專利名稱：擬肽大環(huán)化合物的制作方法
擬肽大環(huán)化合物交叉參考本申請(qǐng)要求2008年9月22日提交的題目為“Organic Compounds”的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/099，063(代理人案號(hào)35224-742. 102)的優(yōu)先權(quán)，本文通過引用引入該申請(qǐng)。
背景技術(shù)：
重組或合成產(chǎn)生的肽作為藥品具有重要的應(yīng)用。但是，肽類經(jīng)常存在代謝穩(wěn)定性差、細(xì)胞滲透性差和由于構(gòu)象的靈活性而導(dǎo)致混雜的結(jié)合的問題。穩(wěn)定這些肽的一種方法是使用分子內(nèi)交聯(lián)連接體(crosslinker)以維持肽處于所需的構(gòu)象，例如使用二硫鍵、酰胺鍵或碳碳鍵來連接氨基酸側(cè)鏈。參見，例如，Jackson等人(1991)，J. Am. Chem. Soc. 113 :9391-9392 ；Phelan 等人(1997)，J.Am. Chem. Soc. 119 :455-460 ；Taylor(2002), Biopolymers 66 :49-75 ；Brunei 等人 0005)，Chem. Commun. (20) :2552-2554；Hiroshige 等人(1995)，J. Am. Chem. Soc. 117 :11590-11591 ；Blackwell 等人(1998)，Angew. Chem. Int. Ed. 37 :3281-3284 ；Schafmeister 等人 O000)，J. Am. Chem. Soc. 122 :5891-5892 ； Walensky 等人(2004)，Science 305 1466-1470 ；Bernal 等人(2007)，J. Am. Chem Soc. 129 2456-2457 ；美國(guó)專利7，192，713B1 (Verdine等人)(描述交聯(lián)的穩(wěn)定螺旋肽，其包含天然和非天然氨基酸，其中，該肽包含至少兩個(gè)能夠發(fā)生C-C鍵形成反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán))和美國(guó)專利5，811，515 (Grubbs等人)(描述從含有兩個(gè)或多個(gè)不飽和C-C鍵的前體合成構(gòu)象限制性的/環(huán)狀穩(wěn)定的肽和擬肽)，該專利和出版物的內(nèi)容通過引用引入本文。這類通過分子內(nèi)交聯(lián)劑而構(gòu)象穩(wěn)定的多肽有時(shí)被稱為“裝訂的(stapled)，，多肽。這些交聯(lián)的多肽的主要優(yōu)勢(shì)在于，相對(duì)于對(duì)應(yīng)的非裝訂的多肽，它們具有增強(qiáng)的穿透細(xì)胞膜的能力。這種細(xì)胞攝取被認(rèn)為是通過利用內(nèi)吞作用的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制介導(dǎo)的。有助于肽進(jìn)入細(xì)胞的一些物理特性還傾向于增加交聯(lián)的多肽對(duì)于血清蛋白質(zhì) (如白蛋白)的親和力。因此，許多極有希望的先導(dǎo)物表現(xiàn)出顯著的“血清偏移(serum shift) ”，相比于使用無血清培養(yǎng)基的分析中的活性，其在體內(nèi)或在具有基于血清的培養(yǎng)基的分析中活性大大降低，使得該肽在治療或診斷的應(yīng)用中遠(yuǎn)不夠理想。但是，具有低水平血清結(jié)合的交聯(lián)多肽往往細(xì)胞滲透能力差以及藥代動(dòng)力學(xué)差，例如，快速腎臟清除或首過清除。本發(fā)明解決了這一問題和其他問題。發(fā)明概述本發(fā)明公開了鑒定和優(yōu)化交聯(lián)的多肽的方法，所述交聯(lián)的多肽對(duì)于血清蛋白具有降低的親和力從而允許在血清存在下具有良好的活性，同時(shí)仍保持對(duì)于細(xì)胞膜的足夠的親和力以容易地轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞，保持對(duì)于血清蛋白的足夠的親和力以具有可接受的藥代動(dòng)力學(xué)特性和保持與細(xì)胞內(nèi)的靶受體結(jié)合的高親和力。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)， 交聯(lián)的多肽存在著血清蛋白結(jié)合的最佳范圍。本發(fā)明還提供了具有優(yōu)良的細(xì)胞滲透能力和在血清存在下的生物活性，以及具有允許優(yōu)化具有提高的治療效力或診斷活性的交聯(lián)多肽的構(gòu)效關(guān)系的最佳化合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了鑒定在人類全血中具有提高的效力的交聯(lián)多肽的方法，包括以下步驟合成母體交聯(lián)多肽的類似物，并在無人類血清蛋白質(zhì)和存在一個(gè)或多個(gè)濃度的人血清的情況下進(jìn)行細(xì)胞分析，從而確定每種交聯(lián)多肽對(duì)于人血清蛋白的表觀親和力。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制備在人全血中具有優(yōu)化的細(xì)胞效力的多肽的
