胰島淀粉樣多肽和鮭魚降鈣素的衍生雜合肽的制作方法

專利名稱：胰島淀粉樣多肽和鮭魚降鈣素的衍生雜合肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及雜合肽衍生物，其中所述雜合肽包含人胰島淀粉樣多肽序列的C-末 端、鮭魚降鈣素肽序列的中間部分和人胰島淀粉樣多肽(amylin)肽序列的N-末端，并且其 中白蛋白結(jié)合部分與所述雜合肽連接，任選通過接頭連接。
背景技術：
大量人群罹患糖尿病和肥胖癥并且數(shù)量還在不斷增加。糖尿病是一種利用葡萄糖 的能力部分或完全喪失的代謝疾病。用于降低血糖的最有效抗糖尿病藥就是胰島素及其類 似物。長期以來，已經(jīng)知道，當傳統(tǒng)胰島素用于治療糖尿病時，它與體重增加有關。人胰島淀 粉樣多肽是一種長度為37個氨基酸的肽，其理化性質(zhì)使其用作藥物時很棘手。具體地講， 它具有在體外和/或離體形成原纖維的趨勢并因沉淀而變得無效。一種稱為Symlin的藥 品目前已上市，它含有人胰島淀粉樣多肽的類似物(普蘭林肽(pramlintide))，其中37個 氨基酸中有3個被脯氨酸取代。這基本上改善了形成原纖維的趨勢。已知普蘭林肽能減少 人的食物攝取。然而，即使是普蘭林肽也難以在中性PH溶液中保存，因而在一種酸性溶液 中提供，即Symlin 。在哺乳動物中，降鈣素在骨髓更新和鈣代謝的調(diào)節(jié)中起作用。由升高的血清鈣水 平導致從甲狀腺中釋放的降鈣素對骨和其它器官起作用，從而使血清鈣水平趨向減低。降鈣素已經(jīng)用于在臨床上治療鈣代謝障礙和疼痛，并且它在哺乳動物中增加葡萄 糖水平的關系已經(jīng)成為不同報告的主題。降鈣素在治療糖尿病中的用途描述于美國專利號 5，321,008 (1994年6月14日授權(quán))和美國專利號5，508，260 (1996年4月16日授權(quán))。國際專利申請WO 2006083254公開了胰島淀粉樣多肽家族肽，其包含胰島淀粉樣 多肽和其類似物的環(huán)狀區(qū)；降鈣素或其類似物的α螺旋區(qū)的至少部分α螺旋區(qū)和降鈣素 或其類似物的α螺旋區(qū)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及雜合肽衍生物，其中所述雜合肽包含人胰島淀粉樣多肽序列的C-末 端、鮭魚降鈣素肽序列的中間部分和人胰島淀粉樣多肽序列的N-末端，并且其中白蛋白結(jié) 合部分與所述雜合肽連接，任選通過接頭連接。一方面，本發(fā)明的衍生物是類似雜合肽衍生物，其中與所述母體雜合肽相比，所述 類似雜合肽具有1-12個氨基酸取代。另一方面，本發(fā)明衍生物的白蛋白結(jié)合部分與所述雜合肽的N-端氨基酸和/或 C-端氨基酸和/或與所述雜合肽內(nèi)部的一個或多個氨基酸連接。本發(fā)明的衍生物可包含連接在所述雜合肽N-端的由1-12個額外氨基酸組成的 N-端延伸，其中所述白蛋白結(jié)合部分與所述額外氨基酸的N-端氨基酸連接，任選通過接頭 連接。本發(fā)明還包括這樣的衍生物其中與所述母體雜合肽相比，已添加0-8個額外電荷。也描述了包含本發(fā)明衍生物和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物和用作藥物的本發(fā)明衍生物。定義術語“效力”用于描述指定化合物在測定中的效應，在所述測定中已經(jīng)建立了對數(shù) 濃度和化合物效應之間的S形曲線關系。此外，反應應當可在0-100%之間變化。EC50(有 效濃度50)可用于描述指定化合物在測定中達到50%反應的濃度。效力可在測定部分所述 的例如螢光素酶測定中進行檢測。術語“活性”一方面是指減少食欲和/或增加飽腹感的能力?？梢园凑绽缑枋?于測定標題下的藥理學測定I，通過測定減少食欲的能力而測定活性。本文所用的術語“人胰島淀粉樣多肽”是指與來自人胰臟β-細胞的胰島素共分 泌的人胰島淀粉樣多肽，其具有以下SEQ ID No 1所示序列Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Ala-Ile-Leu-Ser-Ser-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2SEQ ID No 1其中二硫橋位于位置2和位置7的半胱氨酸之間并且其C-末端呈酰胺基形式?！