人抗α突觸核蛋白自身抗體的制作方法

專利名稱：人抗α突觸核蛋白自身抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明總體上涉及新的突觸核蛋白特異性結(jié)合分子，特別是分別識別α突觸核蛋白和α突觸核蛋白聚集形式的人抗體及其片段、衍生物和變體。此外，本發(fā)明涉及包含此類結(jié)合分子、抗體及其模擬物的藥物組合物和診斷組合物，可用作鑒定血漿和CSF中α 突觸核蛋白毒性物類的診斷工具并且還可用于治療與α突觸核蛋白聚集物相關(guān)的病癥的被動免疫接種策略，所述病癥例如帕金森病(PD)、路易體癡呆(DLB)和阿爾茨海默病(AD) 路易體變異型及其他突觸核蛋白病。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)錯折疊和聚集是許多神經(jīng)變性疾病的病理方面。α突觸核蛋白的聚集物是路易體和與帕金森病(PD)相關(guān)的路易突起的主要組分。天然未折疊的蛋白α突觸核蛋白可采取不同的聚集形態(tài)，包括寡聚體、初原纖維和原纖維。已經(jīng)顯示小寡聚體聚合物是特別有毒的。針對α突觸核蛋白的天然存在的自身抗體已經(jīng)在健康人中被監(jiān)測，并且在患者中改變的水平與特定神經(jīng)退行性疾患相關(guān)；參見綜述Neff等，Autoimmun. Rev. 7 (2008)， 501-507。因此，罹患帕金森病的患者中天然存在的抗體，自發(fā)地或在接種后，特別是在健康患者中，可以對α突觸核蛋白聚集起防護(hù)作用；參見例如Woulfe等，Neurology 58(2002)， 14；35-1436 和 Papachroni 等，J. Neurochem. 101 Q007)，749-756。迄今，自身抗體的治療意義難以評估。這主要是由于缺乏它們分離和隨后體外鑒定的直接的實驗方法。最近，已經(jīng)在血漿和CSF中細(xì)胞外報道了 α突觸核蛋的寡聚體物類(El-Agnaf 等，F(xiàn)ASEB J.2(K2006)，419-425)，PD小鼠模型中免疫接種研究顯示，針對α突觸核蛋白的細(xì)胞外小鼠單克隆抗體可以減少細(xì)胞內(nèi)α突觸核蛋白聚集物的累積(Masliah等，Neuron， 46 000 ，857-868)，支持了如下想法中和神經(jīng)毒性聚集物而不干擾單聚合體α突觸核蛋白的有益功能的抗體可能是有用的治療劑。然而，考慮到其非人來源，基于鼠的抗體在人中的治療功用受到人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答的妨礙。Emadi 等 J. Mol. Biol. 368 (2007) ,1132-1144，描述了從基于針對 α 突觸核蛋白的人序列的噬菌體展示抗體文庫分離單鏈抗體片段(scFv)，其僅結(jié)合α突觸核蛋白的寡聚體形式并且在體外抑制α突觸核蛋白的聚集和毒性。然而，盡管通過噬菌體展示產(chǎn)生scFv 是非常簡單的，但是該技術(shù)具有嚴(yán)重的缺點，因為如此產(chǎn)生的抗體具有針對自身抗原不希望的交叉反應(yīng)性風(fēng)險，并且缺乏由人免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的進(jìn)化優(yōu)化的天然人抗體的特征。而且， 此類抗體可能不夠特異性，因為在正常生理環(huán)境和功能上下文中與其他蛋白和/或與靶蛋白的交叉反應(yīng)性。例如，在帕金森病的情況下，與α突觸核蛋白的生理衍生物也交叉反應(yīng)的抗體具有引起與生理靶結(jié)構(gòu)的正常功能相關(guān)的副作用。在該方面，不希望的自身免疫疾病將被徹底誘導(dǎo)-在采用還以變體形式生理出現(xiàn)的蛋白結(jié)構(gòu)的活性免疫接種實驗的概念設(shè)計中很難計算的風(fēng)險。最近，Seitz 等(81. Kongress der Deutschen Gesellschaft fiir Neurologie mitFortbildungsakademie Hamburg 10. -13. 09. 2008)報道了通過親和色譜從不同免疫球蛋白溶液和但血液供體樣品分離抗α突觸核蛋白多克隆自身抗體。然而，除了該方法提供僅有限量的所需抗體的事實以外，多克隆抗體具有僅有限的治療應(yīng)用用途，例如因為它們的異質(zhì)性和被具有不希望的副作用的其他α突觸核蛋白結(jié)合分子污染的風(fēng)險。同樣，多克隆抗體的診斷價值被減少，因為抗體組合物的變異性將影響總體特異性和反應(yīng)性。對于蛋白抗體而言，由于錯折疊而聚集和沉積的主題是更真實的。因此，需要克服上述限制并提供針對α突觸核蛋白的治療性和診斷性人抗體。發(fā)明概述本發(fā)明利用老年健康對照受試者和具有神經(jīng)疾病的患者的α突觸核蛋白特異性免疫應(yīng)答，用于分離天然α突觸核蛋白特異性人單克隆抗體。具體而言，根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行的實驗成功地從沒有帕金森病體征的老年受試者群分離對α突觸核蛋白特異性的單克隆抗體。因此，本發(fā)明涉及能夠特異性識別α突觸核蛋白的人抗體、抗原結(jié)合片段和類似的抗原結(jié)合分子。“特異性識別α突觸核蛋白”、“對α突觸核蛋白特異性的抗體"和" 抗α突觸核蛋白"特別地、一般地和總體上表示天然形式的α突觸核蛋白或錯折疊或寡聚體或聚集或翻譯后修飾的α突觸核蛋白的抗體。本文提供了對天然單體、全長、截斷和聚集形式具有選擇性的人抗體。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方案中，人抗體或其抗原結(jié)合片段說明由

圖1所列可變區(qū)VH和/或VL鑒定的抗體的免疫結(jié)合特征?？贵w的抗原結(jié)合片段可以是單鏈Fv片段、F(ab')片段、F(ab)片段和F(ab‘ )2 片段，或任何其他抗原結(jié)合片段。在以下具體實施方案中，抗體或其片段是人IgG同種型抗體?？蛇x地，抗體是嵌合的人-鼠或鼠源化抗體，后者特別用于診斷方法和動物研究。而且，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明抗體或其活性片段或其激動劑和同源分子或可選地拮抗劑的組合物，并且涉及使用此類組合物預(yù)防、診斷或治療突觸核蛋白病的免疫治療和免疫診斷方法，其中有效量的組合物被施用給有相應(yīng)需要的患者。天然地，本發(fā)明延伸至永生的人B記憶淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞，分別產(chǎn)生具有如下定義的獨特特征的抗體。本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明抗體的免疫球蛋白鏈的至少可變區(qū)的多核苷酸。