專利名稱：乙酸格拉默(glatiramer acetate)的合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請案涉及合成多肽的方法，所述多肽在結(jié)構(gòu)中包含以下氨基酸單元，即L-丙 氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸和L-酪氨酸。乙酸格拉默(glatiramer acetate)還稱作共聚 物-1，其為本發(fā)明的代表性多肽。
背景技術(shù)：
乙酸格拉默是已批準(zhǔn)用于治療多發(fā)性硬化癥的多肽混合物。其是化學(xué)合成多肽的 乙酸鹽的混合物，所述多肽含有四種天然氨基酸L-丙氨酸、L-谷氨酸、L-賴氨酸和L-酪 氨酸，其平均摩爾比通常分別為 0. 392-0. 462,0. 129-0. 159,0. 300-0. 374 和 0. 086-01000。 乙酸格拉默的平均分子量為4，700-11, 000道爾頓。在化學(xué)上，指明乙酸格拉默為L-谷氨酸與L-丙氨酸、L-賴氨酸和L-酪氨酸 的聚合物的乙酸鹽(鹽)。其結(jié)構(gòu)式為(Glu，Ala, Lys, Tyr)x. xCH3C00H。其CAS編號為 147245-9-2-9。制備包括乙酸格拉默在內(nèi)的此類多肽的方法已闡述于以下文獻中美國專利第 3，849，550號和第5，800，808號；美國專利公開案第2006/0172942號、第2006/0154862號 和第2007/0141663號。這些專利和專利公開案的全部內(nèi)容是以引用方式并入本文中。此類 多肽的制備方法是基于酪氨酸的N-羧基酸酐、L-丙氨酸的N-羧基酸酐、經(jīng)保護L-谷氨酸 的N-羧基酸酐與經(jīng)保護L-賴氨酸的N-羧基酸酐的共聚合以形成經(jīng)保護共聚物。經(jīng)保護 L-谷氨酸的解封閉是通過酸解或氫解來實現(xiàn)(第一去保護)并且隨后通過堿裂解自L-賴 氨酸去除保護基(第二去保護)。通常，通過三氟乙?；鶃肀ＷoL-賴氨酸，并使用諸如哌啶等具有弱堿性的含氮堿 來去除L-賴氨酸的保護基。含氮堿通常具有超過IM的濃度且數(shù)量超過L-賴氨酸的35摩 爾當(dāng)量。所述方法既不經(jīng)濟也不環(huán)保。因此，業(yè)內(nèi)期望改良諸如乙酸格拉默等多肽的生產(chǎn)。
發(fā)明內(nèi)容
本申請案提供制備多肽或其醫(yī)藥上可接受鹽的方法。多肽包含L-丙氨酸、L-酪 氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸。所述方法包含使L-賴氨酸經(jīng)保護多肽(其包含經(jīng)第一保護 基保護的L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸)在水中與四烷基氫氧化銨反應(yīng)以 去除第一保護基。優(yōu)選地，四烷基氫氧化銨是四C1-C8烷基氫氧化銨。更優(yōu)選地，四烷基氫氧化銨是 四甲基氫氧化銨、四乙基氫氧化銨或四丁基氫氧化銨，尤其是四丁基氫氧化銨。
第一保護基可為可防止賴氨酸發(fā)生不期望反應(yīng)并且隨后可易于去除的任何基團。 例如，可通過烷氧羰基或芳氧羰基和/或烷羰基或芳羰基、更優(yōu)選地通過選自以下的基團 以氨基甲酸酯和/或酰胺形式來保護賴氨酸甲氧基羰基、乙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰 基、三氟乙?；?、2，2，2-三氯乙氧基羰基、三氯乙?；?、甲代吡啶基和其組合。更具體來說， 第一保護基是三氟乙?；-賴氨酸經(jīng)保護多肽可通過任何適宜方法來制備。優(yōu)選地，其可通過包含以下步 驟的方法來制備a)使經(jīng)第二保護基保護的L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸的N-羧基酸酐與經(jīng)第 一保護基保護的L-賴氨酸的混合物在溶劑中聚合以獲得經(jīng)保護多肽；和b)去除第二保護基以獲得L-賴氨酸經(jīng)保護多肽?；蛘?，聚合步驟中所用氨基酸中至少一者可呈N-硫代羧基酸酐形式，而非N-羧基 酸酐形式(參見美國專利申請公開案第2009/0035816號，其全部內(nèi)容是以引用方式并入本 文中)。