heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (4)；由(士)-2-乙基己酸為 原料，可得式 I 化合物(士)-2_(h印tan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5)和式 II 化合物 (+ )-2- (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(6)。本發(fā)明采用紙片法測(cè)試了式I、II的化合物對(duì)白色念珠菌(Candida albicans)的抑菌活性。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，此類化合物對(duì)白色念珠菌有生長(zhǎng)抑制作用，R-(+)-2-(heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1)、非對(duì)映體混合物(2R，3R) + (2S, 3 ‘ R) -2- (heptan-3-yl) -2，3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)、 S-(-)~2~(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)、 混合物(2R，3 ‘ S)+(2S，3 ‘ S)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-on e(4)、 (士)一2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (5)禾口 (士)一2-(heptan-3-yl)-2， 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (6)對(duì)白色念球菌的最小抑制濃度為 1. 3-10. 2 μ M0因此本發(fā)明的式I、II化合物可用作白色念珠菌的抑制劑。式I、II化合物與各種藥物可接受的載體、賦形劑或輔料配伍，可制成抗白色念珠 菌藥物，用于白色念珠菌感染的治療。式I、II化合物還可作為抑制白色念珠菌的低分子生物探針用于生命科學(xué)研究， 作為探針應(yīng)用時(shí)，式I化合物可溶于氯仿、甲醇、或含水甲醇中，也可溶于二甲基亞砜的含 水溶液中加以應(yīng)用。本發(fā)明的式I、II化合物可通過(guò)微生物發(fā)酵培養(yǎng)，然后從發(fā)酵物中分離純化而得 到；也可以由簡(jiǎn)單原料通過(guò)化學(xué)合成而獲得。需要特別說(shuō)明的是，經(jīng)發(fā)酵微生物制取本發(fā)明式I、II化合物的方法可采用其它 任何能生產(chǎn)該類化合物的微生物，只要能生產(chǎn)該類化合物的微生物均可作為式I、II化合 物的生產(chǎn)菌。本發(fā)明的實(shí)施例中列舉了利用蠟樣芽胞桿菌041381株制備優(yōu)選的本發(fā)明式I、式 II化合物的實(shí)例。該細(xì)菌041381株從采自海南儋州白馬井的近海海泥中分離，并經(jīng)分類學(xué)研究和 分子生物學(xué)研究鑒定為蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)，并由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 保藏(編號(hào)CCTCC M 203030,日期2003年4月25日，地點(diǎn)中國(guó)武漢、武漢大學(xué))。該蠟樣芽胞桿菌041381 (Bacillus cereus 041381)株具有如下微生物菌學(xué)特 征菌落在培養(yǎng)基(酵母粉0.4%、麥芽膏1%、葡萄糖0.4%、陳海水75%、pH7. 4)、 28°C培養(yǎng)24小時(shí)的直徑2mm;菌落隆起，呈淡黃色，邊緣齊整，不透明，較濕，稍有光澤；個(gè)體 形態(tài)為桿狀，有芽孢，端部圓形。可在0-15%鹽度生長(zhǎng)，最佳生長(zhǎng)鹽度為6%。該蠟樣芽胞桿菌041381能利用糊精、糖原、吐溫40、吐溫80、N-乙酰-D-葡萄糖 胺、D-纖維二糖、D-果糖、α -D-葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、D-甘露糖、D-阿洛酮糖、D-核 糖、蔗糖、D-海藻糖、D-木糖、α-酮戊二酸、α-酮頡草酸、L-蘋果酸、丙酮酸甲酯、丙酮 酸、琥珀酸、L-丙氨酸、L-丙氨酰甘氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、谷氨酰-L-谷氨酸、 L-絲氨酸、2，3- 丁二醇、甘油、腺苷、2-脫氧-酰苷、肌苷、胸苷、尿苷、腺苷_5 ‘-磷酸、胸 苷-5'-磷酸、尿苷-5' _磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-L-α-甘油磷酸。