優(yōu)選地，所述可變區(qū)包含圖1所示可變區(qū)的VH和/或VL的至少一個互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。因此，本發(fā)明還涵蓋包含所述多核苷酸的載體和用其轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞以及它們產(chǎn)生對α突觸核蛋白特異性的抗體和等同結(jié)合分子的用途。重組產(chǎn)生抗體及其模擬物的方式和方法以及篩選競爭結(jié)合分子(可以是抗體或可以不是抗體)的方法是本領(lǐng)域已知的。 然而，如本文所述，特別對于人的治療性應(yīng)用，本發(fā)明抗體是人抗體，意義是所述抗體的應(yīng)用基本沒有對于嵌合和甚至人源化抗體所觀察到的HAMA應(yīng)答。而且，本文公開了可用于鑒定樣品中α突觸核蛋白的組合物和方法。公開的抗α 突觸核蛋白抗體可用于篩查人血液、CSF和尿的樣品中α突觸核蛋白的存在，例如通過使用基于ELISA的分析或表面適應(yīng)分析。本文公開的方法和組合物可幫助診斷觸核蛋白病例如帕金森病，并且可用于監(jiān)測疾病進(jìn)展和治療效力。如實施例4所說明的，本發(fā)明抗α突觸核蛋白抗體能夠在帕金森病轉(zhuǎn)基因小鼠模型中改善運動表現(xiàn)和高架十字迷宮行為。這些結(jié)果證實本發(fā)明的人衍生的抗α突觸核蛋白抗體的預(yù)期治療價值。因此，本發(fā)明的一個具體目的是提供用于治療或預(yù)防突觸核蛋白病的方法，所述突觸核蛋白病例如帕金森病(PD)、帕金森病癡呆(PDD)、路易體癡呆(DLB)、阿爾茨海默病路易體變異型(LBVAD)、多系統(tǒng)萎縮(MSA)、單純性自主神經(jīng)衰弱(PAF)、神經(jīng)退行性變與腦鐵累積1型(ΝΒΙΑ-Ι)、阿爾茨海默病、皮克病、青年型全身性神經(jīng)軸性營養(yǎng)不良 (Hallervorden-Spatz病)、肌萎縮性側(cè)索硬化、外傷性腦損傷和唐氏綜合征。所述方法包括對受試者施用有效濃度的人抗體或抗體衍生物，其中抗體靶向α突觸核蛋白。本發(fā)明其他實施方案將通過隨后說明和實施例而變得明顯。附圖簡述圖 1 人抗體 ΝΙ-202. 3G12(A)、ΝΙ-202. 12F4 (B)和 ΝΙ-202. 3D8 (C)的可變區(qū)即重鏈和κ/λ輕鏈的氨基酸序列和核苷酸序列。對于人抗體NI-202.3D8，已經(jīng)克隆了兩個可變輕鏈序列VKal (C)和VKcl⑶，每一個可與可變重鏈序列VHEl (C)配對。用下劃線的⑶R 指示構(gòu)架(FR)和互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。重鏈結(jié)合區(qū)(JH)和輕鏈結(jié)合區(qū)(JK)也被指示。由于克隆策略，重鏈和輕鏈的N末端的氨基酸序列可能在FRl中含有引物誘導(dǎo)的改變，然而， 這不實質(zhì)影響抗體的生物活性。為了提供共有的人抗體，最初克隆的核苷酸和氨基酸序列根據(jù)數(shù)據(jù)庫中有關(guān)的人種系可變區(qū)序列來排列和調(diào)節(jié)；參見例如MRC Centre for Protein Engineering (Cambridge, UK)管理的 Vbase (http://vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk/)。被認(rèn)為可能偏離共有種系序列并因此可起源于PCR引物的那些氨基酸以粗體顯示。圖2:重組人α突觸核蛋白抗體針對不同表位。將重組全長和截斷的α突觸核蛋白以相等的涂布濃度(20yg/ml)涂布于ELISA板。(A)重組人α突觸核蛋白抗體 NI-202.3G12在直接ELISA中結(jié)合全長α突觸核蛋白，但不結(jié)合α突觸核蛋白截斷物，指向NI-202. 3G12的結(jié)構(gòu)識別表位。(B)重組NI-202. 12F4在直接ELISA中結(jié)合全長α突觸核蛋白和含有氨基酸(aa)l-60的α突觸核蛋白截斷物，指向α突觸核蛋白的N-末端兩親重復(fù)區(qū)內(nèi)NI-202. 12F4的表位。(C)LB509抗體結(jié)合C-末端α突觸核蛋白片段，證實之前確定的表位(aa 115-122)。值是平均值士 SEM (n = 2-3)。圖3:重組人α突觸核蛋白抗體在直接ELISA中結(jié)合α突觸核蛋白，但不結(jié)合 β-和Y突觸核蛋白。以相等涂布濃度Qyg/ml)涂布在ELISA板上的重組α-、β-和 Y突觸核蛋白與重組人α突觸核蛋白抗體或pan突觸核蛋白抗體孵育。(A)后者檢測所有三種突觸核蛋白，而重組人α突觸核蛋白抗體(B)NI-202. 3G12和(C)NI-202. 12F4(C) 選擇性結(jié)合α突觸核蛋白。值是平均值士 SEM (n = 2-3)。圖4 重組人α突觸核蛋白抗體NI-202. 12F4在^festern印跡分析中結(jié)合α突觸核蛋白但不結(jié)合β-和Y突觸核蛋白。重組α-、β-和γ突觸核蛋白(每個750ng) 經(jīng)受SDS-PAGE，隨后經(jīng)受Wfestern印跡分析。㈧考馬斯染色揭示SDS-PAGE上相等的蛋白濃度。(B)NI-202. 12F4與α突觸核蛋白但不與β-和γ突觸核蛋白強(qiáng)烈相互作用。(C) 無初級抗體未檢測到信號。圖5 :(Α)非轉(zhuǎn)基因和人α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的腦提取物的NI-202. 12F4免疫印跡分析顯示對人α突觸核蛋白的優(yōu)先結(jié)合。野生型和人α突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的腦提取物通過與人特異性α突觸核蛋白抗體LB509、人和小鼠α突觸核蛋白反應(yīng)性抗體克隆42和NI-202. 12F4免疫印跡來分析。而克隆42檢測對應(yīng)于小鼠和人α突觸核蛋白的突出條帶，LB509和NI-202. 12F4顯示對人α突觸核蛋白的強(qiáng)烈偏好。(B)腦提取物的 NI-202. 12F4免疫印跡分析顯示對人α突觸核蛋白聚集物的優(yōu)先結(jié)合。健康對照受試者和路易體癡呆(DLB)患者的大腦皮層提取物以及野生型小鼠和人Α30Ρ α突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠的腦提取物通過Astern印跡分析。NI-202. 12F4以高靈敏度檢測DLB和A30P α突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因腦提取物中α突觸核蛋白聚集物的寡聚體和原纖維形式。