方法，該方法包括a)提供包含連接所述多肽的第一氨基酸和第二氨基酸的交聯(lián)連接體的
母體多肽，和其中，母體多肽通過能量依賴性的過程滲透細(xì)胞膜并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)；b)
在所述母體多肽中識(shí)別由鄰近大的疏水側(cè)鏈的酸性側(cè)鏈組成的一個(gè)或多個(gè)二肽基序，其
中，酸性側(cè)鏈不是結(jié)合靶標(biāo)所必需的；C)用中性側(cè)鏈替代所述基序中的酸性側(cè)鏈，以制備
修飾的母體多肽；d)在人血清存在和不存在的情況下，在活性通過結(jié)合分子內(nèi)靶標(biāo)來介導(dǎo)
的全細(xì)胞分析中測(cè)量修飾的母體多肽的體外效力；e)計(jì)算修飾的多肽對(duì)于人血清蛋白的
表觀親和力OC)及其EC5tlJPf)如果所述修飾的母體多肽具有與母體多肽相比較高的K/
和相等或較低的EC5tl，則選擇該修飾的母體多肽作為優(yōu)化的多肽。在一些實(shí)施方式中，K/由
公式
權(quán)利要求
1.制備在人全血中具有優(yōu)化的細(xì)胞效力的多肽的方法，所述方法包括a)提供包含連接所述多肽的第一氨基酸和第二氨基酸的交聯(lián)連接體的母體多肽，其中，該母體多肽通過能量依賴性的過程滲透細(xì)胞膜，并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)；b)在所述母體多肽中識(shí)別由鄰近大的疏水側(cè)鏈的酸性側(cè)鏈組成的一個(gè)或多個(gè)二肽基序，其中，該酸性側(cè)鏈不是結(jié)合靶標(biāo)所必需的；c)用中性側(cè)鏈取代所述基序中的所述酸性側(cè)鏈，以制備修飾的母體多肽；d)在人血清存在和不存在的情況下，在其中活性通過結(jié)合分子內(nèi)靶標(biāo)介導(dǎo)的全細(xì)胞分析中測(cè)量所述修飾的母體多肽的體外效力；e)計(jì)算所述修飾的多肽對(duì)于人血清蛋白的表觀親和力OC)及其EC5tl；和f)如果所述修飾的多肽具有與母體多肽相比較高的K/和相等或較低的EC5tl，則選擇該修飾的母體多肽作為優(yōu)化的多肽。
2.篩選包含連接多肽的第一氨基酸和第二氨基酸的交聯(lián)連接體的多肽的方法，其中， 所述多肽通過能量依賴性的過程滲透細(xì)胞膜，并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)，所述方法包括a)在人血清存在和不存在的情況下，在其中活性通過結(jié)合分子內(nèi)靶標(biāo)介導(dǎo)的全細(xì)胞分析中測(cè)量所述多肽的體外效力；b)計(jì)算所述多肽對(duì)于人血清蛋白的表觀親和力(K/)及其EC5tl；和c)選擇具有1至700微摩爾的K/的化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽具有小于70微摩爾的K/。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽具有約1-10微摩爾的K/。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽具有大約0.1-50%的人血中的估計(jì)游離分?jǐn)?shù)，其中，所述估計(jì)游離分?jǐn)?shù)由
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽具有大約0.5-10%的人血中的估計(jì)游離分?jǐn)?shù)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述能量依賴性的細(xì)胞滲透機(jī)制是內(nèi)吞作用。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述第一氨基酸和第二氨基酸的至少一個(gè)是 α，α-二取代的氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述第一氨基酸和第二氨基酸都是α， α-二取代的氨基酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽包括螺旋。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽包括α-螺旋。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述第一氨基酸和所述第二氨基酸由3個(gè)氨基酸分隔。