該蠟樣芽胞桿菌041381不能利用α-環(huán)糊精、β _環(huán)糊精、菊粉、甘露聚糖、N-乙 酰-β -D-甘露糖胺、杏苷、阿拉伯糖、L-果糖、D-半乳糖、龍膽二糖、m-肌糖、α -D-乳糖、D-甘露醇、D-松三糖、α -甲基-D-半乳糖苷、β -甲基-D-半乳糖苷、α -甲基-D-葡萄糖 苷、α -甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖、L-鼠李糖、水楊苷、水蘇糖、D-山梨醇、D-塔格糖、 木糖醇、乙酸、α -羥基丁酸、ρ-羥基苯乙酸、D-乳酸甲酯、D-蘋果酸、丙酸、D-果糖-6-磷酸。
該賭樣芽胞桿菌(Bacillus cereus 041381,CCTCC M 203030)菌株具有如下分子 生物學(xué)特征16S rRNA 序列信息(GenBank 登陸號(hào)AY973027)GCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACA
具體實(shí)施例方式在如下的實(shí)施實(shí)例中所指的具有抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮生物堿的化學(xué)結(jié) 構(gòu)是(式中的阿拉伯?dāng)?shù)字是化學(xué)結(jié)構(gòu)中碳原子的標(biāo)位)式I、II化合物，其中Ri、R2、R3、R4、 R5、R6為氫、烴基、氨基、烷氧基、羥基、?；?、酰氧基、酰氨基或芳香基團(tuán)。實(shí)施例1化合物1、2的發(fā)酵生產(chǎn)及分離精制1發(fā)酵生產(chǎn)按培養(yǎng)微生物的常規(guī)方法，取蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)041381適量，接種到斜面培養(yǎng)基上，在28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。取斜面培養(yǎng)3天的B.cereus 041381適量，接種到裝有150mL培養(yǎng)液(培養(yǎng)基組成為可溶性淀粉4%、酵母粉0. 1%、海水素2. 5%、pH =7.0)的 500mL 錐型瓶中，在 28°C、120rps/min 搖床培養(yǎng) 18 小時(shí)，獲得 B. cereus 041381 的種子培養(yǎng)液。將該種子培養(yǎng)液按接種量分別接種于裝有300mL生產(chǎn)培養(yǎng)液(培養(yǎng)基 組成同上)的IOOOmL錐型瓶中，裝載于28°C環(huán)境下靜置發(fā)酵96小時(shí)，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液。2浸膏的獲得所取得的發(fā)酵培養(yǎng)液用等體積的正丁醇萃取3次，萃取液合并，減壓濃縮獲得正 丁醇提取浸膏共25. 5g。3化合物的分離精制浸膏(25. 5g)加水超聲懸浮后，用大孔樹脂柱層析，以乙醇、水為溶劑梯度洗脫， 乙醇-水70 30洗脫物Fr-2 (8. 6g)，再經(jīng)反相硅膠柱層析，甲醇、水為溶劑進(jìn)行梯度洗 脫，分為3個(gè)組分。Fr-2-l (153. 5mg,甲醇-水8 2洗脫物)經(jīng)S印hadex LH-20柱層析， 氯仿-甲醇1 1洗脫產(chǎn)物再經(jīng)HPLC分離純化，以甲醇-水75 25洗脫得式I化合物 R-(+) -2-(heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1) (8mg)和一對(duì)非對(duì)映體的混合物(2R， 3' R)+(2S,3' R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)(IOmg)。R- (+) -2- (Heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1)白色晶體，熔點(diǎn)為 123-125 "C,分子式為=C15H2tlN2O，[a ]D20+2. 1 (c 0. 1, acetone) ； UV λ maxMe0H (log C )202 (4. 17) ,224(4. 23) , 265 (3. 73) ,304(3. 44) ,316 (3. 35) nm ； lRvmaxKBr3177, 3034, 2959,2906,1674, 1609,1494,1465,1241,1196,890,768cm_1 ；Positive HRESIMS m/ z245. 