在人和野生型小鼠組織中觀察到對單體形式的α突觸核蛋白的最小結(jié)合，并且在高度過表達(dá)α突觸核蛋白的A30PCI突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因腦提取物中的中度結(jié)合。相反，克隆42抗體以高靈敏度檢測單體形式和α突觸核蛋白片段并且與聚集的α突觸核蛋白物類結(jié)合差。圖6 重組NI-202. 12F4顯示對人α突觸核蛋白的野生型和疾病引起的突變體的高親和力結(jié)合。重組野生型(· )、Α53Τ( ■ )、Α30Ρ(*)和Ε64Κ( )人α突觸核蛋白被涂布到ELISA板上Qyg/ml)并用各種濃度的NI202. 12F4探測。半數(shù)最大有效濃度(EC50) 對于野生型α突觸核蛋白是321ρΜ，對于Α53Τ突變?nèi)甩镣挥|核蛋白是^3ρΜ，對于Α30Ρ 突變?nèi)甩镣挥|核蛋白是228ρΜ，并且對于Ε64Κ突變?nèi)甩镣挥|核蛋白是483ρΜ。圖7 :NI-202. 12F4的免疫組織化學(xué)結(jié)合分析。NI-202. 12F4顯示α突觸核蛋白病變的突出染色，包括路易體和路易突起樣包涵體，以及體樹的和突觸的α突觸核蛋白在表達(dá)人Α53Τ(Α)或Α30Ρα突觸核蛋白(B)的轉(zhuǎn)基因小鼠的自由浮動切片中和在帕金森病 (C)和路易體癡呆(D)的人腦組織中的聚集?？贵wSyn211以高靈敏度在人Α30Ρα突觸核蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠(E)中檢測生理突觸的α突觸核蛋白，而NI-202. 12F4優(yōu)先結(jié)合病理性α 突觸核蛋白聚集物(B)。與僅對照染色的二級抗體(G)相比較，NI-202. 12F4的結(jié)合實際上不含野生型小鼠(F)的腦切片，而克隆42抗體顯示小鼠α突觸核蛋白蛋白(H)的突出的突觸染色。圖8 重組NI-202. 12F4顯示對高密度涂布的α突觸核蛋白的優(yōu)先結(jié)合。將重組全長或截斷的α突觸核蛋白以指示濃度涂布在ELISA板上并用各種濃度的NI-202. 12F4 或 Syn211 抗體通過直接 ELISA 探測(〇 20 μ g/ml ；▲ 2 μ g/ml ；▼ 1 μ g/ml ； 250ng/ml ； □ lOOng/ml重組全長或1-60 α突觸核蛋白的涂布濃度)。測定了指示抗體效價的半數(shù)最大有效濃度(EC50)。(A)重組NI-202. 12F4對α突觸核蛋白的高親和力結(jié)合需要α突觸核蛋白的高涂布密度。而以20 μ g/ml濃度涂布的α突觸核蛋白觀察到IllpM EC50，EC50 值隨涂布濃度的降低而快速增加，說明α突觸核蛋白的較低涂布濃度下親和力的急劇損失。這些特征指向在高涂布濃度的α突觸核蛋白優(yōu)先形成的NI-202. 12F4的構(gòu)象性表位。 (B)Syn211的結(jié)合不受涂布濃度的影響。在較低涂布密度下觀察到商業(yè)途徑獲得的Syn211 抗體的親和力沒有下降，EC50范圍從20 μ g/ml α突觸核蛋白涂布密度的335pm到IOOng/ ml α突觸核蛋白涂布密度的99pM。(C)重組NI-202. 12F4與包含氨基酸1_60的N-末端 α突觸核蛋白片段的高親和力結(jié)合需要高涂布密度。NI-202. 12F4顯示當(dāng)量和涂布濃度依賴性的對全長以及截斷α突觸核蛋白的結(jié)合，指向α突觸核蛋白的氨基酸1-60內(nèi)含有的 NI-202. 12F4的構(gòu)象性表位。(D)含有覆蓋α突觸核蛋白的N-末端60氨基酸的重疊的20 氨基酸片段的生物素化肽涂布在親和素板上并用NI-202. 12F4或檢測aa 21-40內(nèi)表位的 pan-突觸核蛋白對照抗體探測。因此，對照抗體強(qiáng)烈結(jié)合肽21-40和較少程度結(jié)合肽11-30 和31-50。相反，觀察到NI-202. 12F4不結(jié)合任何測試的肽，表明沒有一個N-末端片段足夠作為NI-202. 12F4表位，并且對于最佳結(jié)合和形成結(jié)構(gòu)NI-202. 12F4表位可能需要更大片段。圖9 用NI-202. 12F4的慢性治療改善α突觸核蛋白Α53Τ轉(zhuǎn)基因小鼠中的運動表現(xiàn)。10.5個月大的α突觸核蛋白Α53Τ轉(zhuǎn)基因小鼠每周用NI-202. 12F4或PBS(5mg/kg ； 腹腔內(nèi)應(yīng)用)治療。治療兩個月后在爬桿測試中評估運動表現(xiàn)。(A)NI-202. 12F4治療的動物需要顯著更少的時間來向下轉(zhuǎn)(t-轉(zhuǎn)；1.7士0.3 vs. 4. 6士0.6 sec，ρ = 0. 0002，雙尾學(xué)生t檢驗)。(B)NI-202. 12F4治療的動物還使用顯著更少的時間(t_總計)下降到圈養(yǎng)籠 (7. 3士0. 9 vs. 10. 4士0. 7 sec, ρ = 0. 012，雙尾學(xué)生 t 檢驗)。圖10 用NI-202. 12F4對α突觸核蛋白Α53Τ轉(zhuǎn)基因小鼠的長期治療導(dǎo)致高架十字迷宮行為恢復(fù)。10. 5個月大的α突觸核蛋白Α53Τ轉(zhuǎn)基因小鼠每周腹腔內(nèi)用5mg/kg NI-202. 12F4或PBS治療。兩個月治療之后，測試動物的高架十字迷宮行為。與媒介物治療的對照動物相比，NI-202. 12F4治療動物花費顯著更少的時間并覆蓋開放臂中顯著更小的距離，表明正常行為的恢復(fù)。圖11 用NI-202. 12F4對α突觸核蛋白Α53Τ轉(zhuǎn)基因小鼠的慢性治療導(dǎo)致人A53Tci突觸核蛋白的升高的血漿水平。血漿樣品從12.5個月大的、已經(jīng)用5!1^/1^ NI-202. 12F4或PBS每周腹腔內(nèi)治療2個月的α突觸核蛋白Α53Τ轉(zhuǎn)基因小鼠制備。最后一次應(yīng)用之后M小時取血。(A)血漿中NI-202. 12F4水平使用直接α突觸核蛋白ELISA 測定。(B)血漿中人A53Tci突觸核蛋白水平使用人特異性α突觸核蛋白夾心ELISA測定。 與對照動物相比，用NI-202. 12F4治療的動物具有顯著升高的人α突觸核蛋白血漿水平 (24. 9 士 4. 1 vs. 1. 9 士 1. 2ng/ml, ρ = 0. 0002)。發(fā)明詳述I.定義突觸核蛋白病或突觸核蛋白病變是多元組的神經(jīng)退行性疾病，共有在選擇性易損的神經(jīng)元群和神經(jīng)膠質(zhì)中不溶α突觸核蛋白聚集物構(gòu)成的常見病理性損傷。這些疾患包括帕金森病(PD)、帕金森病癡呆(PDD)、路易體癡呆(DLB)、青年型全身性神經(jīng)軸性營養(yǎng)不良(Hallervorden-Spatz病)、單純性自主神經(jīng)衰弱(PAF)、多系統(tǒng)萎縮(MSA)和神經(jīng)退行性變與腦鐵累積1型(NBIA-I)。