捌仗m林肽”在本文中是指人胰島淀粉樣多肽的類似物，其中人胰島淀粉樣多肽在 位置25J8和四已被3個脯氨酸殘基取代，得到25ftx)，28Pro, 29Pro人胰島淀粉樣多肽。 因此，普蘭林肽具有以下序列Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Ala-Thr-Gln-Arg-Leu-Ala-Asn-Phe-Leu-Val-His-Ser-Ser-Asn-Asn-Phe-Gly-Pro-Ile-Leu-Pro-Pro-Thr-Asn-Val-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2SEQ ID No 2“降鈣素”或“CT”是指人的肽激素及其物種變體，包括人降鈣素(h-CT)或鮭魚降 鈣素(sCT)。降鈣素是由哺乳動物甲狀腺的濾泡旁細胞以及鳥類和魚類的腮后腺產(chǎn)生的一種 小肽。已經(jīng)分離出多種類型的降鈣素，例如人降鈣素、鮭魚降鈣素、鰻魚降鈣素、elkatonin、 豬降鈣素和雞降鈣素。在不同降鈣素種類中有明顯的結(jié)構(gòu)非同源性。例如，在構(gòu)成人降鈣 素和鮭魚降鈣素的氨基酸之間僅有50%同一性。鮭魚降鈣素(S-CT)具有以下序列Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-L ys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2SEQ ID No 4人降鈣素(h-CT)是含有32個氨基酸殘基的肽激素，它主要由甲狀腺的濾泡旁 (也稱為C)細胞產(chǎn)生。鮭魚降鈣素是由32個氨基酸組成的多肽。它在多肽鏈氨基端的第 一和第七氨基酸之間具有二硫橋(該二硫橋是其生物活性必不可少的)并且在羧基端氨基 酸上具有脯氨酰胺基。人降鈣素具有以下序列Cys-Gly-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Met-Leu-Gly-Thr-Tyr-Thr-Gln-Asp-Phe-Asn-L ys-Phe-His-Thr-Phe-Pro-Gln-Thr-Ala-Ile-Gly-Val-Gly-Ala-Pro-NH2SEQ ID No 3
術語“母體雜合肽”在本文中應指包含人胰島淀粉樣多肽序列的C-末端、鮭魚降 鈣素肽序列的中間部分和人胰島淀粉樣多肽序列的N-末端的雜合肽，其具有以下序列Lys-Cys-Asn-Thr-Ala-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Arg-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-A rg-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Asn-Thr-Tyr-NH2SEQ ID No 5本文所用的術語“類似雜合肽”或“雜合類似物”用于指這樣的肽其中母體雜合 肽的一個或多個氨基酸殘基已被獨立修飾，即其中一個或多個氨基酸殘基已被其它氨基酸 殘基取代和/或其中母體雜合肽的一個或多個氨基酸殘基已缺失和/或其中一個或多個氨 基酸殘基已經(jīng)添加到母體雜合肽上。一方面，取代或添加是任何天然氨基酸。一方面，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于17個修飾(取代、缺失、添加)。 在一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于15個修飾(取代、缺失、添 加)。在一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于13個修飾(取代、缺失、 添加)。在另一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于11個修飾(取代、缺 失、添加)。在另一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于10個修飾(取 代、缺失、添加)。