1655 [M+H]+。其NMR數(shù)據(jù)如表1所示。(2R，3 ‘ R) + (2S，3 ‘ R) -2- (Heptan-3-yl) -2,3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one (2)白色晶體，熔點(diǎn)為 86_87°C，分子式為C15H22N20，[a]D20+3. 9(c 0· 1，acetone)； UVAmaxMe0H(log € ) :221(4. 17)，252(3. 42)，349(3. 18) nm ;IRvmaxKBr3290，3063，2955，2928， 2867, 1646, 1517, 1489,1460,1395,1312,1262,1151,750cm_1, Positive HRESIMSm/z 247. 1819 [M+H]+。其NMR數(shù)據(jù)如表1所示。表1.化合物 1 和 2 的 1H 和 13C NMR 數(shù)據(jù)(600and 125MHz, in CDCl3)a a本表信號(hào)歸屬基于DEPIVH-1HCOSY, HMQC及HMBC圖譜解析結(jié)果。碳信號(hào)的多重 性利用DEPT方法確定并分別用s (單重峰)、(！(二重峰)、t (三重峰)和q(四重峰)表示。
b此欄中的數(shù)字和代號(hào)別代表以合成方法所制備的化合物1的1H和13C譜信息。。分別為化合物2的一對(duì)非對(duì)映異構(gòu)體NMR數(shù)據(jù)。實(shí)施例2抗白色念珠菌活性的喹唑啉酮生物堿的化學(xué)制備上述發(fā)明中式I的化合物還可以由合成方法獲得，以最優(yōu)選的化合 *R-(+)-2-0u5ptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(l)、非對(duì)映體混合物(2R， 3 ‘ R)+(2S,3 ‘ R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2 )> S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3),非對(duì)映體混合物(2R， 3 ‘ S) + (2S,3 ‘ S) -2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one (4), (±)-2-(heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (5)、 ( ± )-2-(heptan-3-y 1) -2, 3-dihydroquinazol in-4 (IH) -one (6)為例，其化學(xué)制備路線見下圖 1 R-㈠-2-乙基己酸和S-(+)-2-乙基己酸的制備將4.8mL(0.03mol) (士)_2_乙基己酸置于三頸瓶中，在攪拌條件下緩慢滴加 4mL(0. 03mol) (R) - (+) - α -苯乙胺，白色銨鹽立即析出，約10分鐘后銨鹽完全析出。粗產(chǎn)物 加入30mL石油醚重結(jié)晶(反復(fù)重結(jié)晶)。所得晶體溶于IOmL水中，后用6mol/L鹽酸酸化 至弱酸性。酸化后的水溶液用乙酸乙酯萃取3次(每次20mL)，合并乙酸乙酯，無(wú)水硫酸鈉 干燥后真空蒸干，得到1.8g S-(+)_2-乙基己酸(收率38%)，[a]D2°+10.2(c 2, acetone), 91% ee。將結(jié)晶后的石油醚母液減壓蒸干，殘留物加IOmL水溶解，酸化后乙酸乙酯萃取 3次，合并有機(jī)層，無(wú)水硫酸鈉干燥，真空蒸干，得到500mg R-( —)-2_乙基己酸，[α] d20-4. 4(c 2, acetone) ,42% ee。2 R- (-) -2- (2-ethylhexanamido) benzamide (7)的制備將制得的R-(-)_2-乙基己酸 80mg(0. 56mmol)置于 25mL 兩口瓶中，用 IOmL CH2Cl2 溶解、N2保護(hù)下滴加草酰氯142mg(l. 12mmol)，室溫反應(yīng)5h，真空蒸去CH2Cl2和草酰氯，用 IOmL CH2Cl2重新溶解，滴加到5mL CH2Cl2溶解的鄰氨基苯甲酰胺76mg(0. 56mmol)和三乙 胺62mg(0.62mmol)中，室溫反應(yīng)1小時(shí)，反應(yīng)完全，真空蒸干溶劑，乙酸乙酯重新溶解，分 別用水、5% NaHCO3溶液洗，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥，蒸干。硅膠柱層析分離純化(乙酸 乙酯石油醚4 1)得125mg白色結(jié)晶粉末，產(chǎn)率85%。