臨床上，它們通過運動、感知、行為和自主功能的慢性和漸進(jìn)下降來鑒定，取決于損傷的分布。帕金森病是具有未知病原學(xué)的年齡依賴性神經(jīng)退行性疾病。認(rèn)為散發(fā)帕金森病由基因易損性和環(huán)境侵害的組合導(dǎo)致。還認(rèn)為帕金森病(PD)由不同機(jī)制引發(fā)時遵循共有的病理生理途徑。一個共有的節(jié)點是涉及α突觸核蛋白。該蛋白與帕金森病病變的聯(lián)系已經(jīng)通過鑒定家族性病例中基因的點突變和三體化、α突觸核蛋白定位至路易體、帕金森病的標(biāo)志性病理特征之一和帕金森病的神經(jīng)毒性模型中α突觸核蛋白表達(dá)與疾病病變之間的關(guān)聯(lián)來確立。額外證據(jù)表明，α突觸核蛋白的特定形式(例如，錯折疊和α突觸核蛋白結(jié)合的多巴胺)參與散發(fā)病。突觸核蛋白是主要在神經(jīng)組織和某些腫瘤中表達(dá)的小的可溶性蛋白。家族包括三種已知蛋白突觸核蛋白、β突觸核蛋白和Y突觸核蛋白。所有突觸核蛋白具有共同的高度保守的α-螺旋脂質(zhì)結(jié)合基序，與可交換載脂蛋白的Α2類脂質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域類似。突觸核蛋白家族成員不存在于脊椎動物之外，盡管它們與植物'晚期胚胎豐富'蛋白具有一定保守的結(jié)構(gòu)相似性。α-和β突觸核蛋白蛋白組要存在于腦組織，其中它們主要存在于突觸前末梢。Y突觸核蛋白主要存在于外周神經(jīng)系統(tǒng)和視網(wǎng)膜，但是其在乳房腫瘤中的表達(dá)是腫瘤進(jìn)展的標(biāo)志。已經(jīng)確定了突觸核蛋白任何一個的正常細(xì)胞功能，盡管一些數(shù)據(jù)表明在調(diào)節(jié)膜穩(wěn)定性和/或翻轉(zhuǎn)中的作用。α突觸核蛋白中的突變與早期發(fā)作的帕金森病的罕見家族病例有關(guān)，蛋白異常聚集于帕金森病、阿爾茨海默病和幾種其他神經(jīng)退行性病癥。有關(guān)綜述參見例如 George，Genome Biol. 3 (2002)，reviews3002. l-reviews3002. 6，在線公開于2001年12月20日，其中表1對目前列于GenBank的突觸核蛋白家族的獨特成員進(jìn)行分類，其公開內(nèi)容在此通過引用并入。α突觸核蛋白最初在人腦中鑒定為阿爾茨海默病(AD)斑的非β淀粉狀蛋白組分 (NAC)的前體蛋白；參見例如 Ueda 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 (1993), 1282-12860 α突觸核蛋白也稱為AD淀粉狀蛋白的非A β組分(NACP)的前體，是140氨基酸的蛋白。 α突觸核蛋白以其天然形式存在為隨機(jī)卷；然而，PH的改變、分子擁擠、重金屬含量和多巴胺水平都影響蛋白構(gòu)象。寡聚體、初原纖維、原纖維和聚集部分構(gòu)象改變被認(rèn)為調(diào)節(jié)蛋白毒性。越來越多的證據(jù)表明，與非加合蛋白相比，多巴胺加合的α突觸核蛋白具有更快的時程以形成原纖維。而且，α突觸核蛋白過表達(dá)背景中的多巴胺是毒性的。在本說明書中，術(shù)語〃 α突觸核蛋白〃、“α-突觸核蛋白〃、“a_突觸核蛋白"和"aSyn"可互換使用，具體指α突觸核蛋白的天然單體形式。術(shù)語"α突觸核蛋白"還用于一般鑒定α突觸核蛋白的其他構(gòu)象異構(gòu)體，例如與多巴胺-苯醌(DAQ)結(jié)合的α突觸核蛋白和α突觸核蛋白的寡聚體或聚集物。術(shù)語"α突觸核蛋白"也用來泛指α突觸核蛋白的所有類型和形式。人α突觸核蛋白的蛋白序列是MDVFMKGLSKAKEG VVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAA ATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA(SEQ ID Ν0:1)。α 突觸核蛋白的氨基酸序列可源自文獻(xiàn)和相關(guān)數(shù)據(jù)庫；參見例如mda等，如上；GenBank swissprot locus SYUA_HUMAN，登錄號P37840。AD淀粉狀蛋白的非A β組分(NAC)源自α突觸核蛋白。α突觸核蛋白內(nèi)高度疏水的結(jié)構(gòu)域NAC是由至少觀個氨基酸殘基(殘基60-87)和任選35氨基酸殘基(殘基61-%)組成的肽。NAC表現(xiàn)出形成β折疊結(jié)構(gòu)的趨勢(Iwai， 等，Biochemistry，34 (1995) 10139-10145)。NAC 的氨基酸序列描述于 Jensen 等，Biochem. J. 310(1995)，91-94 ；GenBank 登錄號 S56746 和 Ueda 等，PNAS USA 90(1993), 1282-112860解聚的α突觸核蛋白或其片段包括NAC，表示單體肽單元。解聚的α突觸核蛋白或其片段一般是可溶的，并且能夠自聚集形成可溶寡聚體。α突觸核蛋白及其片段的寡聚體通常是可溶的并且主要作為α-螺旋存在。單體α突觸核蛋白可以通過將凍干的肽超聲溶解于純DMSO中而在體外準(zhǔn)備。得到的溶液被離心以除去任何不溶粒子。聚集的α突觸核蛋白或其片段包括NAC，表示α突觸核蛋白或其片段的寡聚體，其締合成不溶的β折疊組裝體。聚集的α突觸核蛋白或其片段包括NAC，還表示原纖維聚合物。原纖維通常是不溶的。一些抗體結(jié)合可溶的α突觸核蛋白或其片段或聚集的α突觸核蛋白或其片段。 一些抗體結(jié)合α突觸核蛋白的寡聚體比結(jié)合單體形式或原纖維形式更強(qiáng)。一些抗體結(jié)合可溶和聚集的α突觸核蛋白或其片段，任選地也結(jié)合寡聚體形式。本文公開的人抗α突觸核蛋白抗體特異性結(jié)合α突觸核蛋白及其表位，并且結(jié)合α突觸核蛋白的各種構(gòu)象及其表位。例如，本文公開了特異性結(jié)合α突觸核蛋白、天然單體形式的α突觸核蛋白、全長和截斷的α突觸核蛋白和α突觸核蛋白聚集物的抗體。 如本文使用的，對“特異性結(jié)合”、“選擇性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合” α突觸核蛋白或其表位的抗體的提及是指不結(jié)合其他無關(guān)蛋白的抗體。在一個實例中，本文公開的α突觸核蛋白抗體可以結(jié)合α突觸核蛋白或其表位并且顯示高于其他蛋白約1.5倍背景的無結(jié)合?！疤禺愋越Y(jié)合”或“選擇性結(jié)合” α突觸核蛋白構(gòu)象異構(gòu)體的抗體指不結(jié)合所有構(gòu)象的α突觸核蛋白的抗體，即，不結(jié)合至少一種其他α突觸核蛋白構(gòu)象異構(gòu)體。例如本文公開了可以區(qū)分單體和聚集形式的α突觸核蛋白、人和小鼠α突觸核蛋白；全長α突觸核蛋白和截斷形式以及人α突觸核蛋白與和Y突觸核蛋白的抗體。因為本發(fā)明的人抗α突觸核蛋白抗體已經(jīng)從沒有帕金森病體征并且表現(xiàn)出α突觸核蛋白特異性免疫應(yīng)答的老年受試者群分離，本發(fā)明的抗α突觸核蛋白抗體還可以稱為"人自身抗體"以強(qiáng)調(diào)，那些抗體實際上由受試者表達(dá)并且已經(jīng)從例如表達(dá)人免疫球蛋白的展示文庫分離，其迄今代表試圖提供人樣抗體的一種常用方法。注意，術(shù)語“一個”或“一種”指一個或多個實體；例如，“一種抗體”被理解為代表一種或多種抗體。因此，術(shù)語“一個”(或“一種”)、“一個或多個”和“至少一個”可以在本