第二保護基可為可防止L-谷氨酸發(fā)生不期望反應(yīng)并且隨后可易于去除的任何適 宜基團。例如，可通過烷基和/或芳香族基團、優(yōu)選地通過選自以下的基團以酯形式來保護 L-谷氨酸環(huán)己基、芐基、叔丁基、烯丙基酯、金剛烷基、9-芴基甲基和其組合。更優(yōu)選地，第 二保護基選自由以下組成的群組芐基和叔丁基，尤其是芐基。去除第二保護基的步驟(即去保護)可通過(例如)堿裂解、酸解、硫解、氫化或 酶催化水解來完成。根據(jù)本發(fā)明一實施例，去保護步驟包含向經(jīng)保護多肽添加酸。酸可為(例如)存于 選自乙酸、二噁烷、乙酸乙酯和其混合物的溶劑介質(zhì)中的氫溴化物、三氟乙酸或氯化氫。作 為優(yōu)選實施例，酸是溶于乙酸中的氫溴酸。優(yōu)選地，所述方法包含用C5-C12烷烴、尤其庚烷 洗滌在去保護步驟期間形成的反應(yīng)混合物的另一步驟。根據(jù)本申請案的方法制備的多肽或其醫(yī)藥上可接受鹽優(yōu)選地為乙酸格拉默。四烷基氫氧化銨堿的濃度優(yōu)選地為約0. 5M。四烷基氫氧化銨堿的量相對于經(jīng)第一 保護基保護的L-賴氨酸的摩爾量小于10摩爾當(dāng)量，優(yōu)選地為1. 5至6摩爾當(dāng)量，更優(yōu)選地 為約3摩爾當(dāng)量。優(yōu)選地，在去除第一保護基并合成多肽后，所述方法包含通過透析純化并分離多 肽的步驟。更優(yōu)選地，此純化和分離是在任何另一純化與分離步驟(若存在)之前實施?？?通過對水的單一透析來分離或純化多肽。作為優(yōu)選實施例，本發(fā)明中使用的四烷基氫氧化銨堿可具有約40% (以重量計) 的水溶液濃度。四烷基氫氧化銨堿相對于經(jīng)第一保護基保護的賴氨酸的摩爾量可為1. 5-6。 在去除第一保護基期間使用的水量相對于賴氨酸經(jīng)保護多肽的量可為約10重量份。去除 第一保護基的其它反應(yīng)條件可包括反應(yīng)溫度20至25°C，反應(yīng)時間24小時，和反應(yīng)壓 力標(biāo)準(zhǔn)大氣壓。根據(jù)另一實施例，本申請案提供根據(jù)上述方法產(chǎn)生的新穎多肽。與其它方法相比，本申請案中的方法具有以下優(yōu)點申請人:發(fā)現(xiàn)堿性稍強于具有弱堿性的含氮堿(例如哌啶)的含氧堿可使第一保護 基去除保護。為去除第一保護基，本申請案中所用堿相對于經(jīng)第一保護基保護的賴氨酸的摩爾量可遠(yuǎn)小于其它公開案中所述方法中所用含氮堿的摩爾量。本申請案中所用含氧堿的 濃度也可遠(yuǎn)小于其它方法中所用含氮堿的濃度。在上述反應(yīng)中獲得的多肽聚合物的濃度高 于通過申請人已知的其它方法獲得者。因此，本發(fā)明方法比所報導(dǎo)其它方法更加經(jīng)濟并且 更易于處理。另外，由于可在處理后實施透析而不是如其它公開案所述在透析后處理，因此 本申請案的方法可節(jié)省產(chǎn)物制備的處理時間。在形成本揭示內(nèi)容一部分的隨附權(quán)利要求書中特別指明表征本發(fā)明的各種新穎 性特征。為更好地理解本發(fā)明、其操作優(yōu)點和通過其使用達成的具體目標(biāo)，應(yīng)參照闡釋并描 述本發(fā)明優(yōu)選實施例的說明性內(nèi)容。
具體實施例方式提供以下實例來闡釋而非限制本發(fā)明各實施例。根據(jù)本發(fā)明一實施例，并且如下 文各實例所述，制備共聚物的方法涉及通過L-丙氨酸的N-羧基酸酐、L-谷氨酸Y-芐酯 的N-羧基酸酐、N-三氟乙?；嚢彼岬腘-羧基酸酐與L-酪氨酸的N-羧基酸酐的聚合來 制備經(jīng)保護共聚物。通過在水中依次與33% HBr/HOAc和四烷基氫氧化銨反應(yīng)來去除保護 基以獲得格拉默。乙酸格拉默可通過經(jīng)由透析純化共聚物，之后用乙酸處理以形成乙酸鹽來獲得。 作為一實施例，所述方法因此可涉及四種N-羧基酸酐的聚合、兩個純化步驟和一個乙酸鹽 形成步驟。實例1經(jīng)保護共聚物的制備將L-丙氨酸的N-羧基酸酐(4. Og, 34. 78mmol)、L-谷氨酸γ -芐酯的N-羧基酸 酐(3. Og, 11. 39mmol)、N-三氟乙?；嚢彼岬腘-羧基酸酐(7. 