在另一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于9個修飾 (取代、缺失、添加)。在另一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于8個 修飾(取代、缺失、添加)。在一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于7 個修飾(取代、缺失、添加)。在一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含小于 6個修飾(取代、缺失、添加)。在另一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物包含 小于5個修飾(取代、缺失、添加)。在另一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類似物 包含小于4個修飾(取代、缺失、添加)。在另一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜合類 似物包含小于3個修飾(取代、缺失、添加)。在另一個實施方案中，相對于母體雜合肽，雜 合類似物包含小于2個修飾(取代、缺失、添加)。修飾可以發(fā)生在雜合肽序列的任何位置。在本發(fā)明的一方面，氨基酸殘基的修飾 可發(fā)生在肽的N-端和/或雜合肽的C-端。在本發(fā)明的一方面，修飾包括在雜合肽的N-端 添加一個或多個例如1、2、3或4個氨基酸。本發(fā)明也包括這樣的雜合類似物其中N-端序列是鮭魚降鈣素的N-端序列， C-端序列是人胰島淀粉樣多肽的C-端序列，只要所述雜合類似物在以上解釋的雜合類似 物的定義之內(nèi)。本文所用的術語“雜合肽”可理解為本文所定義的母體雜合肽或雜合類似物。當2 個半胱氨酸存在于雜合肽N-端時，應當理解它們具有二硫橋。C-端通常呈酰胺形式，除非 另有說明。本文的雜合類似物是相對于作為其來源的人胰島淀粉樣多肽和鮭魚降鈣素 (s-CT)的相應序列而命名的，使人胰島淀粉樣多肽(Seq ID No 1)的氨基酸序列和編號用 于描述衍生自人胰島淀粉樣多肽的雜合類似物部分，而且鮭魚降鈣素(Seq ID No 4)的氨 基酸序列和編號用于描述衍生自s-CT的雜合類似物部分。例如，以上所示的SEQ ID No:5 由人胰島淀粉樣多肽的氨基酸1-7、s-CT的氨基酸8-27(其中氨基酸編號11和18已各自 從賴氨酸殘基取代為精氨酸殘基)、人胰島淀粉樣多肽的氨基酸33-37組成。所給定的名稱 因此就是胰島淀粉樣多肽(1-7)-[Argll，Argl8] sCT (8-27)-胰島淀粉樣多肽(33-37)。
本文所用的術語“衍生物”是指這樣的肽其中肽的一個或多個氨基酸殘基已被修 飾，例如通過烷基化、酰基化、酯形成、酰胺形成或通過馬來酰亞胺偶聯(lián)。本文所用的術語“雜合肽的衍生物”或“雜合肽衍生物”是指母體雜合肽或雜合類 似物的衍生物。本文所用的術語“衍生”是指通過共價鍵的化學連接。例如賴氨酸殘基或半胱氨 酸殘基通過化學鍵與白蛋白結(jié)合殘基連接。作為實例，這樣的化學鍵可通過賴氨酸ε氨基 的衍生化，通過與白蛋白結(jié)合殘基例如長脂肪酸的活性酯酰化而得到。本發(fā)明所用的衍生 的其它實例包括但不限于烷基化、酯形成、酰胺形成或馬來酰亞胺偶聯(lián)而衍生。本文所用的術語“接頭”是指將肽與白蛋白結(jié)合殘基間隔開來的間隔基(spacer) (間隔基和接頭這兩個術語在本說明書中可互換使用)。接頭是通過在兩者之間具有接頭 而將白蛋白結(jié)合部分與降鈣素或其類似物間隔開來的化學部分。例如，接頭可包含一個或 兩個氨基酸，其在一端與白蛋白結(jié)合部分結(jié)合，而在另一端與雜合肽衍生物位置1的氨基 酸結(jié)合。接頭的化學部分可促進/增強取代基的白蛋白結(jié)合效應，例如包含YGlu的接頭 就可增強雜合肽衍生物的白蛋白結(jié)合效應。本文所用的術語“白蛋白結(jié)合部分”是指與人 血清白蛋白非共價結(jié)合的殘基。與治療性多肽連接的白蛋白結(jié)合殘基通常對人血清白蛋白 的親和力小于1微摩爾，優(yōu)選小于500nM，甚至更優(yōu)選小于200nM或甚至小于ΙΟΟηΜ。