文互換使用。本文使用的術(shù)語“多肽”預(yù)期涵蓋單個“多肽”以及多個“多肽”，并且指由通過酰胺鍵(還稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)構(gòu)成的分子。術(shù)語“多肽”指兩個或多個氨基酸的任何鏈，并且不指產(chǎn)物的具體長度。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白”、“氨基酸鏈” 或用于指兩個或多個氨基酸的鏈的任何其他術(shù)語包括在“多肽”定義中，并且術(shù)語“多肽”可以替代這些術(shù)語的任何一個或與這些術(shù)語的任何一個互換使用。術(shù)語“多肽”還預(yù)期指多肽的表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，包括但不限于糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、通過已知保護(hù)基/封閉基衍生化、蛋白裂解或被非天然存在的氨基酸修飾。 多肽可源于天然生物來源或由重組技術(shù)產(chǎn)生，但是不必從指定的核酸序列翻譯。它可以任何方式產(chǎn)生，包括通過化學(xué)合成。本發(fā)明多肽可以具有約3或更多、5或更多、10或更多、20或更多、25或更多、50或更多、75或更多、100或更多、200或更多、500或更多、1，000或更多、或2，000或更多氨基酸的尺寸。多肽可以具有確定的三維結(jié)構(gòu)，盡管它們不必具有此類結(jié)構(gòu)。具有確定的三維結(jié)構(gòu)的多肽被稱為折疊的，不具有確定三維結(jié)構(gòu)但可采取許多不同構(gòu)象的多肽被稱為未折疊的。本文使用的術(shù)語糖蛋白指與至少一個糖部分偶聯(lián)的蛋白，所述糖部分通過氨基酸殘基例如絲氨酸殘基或天冬酰胺殘基的含氧或含氮側(cè)鏈連接至蛋白。“分離的”多肽或其片段、變體或衍生物預(yù)期是不在其天然環(huán)境中的多肽。不需要特定的純化水平。例如，分離的多肽可以從其天然或自然環(huán)境去除。為本發(fā)明目的，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組產(chǎn)生的多肽和蛋白被認(rèn)為是分離的，是已經(jīng)被分離、分級分離或通過任何適合技術(shù)部分或完全純化的天然或重組多肽。本發(fā)明多肽還包括前述多肽的片段、衍生物、類似物或變體及其任意組合。當(dāng)指本發(fā)明抗體或抗體多肽時，術(shù)語“片段”、“變體”、“衍生物”和“類似物”包括保留相應(yīng)天然結(jié)合分子、抗體或多肽的抗原結(jié)合性質(zhì)的至少一些的任何多肽。除了本文其他地方討論的具體抗體片段，本發(fā)明的片段或多肽包括蛋白水解片段以及缺失片段。本發(fā)明的抗體和抗體多肽的變體包括如上所述片段，以及具有改變的氨基酸序列的多肽，所述改變由于氨基酸取代、缺失或插入。變體可以天然存在或非天然存在。非天然存在的變體可以使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變體多肽可以包含保守或非保守氨基酸取代、缺失或添加。α突觸核蛋白特異性結(jié)合分子例如，本發(fā)明的抗體和抗體多肽的衍生物是已經(jīng)被改變以表現(xiàn)出天然多肽不存在的其他特征的多肽。實例包括融合蛋白。變體多肽在本文還可以稱為“多肽類似物”。本文使用的結(jié)合分子或其片段、抗體或抗體多肽的“衍生物”指一個或多個殘基通過官能側(cè)鏈基團(tuán)的反應(yīng)被化學(xué)衍生化的本發(fā)明多肽?！把苌铩边€包括含有20個標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的一個或多個天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羥基脯氨酸可以取代脯氨酸；5-羥基賴氨酸可以取代賴氨酸；3-甲基組氨酸可以取代組氨酸；高絲氨酸可以取代絲氨酸；鳥氨酸可以取代賴氨酸。術(shù)語"多核苷酸"預(yù)期包括單一核酸以及多個核酸，并且指分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如信使RNA(mRNA)或質(zhì)粒DNA (pDNA)。多核苷酸可以包括常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(例如，酰胺鍵，例如見于肽核酸(PNA))。術(shù)語“核酸”指任何一個或多個核酸區(qū)段，例如多核苷酸中存在的DNA或RNA片段?！胺蛛x的"核酸或多核苷酸預(yù)期是核酸分子、DNA或 RNA，其已經(jīng)從其天然環(huán)境去除。例如，為本發(fā)明目的，編碼載體中含有的抗體的重組多核苷酸被認(rèn)為是分離的。分離的多核苷酸的其他實例包括異源宿主細(xì)胞中保持的重組多核苷酸或溶液中的純化(部分或完全)多核苷酸。分離的RNA分子包括本發(fā)明多核苷酸的體內(nèi)或體外RNA轉(zhuǎn)錄子。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸或核酸還包括合成產(chǎn)生的此類分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括調(diào)控元件，例如啟動子、核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止子。本文使用的“編碼區(qū)”是由翻譯成氨基酸的密碼子組成的核酸部分。盡管“終止密碼子”(TAG、TGA或TAA)不被翻譯成氨基酸，但可以認(rèn)為它是編碼區(qū)的部分，但任何側(cè)翼序列，例如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等不是編碼的部分。