[a]D2°-1.3(c 1, acetone) ；mp 152-153°C, ESI-MS m/z 263. 2[M+H]+,285. 1[M+Na]+ ；1H NMR (500MHz, CDCl3) δ :11.2(lH，s， H-2)，8· 68 (1H, d, J = 8. 4Hz, H_7)，7. 54 (1H, d, J = 8. OHz, H_4)，7. 49 (1H, t, J = 8. OHz, H-5), 7. 06 (1H, t，J = 7. 7Hz，H_6)，6. 31 (1H，brs, -NH2B), 5. 75 (1H, brs, _NH2b)，2. 18 (1H,m, H-3' )，1. 71(2H，m，H-2' )，1. 55 1. 59 (4H，m，H_4' , H-5' ), 1. 32 (2H, m, H-6')， 0. 94 (3H, t, J = 7. 5Hz, H-I' ) ,0. 85 (3H, t, J = 6. 8Hz, H-7')。3 R- (+) -2- (heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (1)的制備法一取 R-(-)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 90mg (0. 34mmol)置于 25mL兩口瓶中用ImL甲醇溶解，加入15mL飽和的碳酸氫鈉水溶液，回流2小時(shí)，冷卻至室溫，加水 10mL。反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后減 壓除去乙酸乙酯。硅膠柱層析分離純化(乙酸乙酯石油醚6 1)得到SOmg白色結(jié)晶， 收率 96%。[a]D20+0. 4(c 1，acetone)。法 二 IX R- (-) -2- (2-ethylhexanamido) benzamide 60mg(0. 23mmol)禾口 I2 175mg(0. 69mmol)置于 25mL 兩口瓶中，用 IOmL CH2Cl2 溶解，N2 保護(hù)下滴加 HMDS 148mg(0. 92mmol)，室溫反應(yīng)12小時(shí)，用IOmL 二氯甲烷稀釋，分別用5% Na2S2O3溶液、鹽、水 洗后，有機(jī)層用無(wú)水硫酸鈉干燥、蒸干。硅膠柱層析分離純化(乙酸乙酯石油醚6 1) 得 R-(+)-2-(h 印 tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (l)48mg，產(chǎn)率 86%。[α ]D2CI+0. 4(c 1， acetone) ； ESI-MS m/z 245.2[M+H] +。4 ( 2 R , 3 ' R ) + ( 2 S , 3 ' R)-2-(heptan_3-yl)-2， 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (2)的制備取 R- (+) -2- (heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H )-one(l) 15mg(0. 06mmol)和 NaBH4 23mg(0. 60mmol)置于 25mL 單口瓶中，-10°C下攪拌加 入4mL乙酸，緩慢升溫至50°C，反應(yīng)48小時(shí)，飽和碳酸氫鈉溶液終止反應(yīng)，等體積乙酸乙 酯萃取，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后減壓除去乙酸乙酯，得到白色固體，經(jīng)HPLC分離純化(以甲 醇-水75 25洗脫)得到白色結(jié)晶粉末7. 4mg，收率50%。[a]D20+1.3(c 1,acetone) ,mp 86-87°C ；ESI-MS m/z247. 2 [M+H]+ ；1H NMR(600MHz, CDCl3) δ :7· 88 (2Η，d，J = 7· 7Hz，Η_5)， 7. 30 (2Η, t, J = 7. 3Ηζ, Η_7)，6· 84 (2Η, t, J = 7. 3Ηζ, Η_6)，6· 66 (2Η, d, J = 7. 7Ηζ, Η_8)， 5. 71 (2Η, brs, Η_3)，4. 96 (2Η，‘t，like, J = 3. 7Ηζ, Η_2)，4. 06 (2Η，brs, Η_1)，1· 58 (2Η， m, Η-2 ' a),l. 55 (2Η, m, Η-4 ' a), 1. 50 (2Η, m, Η-3 ' ), 1. 40 (2Η, m, Η-2 ' b), 1. 34 (6Η, m, Η-4 ' b/H-5 ' ), 1. 33 (4Η, m, Η-6 ' )，0· 98 (3Η，t，J = 7· 8Ηζ，Η_Γ )/0. 