47g，mol)和L-酪氨酸的 N-羧基酸酐(1.6g，7.73mm0l)置于具有磁性攪拌器的單頸燒瓶中。通過添加無水二噁烷 (289mL)溶解此混合物。添加蒸餾二乙胺(60 μ L)。在室溫下將所得混合物以機械方式攪拌 24小時。將丙酮(116mL)添加至混合物中并將溶液緩慢傾倒至丙酮(173mL)與水(578mL) 的混合物中。攪拌并過濾懸浮液。在真空和NMT 45°C下干燥固體以獲得12.02g經(jīng)保護共 聚物(產(chǎn)率為94.7% )。實例2自聚[L-Ala，5_芐基-L-Glu，N6_TFA-L-Lys，L-Tyr]去除芐基保護基以形成聚 [L-Ala, L-Glu, N6-TFA-L-Lys, L-Tyr]使12. 02g如實例1中所述合成的經(jīng)保護共聚物懸浮于72mL 33% HBr/HOAc中。 在室溫下將混合物攪拌17小時且溶液變澄清。用正庚烷(190mL)萃取并洗滌混合物。將 混合物下層轉(zhuǎn)移至水(240mL)與正庚烷(120mL)的混合物中。過濾沉淀并干燥以獲得呈白 色固體形式之三氟乙?；鵢格拉默。實例3自聚[L-Ala，L-Glu, N6_TFA-L-Lys，L-Tyr]去除三氟乙?；Ｗo基以形成聚 [L-Ala, L-Glu, L-Lys, L-Tyr]在室溫下使9. 5g在實例2中合成的三氟乙?；鵢格拉默與水(120. 2mL)和40% 四丁基氫氧化銨水溶液(52. 2mL，3當(dāng)量)反應(yīng)24小時。用乙酸(20mL)將混合物的pH調(diào)節(jié)至3至4以獲得乙酸格拉默溶液。使用3千道爾頓膜來實施超濾以去除低分子量雜質(zhì)。在2 個連續(xù)水超濾循環(huán)后，濃縮并凍干所得溶液以獲得呈純白色固體形式的乙酸格拉默(4. 7g， 產(chǎn)率為60% )。實例 4自聚[L-Ala，L-Glu, N6_TFA-L-Lys，L-Tyr]去除三氟乙?；Ｗo基以形成聚 [L-Ala, L-Glu, L-Lys, L-Tyr]在室溫下使0. 12g在實例2中合成的三氟乙?；?格拉默與水(1. 2mL)和25%四 甲基氫氧化銨水溶液(0. 32mL, 3當(dāng)量)反應(yīng)24小時。用乙酸(0. 2mL)將混合物的pH調(diào)節(jié) 至3至4以獲得乙酸格拉默溶液。使用3千道爾頓膜來實施超濾以去除低分子量雜質(zhì)。在2 個連續(xù)水超濾循環(huán)后，濃縮并凍干所得溶液以獲得呈純白色固體形式的乙酸格拉默(39mg， 產(chǎn)率為42% )。實例 5自聚[L-Ala，L-Glu, N6_TFA-L-Lys，L-Tyr]去除三氟乙?；Ｗo基以形成聚 [L-Ala, L-Glu, L-Lys, L-Tyr]在室溫下使0. 20g在實例2中合成的三氟乙?；鵢格拉默與水(2. OmL)和20% 四乙基氫氧化銨水溶液(1.02mL，3當(dāng)量)反應(yīng)24小時。用乙酸(0. 5mL)將混合物的pH 調(diào)節(jié)至3至4以獲得乙酸格拉默溶液。使用3千道爾頓膜來實施超濾以去除低分子量雜 質(zhì)。在2個連續(xù)水超濾循環(huán)后，濃縮并凍干所得溶液以獲得呈純白色固體形式的乙酸格拉 默(76. 7mg，產(chǎn)率為 49%)。本發(fā)明并不受上文僅作為實例來闡述的實施例的限制，但可在隨附專利權(quán)利要求 書界定的保護范圍內(nèi)以多種方式來修改。
權(quán)利要求
1.一種制備多肽或其醫(yī)藥上可接受鹽的方法，其中所述多肽包含L-丙氨酸、L-酪氨 酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸，并且所述方法包含使包含經(jīng)第一保護基保護的L-丙氨酸、L-酪 氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的L-賴氨酸經(jīng)保護多肽在水中與四烷基氫氧化銨反應(yīng)以去除 所述第一保護基。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述四烷基氫氧化銨是四C1-C8烷基氫氧化銨。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述四烷基氫氧化銨選自由以下組成的群組四甲 基氫氧化銨、四乙基氫氧化銨、四丁基氫氧化銨和其組合。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述四烷基銨是四丁基氫氧化銨。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一保護基選自由以下組成的群組烷羰基、烷 氧羰基、芳羰基、芳氧羰基和其經(jīng)取代衍生物。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述第一保護基是三氟乙?；?br>