本發(fā)明兩個或多個編碼區(qū)可以存在于一個多核苷酸構(gòu)建體中，例如一個載體上，或單獨多核苷酸構(gòu)建體中， 例如單獨(不同)載體上。而且，任何載體可以含有一個編碼區(qū)，或者可以含有兩個或多個編碼區(qū)，例如一個載體可以單獨編碼免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)。此外，本發(fā)明載體、多核苷酸或核酸可以編碼異源編碼區(qū)，融合或未融合至編碼結(jié)合分子、抗體或其片段、變體或衍生物的核酸。異源編碼區(qū)包括但不限于專門的元件或基序，例如分泌信號肽或異源功能結(jié)構(gòu)域。在某些實施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA情況下，包含編碼多肽的核酸的多核苷酸正?？梢园▎幼雍?或其他轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件，與一個或多個編碼區(qū)可操作結(jié)合?？刹僮鹘Y(jié)合是基因產(chǎn)物例如多肽的編碼區(qū)與一個或多個調(diào)控序列以使得基因產(chǎn)物在調(diào)控序列的影響或控制下表達(dá)的方式結(jié)合。如果啟動子功能的引入導(dǎo)致編碼預(yù)期基因產(chǎn)物的mRNA的轉(zhuǎn)錄和如果兩個DNA片段之間的連接性質(zhì)不干擾表達(dá)調(diào)控序列指導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)或干擾DNA模板轉(zhuǎn)錄的能力的能力時，兩個DNA片段(例如多肽編碼區(qū)和與其結(jié)合的啟動子)是“可操作結(jié)合”或“可操作連接”的。因此，如果啟動子能夠?qū)崿F(xiàn)核酸的轉(zhuǎn)錄， 則啟動子區(qū)將與編碼多肽的核酸可操作結(jié)合。啟動子可以是細(xì)胞特異性啟動子，其指導(dǎo)僅在預(yù)定細(xì)胞中的DNA的大量轉(zhuǎn)錄。除了啟動子外的其他轉(zhuǎn)錄控制元件，例如增強(qiáng)子、操作子、阻遏子和轉(zhuǎn)錄終止信號可以與多核苷酸可操作結(jié)合以指導(dǎo)細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄。適合的啟動子和其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)在本文公開。許多轉(zhuǎn)錄控制區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些包括但不限于在脊椎動物細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，例如但不限于來自巨細(xì)胞病毒(與內(nèi)含子-A結(jié)合的即刻早期啟動子)、猿猴病毒40 (早期啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如勞氏肉瘤病毒)的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)段。其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括源自脊椎動物基因的那些，例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔球蛋白以及能夠控制真核細(xì)胞基因表達(dá)的其他序列。其他適合的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動子和增強(qiáng)子以及淋巴因子可誘導(dǎo)啟動子(例如，可由干擾素或白細(xì)胞介素誘導(dǎo)的啟動子)。類似地，許多翻譯控制元件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。這些包括但不限于核糖體結(jié)合位點、翻譯起始和終止密碼子和源自小RNA病毒的元件(特別是內(nèi)核糖體進(jìn)入位點，或IRES,還稱為CITE序列)。在其他實施方案中，本發(fā)明多核苷酸是RNA，例如信使RNA形式(mRNA)。本發(fā)明的多核苷酸和核酸編碼區(qū)可以與編碼分泌或信號肽的其他編碼區(qū)結(jié)合，所述其他編碼區(qū)指導(dǎo)由本發(fā)明多核苷酸編碼的多肽的分泌。根據(jù)信號假說，哺乳動物細(xì)胞分泌的蛋白具有信號肽或分泌前導(dǎo)序列，其在生長的蛋白鏈跨粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的排出已經(jīng)開始時從成熟蛋白切割。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解，脊椎動物細(xì)胞分泌的多肽一般具有與多肽 N末端融合的信號肽，其從完整或“全長”多肽切割以產(chǎn)生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些實施方案中，使用天然信號肽，例如免疫球蛋白重鏈或輕鏈信號肽，或者保留指導(dǎo)與之可操作結(jié)合的多肽分泌的能力的該序列的功能衍生物?？蛇x地，可使用異源哺乳動物信號肽或其功能衍生物。例如，野生型前導(dǎo)序列可以用人組織血纖維蛋白溶酶原激活子(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前導(dǎo)序列取代。除非另外說明，術(shù)語“疾患”和“疾病”在本文可互換使用。本發(fā)明上下文中使用的“結(jié)合分子”主要指抗體及其片段，但還可以指結(jié)合α突觸核蛋白的其他非抗體分子，包括但不限于激素、受體、配體、主要組織相容性復(fù)合物(MHC) 分子、伴侶分子例如熱休克蛋白(HSP)以及細(xì)胞細(xì)胞粘附分子例如鈣粘蛋白、整聯(lián)蛋白、C 型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族成員。因此，僅為了清楚而不限制本發(fā)明范圍，下述實施方案的大部分就代表開發(fā)治療劑和診斷劑的優(yōu)選結(jié)合分子的抗體和抗體樣分子來討論。術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白"在本文可互換使用?？贵w或免疫球蛋白是α突觸核蛋白結(jié)合分子，包含重鏈的至少可變結(jié)構(gòu)域，正常包含重鏈和輕鏈的至少可變結(jié)構(gòu)域。 