96 (3Η, t, J =7. 8Hz, H-I' )，0· 92(3Η，t，J = 6· 9Ηζ，Η-7' )/0. 90 (3Η, t, J = 6. 9Ηζ, Η-7 ' ) ； 13C 匪R(125MHz，CDCl3) δ :165· 70/165. 66 (C-4)，147. 9 (2C, C_8a)，133. 9 (2C, C_7)，128. 6 (2C, C-5), 119. 2 (2C, C-6), 115. 8 (2C, C_4a), 114. 7 (2C, C_8)，67. 4 (2C, C_2)，44. 2 (2C, C_3')， 29. 8/29. 7(C-5 ' )，28. 6 (2C，C_4 ' )，23. 1 (2C，C_6 ' )，22. 0 (2C，C_2 ' )，14. 1 (2C， C-T ), 12. 0/11. 9 (C-I')。5 S-(_)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (3)的制備制備方法同化合物1 以拆分得到的S-⑴-2-乙基己酸80mg (0. 56mmol)和 草酰氯 142mg(l. 12mmol)反應(yīng)得 S- (+) -2- (2-ethylhexanamido) benzamide 115mg,產(chǎn) 率 80%，[a]D2°+1.6(c 1，acetone)，mp 148-149 °C ；波譜數(shù)據(jù)同化合物 7。法一由 S-(+)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 90mg 與飽和 NaHCO3 可得白色結(jié)晶 381mg，收 97%。 [a]D20_0.9(c 1, acetone)S-(+)-2-(2-ethylhexanamido)benzamide 60mg (0. 23mmol)和 I2175mg(0. 69mmol)及 HMDS 148mg (0. 92mmol)反應(yīng)得化合物 347mg，產(chǎn) 率 84%。[α ] D20-L l(c 1, acetone)，mp 93-94 °C ；波譜數(shù)據(jù)同化合物 1。6 ( 2 R , 3 ‘ R ) + ( 2 S , 3 ‘ R)-2-(heptan_3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (4)的制備制備方法同化合物2 由 S-(-)-2-0u5ptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one 20mg(0. 082mmol)和 NaBH4 32mg (0. 82mmol)反應(yīng)，得化合物 2 10. 4mg，產(chǎn)率 52 %。[α] D20+l. 3(c 1，acetone)。mp 89-90 °C, ESI-MS m /z 247. 2[M+H]+ ；1H NMR (600MHz，CDCl3) δ 7. 87 (2H, d, J = 7. 7Hz, H_5)，7. 28 (2H, t, J = 7. 7Hz, H_7)，6. 82 (2H, t, J = 7. 7Hz, H_6)， 6. 67 (2H, d, J = 7. 7Hz, H_8)，6. 39 (2H, brs, H_3)，4. 94 (2H, dd, J = 3. 3，6. 6Hz，H_2)， 4. 19(2H，brs，H-l)，1. 62(2H，m，H-2 ' a), 1. 56 (2H, m, H-4 ' a), 1. 52 (2H, m, H-2 ' b)， 1. 45 (2H, m, H-3 ' ), 1. 39 (2H, m, H-4 ' b), 1. 32 (4H, m, H-5 ' ), 1. 30 (4H, m, H-6 ')， 0. 97 (3H, t, J = 6. 6Hz, H-I' )/0. 95 (3H, t, J = 6. 6Hz, H-I' ) ,0. 89 (3H, t, J = 6. 6Hz, H-7' )/0. 88(3H，t，J = 6. 6Hz，H-7' ) ；13C NMR(125MHz, CDCl3) δ : 165. 73/165. 70 (C_4)， 147. 9 (2C, C-8a)，133. 8 (2C, C_7)，128. 6 (2C, C_5) ,119. 1 (2C, C_6) ,115. 8 (2C, C_4a)， 114. 7 (2C, C-8), 67. 4 (2C, C~2), 44. 2 (2C, C-3' ), 29. 8/29. 7(C-5' ) ,28. 6(2C, C-4')， 23. 13/23. 09(C-6' ) ,22. 0(2C, C-2' )，14. 1 (2C，C_7' ), 12. 