13.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述交聯(lián)連接體包含6至14個(gè)連續(xù)的鍵。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述交聯(lián)連接體包含8至12個(gè)連續(xù)的鍵。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽包括含大約18至沈個(gè)原子的環(huán)。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述第一氨基酸和所述第二氨基酸由6個(gè)氨基酸分隔。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述交聯(lián)連接體包含8至16個(gè)連續(xù)的鍵。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述交聯(lián)連接體包含10至13個(gè)連續(xù)的鍵。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽包括含大約四至37個(gè)原子的環(huán)。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述交聯(lián)連接體跨越所述α-螺旋的1至 5圈。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述交聯(lián)連接體跨越所述α-螺旋的1個(gè)圈。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述交聯(lián)連接體跨越所述α-螺旋的2個(gè)圈。
23.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述交聯(lián)連接體的長(zhǎng)度是所述α-螺旋每一圈大約5 A至大約9 Α。
24.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽在ρΗ7. 4時(shí)攜帶凈正電荷。
25.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽包含鹵素、烷基、熒光部分、 親和性標(biāo)記、靶向部分或放射性同位素中的一種或多種。
26.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽提供治療效力。
27.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽具有大約1微摩爾或更弱的對(duì)于人血清蛋白的表觀親和力。
28.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽具有大約3微摩爾或更弱的對(duì)于人血清蛋白的表觀親和力。
29.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽具有大約10微摩爾或更弱的對(duì)于人血清蛋白的表觀親和力。
30.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述選擇的多肽相對(duì)于相應(yīng)的未交聯(lián)的多肽具有改善的通過能量依賴性的過程滲透細(xì)胞膜的能力。
31.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述二肽基序中的酸性側(cè)鏈和大的疏水側(cè)鏈不是結(jié)合靶標(biāo)所必需的，并且分別被中性和較低疏水性的側(cè)鏈替代。
32.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法選擇的包含連接所述多肽的第一氨基酸和第二氨基酸的交聯(lián)連接體的多肽，其中，所述多肽通過能量依賴性的過程滲透細(xì)胞膜并結(jié)合細(xì)胞內(nèi)的靶標(biāo)。
33.治療和控制與BCL-2家族成員的異常表達(dá)或活性有關(guān)的病癥的方法，包括向需要的受試者施用有效量的前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽。
34.治療或控制通過在過度增殖的細(xì)胞中MAML和Notch或CSL蛋白之間的相互作用或結(jié)合介導(dǎo)的過度增殖的疾病或病癥的方法，包括向需要的受試者施用有效量的前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽。
35.前述任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的多肽在制備用于治療或控制與BCL-2家族成員的異常表達(dá)或活性有關(guān)的病癥或用于治療或控制通過在過度增殖的細(xì)胞中的MAML和Notch或CSL 蛋白之間的相互作用或結(jié)合介導(dǎo)的過度增殖疾病或病癥的藥物中的用途。
36.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其中，所述K/由公式
全文摘要
本發(fā)明提供了相對(duì)于相應(yīng)的前體多肽具有改進(jìn)的性質(zhì)的生物活性的交聯(lián)多肽，具有良好的細(xì)胞滲透性質(zhì)和與人蛋白的結(jié)合降低。本發(fā)明另外提供了鑒定和制備這種改進(jìn)的多肽的方法。
文檔編號(hào)C07K14/47GK102482336SQ200980142223
公開日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2009年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月22日
發(fā)明者D·A·安尼斯, H·M·納什, R·卡佩勒-利伯曼, T·K·索耶, 河畑紀(jì)之 申請(qǐng)人:愛勒讓治療公司