脊椎動物系統(tǒng)中基本的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)相對完好地被理解；參見例如Harlow等，抗體:Α Laboratory Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed. 1988).如下文更詳細(xì)討論的，術(shù)語“免疫球蛋白，，包括廣泛類別的多肽，其可以被生化上區(qū)分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，重鏈被分類成8311111^、11111、31 1^、(^1丨3或印8丨1011(￥，μ , α, δ, ε)，其中有一些亞類(例如γ I-Y 4)。該鏈的性質(zhì)是確定抗體“類別”分別為IgG、 IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl等被良好鑒定，并且已知孵育功能專門化。技術(shù)人員參考本公開內(nèi)容容易辨別這些類別和同種型的每一個的修飾形式，因此在本發(fā)明范圍內(nèi)。所有免疫球蛋白類清楚地在本發(fā)明范圍內(nèi)， 下述討論一般涉及免疫球蛋白分子的Ig類。關(guān)于IgG，標(biāo)準(zhǔn)的免疫球蛋白分子包括分子量大約23000道爾頓的兩個相同的輕鏈多肽和分子量53，000-70, 000的兩個相同重鏈多肽。 四個鏈通常通過二硫鍵以“Y”構(gòu)型結(jié)合，其中輕鏈在“Y” 口處包括重鏈并經(jīng)可變區(qū)。輕鏈被分類為κ或λ (K，λ)。每個重鏈類別可以與κ或λ輕鏈結(jié)合。一般而言，輕鏈和重鏈彼此共價鍵合，當(dāng)免疫球蛋白由雜交瘤、B細(xì)胞或基因工程宿主細(xì)胞產(chǎn)生時， 兩個重鏈的“尾”部分通過共價二硫鍵或非共價鍵合彼此結(jié)合。在重鏈中，氨基酸序列從Y 構(gòu)型的分叉端得N末端至每個鏈的底部的C末端。輕鏈和重鏈都被分入結(jié)構(gòu)和功能同源性區(qū)。術(shù)語“恒定”和“可變”是功能上使用的。就這點而言，要理解，輕鏈和重鏈(Vh)部分的可變結(jié)構(gòu)域決定抗原識別和特異性。 相反，輕鏈(CL)和重鏈(CH1、CH2或CH3)的恒定結(jié)構(gòu)域賦予重要的生物性質(zhì)，例如分泌、經(jīng)胎盤運動型、Fc受體結(jié)合、互補(bǔ)結(jié)合等。通過約定，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域編號隨它們遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點或抗體氨基末端而增加。N末端部分是可變區(qū)，C末端部分是恒定區(qū)；CH3和CL結(jié)構(gòu)域?qū)嶋H分別包含重鏈和輕鏈的羧基末端。如上所示，可變區(qū)允許抗體選擇性識別和特異性結(jié)合抗原表位。即，抗體的\結(jié)構(gòu)域和Vh結(jié)構(gòu)域或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)子集組合形成可變區(qū)，確定三維抗原結(jié)合位點。該四級抗體結(jié)構(gòu)形成存在于Y的每個臂的末端的抗原結(jié)合位點。更具體說，抗原結(jié)合位點由Vh 和八鏈的每個上的三個CDR確定。含有足以特異性結(jié)合α突觸核蛋白的任何抗體或免疫球蛋白片段在本文可互換表示"結(jié)合片段"或"免疫特異性片段"。在天然存在的抗體中，抗體包含六個超變區(qū)，有時稱為"互補(bǔ)決定區(qū)" 或"CDR"，存在于每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，其是短的非連續(xù)氨基酸序列，當(dāng)抗體在水環(huán)境中采取其三維構(gòu)型時，其被特別定位以形成抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。“CDR"側(cè)翼具有四個相對保守的“構(gòu)架”區(qū)或顯示更少的分子內(nèi)變異性的‘‘FR”。構(gòu)架區(qū)主要采取β折疊構(gòu)型，CDR 形成連接β折疊結(jié)構(gòu)的環(huán)，有些情況下形成β折疊結(jié)構(gòu)的部分。因此，構(gòu)架區(qū)作用為形成支架，通過鏈內(nèi)非共價相互作用使CDR置于正確方向。定位的CDR形成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域確定與免疫反應(yīng)性抗原上的表位互補(bǔ)的表面。該互補(bǔ)表面促進(jìn)抗體與其同源表位的非共價結(jié)合。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易鑒定任何給定重鏈或輕鏈可變區(qū)的分別包含⑶R和構(gòu)架區(qū)的氨基酸，因為它們已經(jīng)被精確定義；參見〃 Sequences of Proteins of Immunological Interest, " Kabat, Ε.,等，U. S. Department of Health and A Services, (1983)；禾口 Chothia 和 Lesk, J. Mol. Biol.，196 (1987)，901-917，其在此通過引用整體并入。當(dāng)存在本領(lǐng)域使用和/或可接受的兩個或多個術(shù)語定義時，除非明確指明相反，本文使用的術(shù)語的定義預(yù)期包括所有此類含義。具體實例是使用術(shù)語"互補(bǔ)決定區(qū)"("CDR")來描述重鏈和輕鏈多肽的可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的非連續(xù)抗原結(jié)合位點。該具體區(qū)描述于Kabat等，U. S. Dept. of Health and human Services, " Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983)和 Chothia和 Lesk，J. Mol. Biol.，196(1987)，901-917， 其在此通過引用并入，其中定義包括相互比較時氨基酸殘基的重疊或子集。然而，指抗體或其變體的CDR的任一定義的應(yīng)用預(yù)期在本文定義和使用的術(shù)語范圍內(nèi)。涵蓋由上文引用的參考文獻(xiàn)的每一個定義的CDR的適當(dāng)?shù)陌被釟埢杏谙卤?作為比較。涵蓋特定CDR的精確殘基數(shù)目將根據(jù)CDR的序列和尺寸而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)確定哪些殘基構(gòu)成給定抗體的人IgG亞型的特定高變區(qū)或CDR，抗體的可變區(qū)氨基酸序列。表1:CDR 定義權(quán)利要求