0/11. 9 (C-I')。7 (±) -2- (heptan-3-yl) quinazolin-4 (3H) -one (5)的制備制備方法同化合物1 以(士)-2-乙基己酸108mg(0. 75mmol)和草酰 氯 190mg(l. 5mmol)反應(yīng)得(士)_2_(2-ethylhexanamido)benzamide 169mg, 產(chǎn) 率 86 %。 由(士)一2-(2-ethylhexanamido) benzamide 120mg(0. 46mmol)禾口 I2 350mg(l. 38mmol)及 HMDS 296mg(l. 84mmol)反應(yīng)得化合物(士)_2_(h印tan-3-yl) quinazolin-4(3H)-one(5)95mg，產(chǎn)率 85%。[α ]D20(C 1，acetone)，mp 115_116°C。8 (±) -2- (heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (6)的帝[J備制備方法同化合物2 由(士)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (5) 20m g(0. 082mmol)和 NaBH432mg(0. 82mmol)反應(yīng)，得化合物 69. 6mg，產(chǎn)率 48 %。[α ]D20(C 1， acetone) ；mp 76-80 °C。實(shí)施例3抗白色念珠菌活性的測(cè)試1實(shí)驗(yàn)樣品及實(shí)驗(yàn)方法被測(cè)樣品及陽(yáng)性對(duì)照藥溶液的配制測(cè)試樣品為上述實(shí)施例1中分離 精制的純品化合物 R-(+)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (1)和(2R， 3 ‘ R)+(2S，3 ‘ R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)及其 化學(xué)合成的 S-(-)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4 (3H)-one (3)和(2R, 3 ‘ S) + (2S, 3 ‘ S)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(4)、(士)(heptan-3-yl) quinazolin-4(3H)-one(5)禾口(士)-2-(heptan-3-yl)_2，3-dihydroquinazolin-4(IH)-on e (6)，以及陽(yáng)性對(duì)照藥酮康唑純品(日本東京化成)。準(zhǔn)確稱取適量樣品，用甲醇按二倍稀 釋法配制成所需濃度的溶液，即 10 μ g/mL、5 μ g/mL、2. 5 μ g/mLU. 25 μ g/mL、0. 625 μ g/mL、 0. 3125 μ g/mL、0. 15625 μ g/mL、0. 078125 μ g/mL 供活性測(cè)試。致病菌白色念球菌培養(yǎng)活性測(cè)試采用致病菌白色念球菌。取凍存保藏的白色念 珠菌適量，接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基的斜面上活化(培養(yǎng)基組成為酵母膏1%、葡萄糖2%、蛋白 胨2%、瓊脂2%、pH = 7. 0)。取斜面培養(yǎng)3天的白色念球菌適量，接種到裝有150mL培養(yǎng) 液(培養(yǎng)基組成為酵母膏1 %、葡萄糖2 %、蛋白胨2 %、pH = 7. 0)的500mL錐型瓶中，在 28°CU20rps/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)24小時(shí)，獲得白色念球菌的種子培養(yǎng)液。用涂布棒將該種子培養(yǎng)液均勻的涂抹在YPD培養(yǎng)菌的平板上，供活性測(cè)試。紙片法測(cè)定實(shí)驗(yàn)樣品的抑菌活性實(shí)驗(yàn)將上述配制好的各個(gè)濃度的樣品，吸取 10 μ L滴加在直徑為6mm的滅菌濾紙片上。無(wú)菌操作將加有樣品的濾紙片貼在上述制備好 的帶有菌的平板上。28°C培養(yǎng)12小時(shí)，觀察抑菌圈直徑大小，以看不到抑菌圈的最大濃度 為該樣品的最小抑制濃度(MIC)。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果