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述L-賴氨酸經(jīng)保護多肽是通過包含以下的方法來 制備a)使經(jīng)第二保護基保護的L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸與經(jīng)所述第一保護基保護 的L-賴氨酸的N-羧基酸酐的混合物在溶劑中聚合以獲得經(jīng)保護多肽；和b)去除所述第二保護基以獲得所述L-賴氨酸經(jīng)保護多肽。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第二保護基是通過使步驟a)中的所述經(jīng)保護多 肽與氫溴酸在乙酸中反應(yīng)來去除。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其包含用C5-C12烷烴洗滌在所述經(jīng)保護多肽與氫溴酸在 乙酸中的所述反應(yīng)期間形成的所述反應(yīng)混合物的另一步驟。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述C5-C12烷烴是庚烷。
11.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第二保護基選自由以下組成的群組芐基和叔丁基。
12.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述第二保護基是芐基。
13.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述多肽或其醫(yī)藥上可接受鹽是乙酸格拉默 (glatiramer acetate)0
14.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述四烷基氫氧化銨堿的量相對于所述經(jīng)所述第 一保護基保護的L-賴氨酸小于10摩爾當(dāng)量。
15.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述四烷基氫氧化銨堿的量相對于所述經(jīng)所述第 一保護基保護的L-賴氨酸為1. 5至6摩爾當(dāng)量。
16.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述四烷基氫氧化銨堿的量相對于所述經(jīng)所述第 一保護基保護的L-賴氨酸為約3摩爾當(dāng)量。
17.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法包含在任何另一純化并分離所述多肽的 步驟之前通過透析來純化并分離所述多肽的步驟。
18.一種根據(jù)如權(quán)利要求1所述的方法來制備的多肽或其醫(yī)藥上可接受鹽。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備多肽或其醫(yī)藥上可接受鹽的方法，所述方法包含使包含經(jīng)保護基保護的L-丙氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酸和L-賴氨酸的L-賴氨酸經(jīng)保護多肽在水中與四烷基氫氧化銨反應(yīng)以去除所述保護基。
文檔編號C07K1/00GK102112485SQ200980130802
公開日2011年6月29日 申請日期2009年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月7日
發(fā)明者何孟芬, 蕭宗育 申請人:臺灣神隆股份有限公司