1.一種人單克隆抗α突觸核蛋白抗體。
2.權(quán)利要求1所述的抗體，所述抗體能夠特異性結(jié)合天然單體形式的α突觸核蛋白。
3.權(quán)利要求1或2所述的抗體，所述抗體能夠結(jié)合寡聚或聚集形式的α突觸核蛋白。
4.權(quán)利要求1至3任一項所述的抗體，其中與β突觸核蛋白或Y突觸核蛋白相比，所述抗體特異性結(jié)合α突觸核蛋白。
5.權(quán)利要求1至4任一項所述的抗體，所述抗體識別α突觸核蛋白的N-末端L片段或C-末端96_14(|片段。
6.權(quán)利要求1至4任一項所述的抗體，所述抗體不識別α突觸核蛋白的截斷形式。
7.權(quán)利要求1至6任一項所述的抗體或其α突觸核蛋白結(jié)合片段，在其可變區(qū)包含至少一個圖1所示的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。
8.權(quán)利要求7所述的抗體或結(jié)合片段，包含圖1所示的V1^n/或\區(qū)的氨基酸序列。
9.一種抗體或抗原結(jié)合分子，其與權(quán)利要求1至8任一項的抗體競爭對α突觸核蛋白的特異性結(jié)合。
10.權(quán)利要求9所述的抗體，所述抗體是嵌合的鼠-人抗體或鼠源化抗體。
11.權(quán)利要求1至10任一項所述的抗體，所述抗體選自由單鏈Fv片段(ScFV)、F(ab') 片段、F(ab)片段和F(ab' )2片段組成的組。
12.—種多核苷酸，至少編碼權(quán)利要求1至11任一項所述的抗體的免疫球蛋白鏈的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或可變區(qū)。
13.—種載體，包含權(quán)利要求12所述的多核苷酸，任選地與編碼抗體的其他免疫球蛋白鏈的可變區(qū)的權(quán)利要求12所述的多核苷酸組合。
14.一種宿主細(xì)胞，包含權(quán)利要求10所述的多核苷酸或權(quán)利要求13所述的載體。
15.一種用于制備抗α突觸核蛋白抗體或其免疫球蛋白鏈的方法，所述方法包括(a)培養(yǎng)權(quán)利要求14所述的細(xì)胞；和(b)從所述培養(yǎng)物分離所述抗體或其免疫球蛋白鏈。
16.一種抗體或其免疫球蛋白鏈，其由權(quán)利要求12所述的多核苷酸編碼或者可通過權(quán)利要求15所述的方法獲得。
17.權(quán)利要求1至11或16任一項所述的抗體，所述抗體被可檢測地標(biāo)記。
18.權(quán)利要求17所述的抗體，其中所述可檢測標(biāo)記選自由酶、放射性同位素、熒光團(tuán)和重金屬組成的組。
19.權(quán)利要求1至11或16至18任一項所述的抗體，所述抗體與藥物連接。
20.一種組合物，包含權(quán)利要求1至11或16至19任一項所述的抗體、權(quán)利要求12所述的多核苷酸、權(quán)利要求13所述的載體或權(quán)利要求14所述的細(xì)胞。
21.權(quán)利要求20所述的組合物，所述組合物是藥物組合物并且還包含藥學(xué)上可接受的載體。
22.權(quán)利要求21所述的組合物，所述組合物是疫苗。
23.權(quán)利要求21或22所述的藥物組合物，還包含用于治療突觸核蛋白病的其他藥劑。
24.權(quán)利要求20所述的組合物，所述組合物是診斷組合物，并且任選地包含常規(guī)用于基于免疫或核酸的診斷方法的試劑。
25.權(quán)利要求1至11或16至19任一項的抗體或與其任何一個具有基本相同的結(jié)合特異性的α突觸核蛋白結(jié)合分子、權(quán)利要求12所述的多核苷酸、權(quán)利要求13所述的載體或權(quán)利要求14所述的細(xì)胞在制備用于預(yù)防性和治療性治療突觸核蛋白病、監(jiān)測突觸核蛋白病進(jìn)展或受試者對突觸核蛋白病治療的響應(yīng)的藥物組合物或診斷組合物中的用途。
26.—種診斷受試者中突觸核蛋白病的方法，所述方法包括(a)用權(quán)利要求1至11或16至19任一項的抗體、其α突觸核蛋白結(jié)合片段或與其任何一個具有基本相同的結(jié)合特異性的α突觸核蛋白結(jié)合分子評估待診斷受試者樣品中的 α突觸核蛋白水平；和(b)將所述α突觸核蛋白水平與參考標(biāo)準(zhǔn)相比較，所述參考標(biāo)準(zhǔn)指示一個或多個對照受試者中α突觸核蛋白的水平，其中所述α突觸核蛋白水平與所述參考標(biāo)準(zhǔn)之間的差異或相似性指示所述受試者具有帕金森病。
27.權(quán)利要求25所述的用途或權(quán)利要求沈所述的方法，其中所述突觸核蛋白病選自由以下組成的組帕金森病(PD)、帕金森病癡呆(PDD)、路易體癡呆(DLB)、阿爾茨海默病路易體變異型(LBVAD)、多系統(tǒng)萎縮(MSA)、單純性自主神經(jīng)衰弱(PAF)、神經(jīng)退行性變與腦鐵累積1型(ΝΒΙΑ-Ι)、阿爾茨海默病、皮克病、青年型全身性神經(jīng)軸性營養(yǎng)不良 (Hallervorden-Spatz病)、肌萎縮性側(cè)索硬化、外傷性腦損傷和唐氏綜合征。
28.一種用于診斷突觸核蛋白病的試劑盒，所述試劑盒包括權(quán)利要求1至11或16至 19任一項的抗體或與其任何一個具有基本相同的結(jié)合特異性的α突觸核蛋白結(jié)合分子、 權(quán)利要求12所述的多核苷酸、權(quán)利要求13所述的載體或權(quán)利要求14所述的細(xì)胞，任選地具有試劑和/或使用說明書。
29.包含權(quán)利要求1至11或16至19任一項的抗體的至少一個⑶R的α突觸核蛋白結(jié)合分子在制備用于體內(nèi)檢測或靶向人體或動物體內(nèi)α突觸核蛋白的治療劑和/或診斷劑的組合物中的用途。
30.權(quán)利要求四所述的用途，其中所述體內(nèi)成像包括正電子發(fā)射斷層照相(PET)、單光子發(fā)射斷層照相(SPECT)、近紅外(NIR)光學(xué)成像或磁共振成像(MRI)。
全文摘要
提供了新的人α突觸核蛋白特異性自身抗體及其片段、衍生物和變體，以及與之相關(guān)的方法。還公開了與α突觸核蛋白特異性抗體相關(guān)的分析、試劑盒和固體支持體。所述抗體、免疫球蛋白鏈、及其結(jié)合片段、衍生物和變體可用于藥物組合物和診斷組合物，分別用于α突觸核蛋白靶向免疫治療和診斷。
文檔編號C07K16/18GK102317316SQ200980156871
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月19日
發(fā)明者克里斯多夫·霍克, 安德里亞斯·衛(wèi)霍芬, 簡·格林, 羅杰·尼奇 申請人:帕尼瑪制藥股份公司, 蘇黎世大學(xué)