it ^ ^ R-( + )-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(l) > (2R, 3 ‘ R) + (2S,3 ‘ R)-2- (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one ( 2)、S-(-)-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3)禾口 (2R，3 ' S) + (2S， 3 ‘ S)-2 - (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one (4) > (士)一2- (heptan-3-yl) quinazolin—4 (3H) -one (5)禾口 (士)一2-(heptan-3-y 1) -2， 3-dihydroquinazol in-4 (IH) -one (6)對(duì)白色念球菌具有強(qiáng)的抑制活性，其MIC分別為2. 5、 2. 5、1. 3、5. 0、10. 2、10. 1 μ M，陽(yáng)性對(duì)照藥酮康唑的MIC為0. 2 μ Μ。其中，S-構(gòu)型的喹唑啉 酮生物堿(3)的活性最強(qiáng)，表明S-構(gòu)型和2，3_雙鍵可能是活性基團(tuán)，而外消旋的產(chǎn)物則降 低其抑菌活性。3 結(jié)論it ^ ^ R-( + )-2-(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(l) > (2R, 3 ‘ R) + (2S,3 ‘ R)-2- (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one ( 2) , S-(-)-2-(heptan-3-yDquinazolin-4 (3H)-one (3)禾口 (2R，3 ' S) + (2S， 3 ‘ S)-2 - (heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH) - one(4) > (士)一2- (heptan-3-yl) quinazolin—4 (3H) -one (5)禾口 (士)_2_ (heptan-3-y 1) -2， 3-dihydroquinazol in-4 (IH) -one (6)對(duì)白色念珠菌的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)抑制作用。因此，本發(fā) 明的式I、II化合物、特別是具有S-構(gòu)型的喹唑啉酮生物堿可作為白色念珠菌抑制劑用于 治療白色念珠菌感染所導(dǎo)致的疾病，還可作為抑制白色念珠菌的低分子生物探針用于生命 科學(xué)研究。
權(quán)利要求
式I、或式II化合物其中R1、R2、R3、R4、R5、R6為氫、烴基、氨基、烷氧基、羥基、?；ⅤＱ趸?、酰氮基或芳香基團(tuán)。F2010100045625C00011.tif
2.權(quán)利要求1所述的式I的1個(gè)天然產(chǎn)物R-⑴-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4(3H)-one(l)，其中 R2、R3> R4> R5 和 R6 均為氫；式 II 的 1 個(gè)天然產(chǎn)物(2R， 3' R) + (2S，3' 10-2-01印{&11-311)-2，3-(1讓7(11~(^1^11&201士11-4(1!1)-0116(2)，其中 R”R2、 R3、R4、R5和R6均為氫。
3.權(quán)利要求1所述的式I的2個(gè)合成產(chǎn)物(式I，&、民、1 4、1 5和1 6均為氫) S-(-)-2"(heptan-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(3),外消旋體(士)-2-(h印tan-3-yl) quinazolin-4(3H) -one (5)及其 2 個(gè)還原產(chǎn)物(式 II，R1、R2、R3、R4、R5 和 R6 均為氫)非 對(duì)映體混合物(2R，3S) + (2S, 3 ‘ S) -2- (heptan-3-yl) -2，3-dihydroquinazolin-4 (IH) -on e (4)、(士)-2_ (heptan-3-yl) quinazol in-4 (3H) -one (6)。
4.權(quán)利要求2所述的式I、II化合物的制備方法，其特征是液體發(fā)酵培養(yǎng)蠟樣芽胞桿 菌(Bacillus cereus) 041381，獲取含有上述式I、II化合物的發(fā)酵物，然后從發(fā)酵物中分 離純化出式 I 化合物 R- (+) -2- (heptan-3-yl) quinazol in-4 (3H) -one (1)和式 II 的-對(duì)非 對(duì)映體混合物(2R，3' R) + (2S，3' R) -2- (heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH)-one (2) ο
5.權(quán)利要求4所述的制備方法，將所述發(fā)酵物經(jīng)火孔樹脂柱層析，以乙醇、水為溶劑梯 度洗脫，乙醇-水70 30洗脫物具有抗白色念珠菌的活性；此部分再經(jīng)反相硅膠柱層析， 甲醇、水為溶劑進(jìn)行梯度洗脫，其中甲醇-水80 20洗脫物，再經(jīng)S印hadex LH-20柱層 析，所得氯仿-甲醇1 1洗脫產(chǎn)物，最后經(jīng)HPLC分離純化(甲醇-水75 25)洗脫得式 I 化合物 R-(+)-2-(h 印 tan-3-yl) quinazol in-4 (3H)-one (1)和式 II 的一對(duì)非對(duì)映體混合 物(2R，3' R)+(2S，3' R)-2-(heptan-3-yl)-2,3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)
6.權(quán)利要求5所述的式I、II化合物的微生物制備方法，其生產(chǎn)菌是蠟樣芽胞桿菌 (Bacillus cereus)041381，保藏編號(hào)為=CCTCC M 203030。
7.權(quán)利要求2所述的式I化合物的化學(xué)制備方法，由R-(-)_2-乙基己酸為原料，經(jīng)草 酰氯制為酰氯后，與鄰氨基苯甲酰胺反應(yīng)，所得到的反應(yīng)物在碳酸氫鈉飽和溶液中回流或 與六甲基二硅胺(HMDS)和I2反應(yīng)，所得產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離純化(甲醇-水75 25洗脫) 得式 I 化合物 R-(+)-2-(h 印 tan-3-yl) quinazol in-4 (3H)-one (1)?；衔?1 經(jīng) NaBH4 還 原，所得產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離純化(甲醇-水70 30洗脫)得式II的一對(duì)非對(duì)映體混合物 (2R, 3' R) + (2S,3‘ R)-2-(heptan-3-yl)-2，3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(2)。
8.權(quán)利要求3所述的式I、II化合物的化學(xué)制備方法，由S-(+)-2-乙基己酸為原料， 以權(quán)力要求 7 所述的方法制得 S-(-)-2-(hi5ptan-3-yl)quinaZ0lin-4(3H)-0ne(3)和混合 物(2R，3' S) + (2S，3' S) -2- (heptan-3-yl) -2, 3-dihydroquinazolin-4 (IH) -one (4)；由(士)-2-乙基己酸為原料，同樣方法可得(士)-2-(h印ten-3-yl)quinazolin-4(3H)-one(5) 禾口(士)-2-(heptan-3-yl)_2，3-dihydroquinazolin-4(IH)-one(6)。
9.權(quán)利要求1所述的式I、II化合物在制備白色念珠菌抑制劑的用途。
10.權(quán)利要求1所述的式I、II化合物在制備抗白色念珠菌藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及喹唑啉酮類生物堿及其制備方法和用途。本發(fā)明用從海南儋州白馬井近海的海泥樣品中分離得到的細(xì)菌——蠟樣芽胞桿菌041381(Bacillus cereus 041381，菌種保藏編號(hào)CCTCC M 203030)生產(chǎn)出結(jié)構(gòu)新穎的上述類型的化合物，并通過(guò)化學(xué)合成方法制備了此類化合物。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該類化合物具有抗白色念珠菌的活性，其最小抑制濃度MIC為1.3-10.2μM，可作為白色念珠菌的抑制劑。
文檔編號(hào)C07D239/90GK101845021SQ20101000456
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2010年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月10日
發(fā)明者付海超, 劉培培, 張亞鵬, 徐志紅, 朱偉明, 林海鵬, 洪葵, 王又, 肖春 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué);中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所