本文所用的術語“親水接頭”是指用包含至少5個非氫原子的化學部分將肽和白 蛋白結(jié)合殘基間隔開的間隔基，其中這些非氫原子有30-50%是N或0。本文所用的術語“作用時間”是指可測定藥理學效應(例如食物攝取減少)的時 間跨度。術語“穩(wěn)定制劑”是指物理穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性或理化穩(wěn)定性有所增加的制劑。對于蛋白質(zhì)制劑，本文所用的術語“物理穩(wěn)定性”是指當?shù)鞍踪|(zhì)暴露給熱-機械應 力和/或與不穩(wěn)定界面和表面(例如疏水表面和界面)相互作用時，蛋白質(zhì)不形成生物失 活和/或不溶性蛋白質(zhì)聚集體的趨勢?？赏ㄟ^目測、本文其它地方所述的ThT原纖維形成 測定和/或濁度測定，評價含水蛋白質(zhì)制劑的物理穩(wěn)定性。在黑暗背景下，在強烈聚焦光線 中對制劑進行目測。制劑濁度的特征在于濁度的目測評分等級，例如評分為0-3 (無濁度制 劑對應的目測評分為0，而在日光下具有目測濁度的制劑對應的目測評分為幻。當制劑在 日光下具有目測濁度時，對于蛋白質(zhì)聚集而言，就認為制劑是物理不穩(wěn)定的?；蛘?，可通過 技術人員熟知的簡單的濁度測定來評價制劑濁度。對于蛋白質(zhì)制劑或藥物制劑，術語“化學穩(wěn)定性”是指在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中沒有化學共 價變化，因此，與天然蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相比，不會導致潛在的生物學效力降低和或潛在的免疫原 性增加的化學降解產(chǎn)物的形成。根據(jù)天然蛋白質(zhì)的種類和特性的不同以及蛋白質(zhì)所接觸的 環(huán)境的不同，可形成多種化學降解產(chǎn)物。在本領域技術人員眾所周知的蛋白質(zhì)制劑的貯存 和使用期間，大多數(shù)情況下可能無法完全避免對化學降解的消除，經(jīng)?？捎^察到化學降解 產(chǎn)物數(shù)量不斷增加。大部分蛋白質(zhì)都傾向于脫酰胺作用，在該過程中谷氨酰胺?；鶜埢?天冬酰胺?；鶜埢膫?cè)鏈酰胺基水解而形成游離羧酸。其它降解途徑包括形成高分子量轉(zhuǎn) 化產(chǎn)物，其中兩個或更多個蛋白質(zhì)分子通過轉(zhuǎn)酰胺基作用和/或二硫化物相互作用而彼此 共價結(jié)合，導致形成共價結(jié)合的二聚體、寡聚體和多聚體降解產(chǎn)物(lability of Protein Pharmaceuticals,Ahern. Τ. J. & Manning Μ. C. ,Plenum Press,New York 1992)?？商峒暗幕瘜W降解的另一種變體形式就是氧化(例如甲硫氨酸殘基的氧化)?？赏ㄟ^在接觸不同環(huán) 境條件之后的不同時間點測定化學降解產(chǎn)物的含量，來評價蛋白質(zhì)制劑的化學穩(wěn)定性(降 解產(chǎn)物通常因例如增加溫度而加速形成)。通常按照分子大小和/或電荷，使用不同的色譜 技術(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)來分離每種降解產(chǎn)物從而測定其含量。術語“穩(wěn)定制劑”是指與肽的水溶液相比，其物理穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性或理化穩(wěn)定 性有所增加的制劑。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及這樣的雜合肽所述雜合肽包含人胰島淀粉樣多肽序列的C-末端、鮭 魚降鈣素肽序列的中間部分和人胰島淀粉樣多肽序列的N-末端。已經(jīng)證明，包含胰島淀粉樣多肽C-末端和N-末端以及鮭魚降鈣素中間部分的雜 合肽在各種胰島淀粉樣多肽模型中都具有良好的體外和體內(nèi)效力。然而，仍然需要提供具 有天然人胰島淀粉樣多肽活性的衍生物，以及具有比天然人胰島淀粉樣多肽更延長的1 特性、表現(xiàn)出更高的溶解度和/或穩(wěn)定性的衍生物。一方面描述了包含白蛋白結(jié)合部分的雜合肽衍生物。尤其需要得到在非皮下(例如口服、含服、肺部或鼻腔)給予時穩(wěn)定的肽或衍生 物。一方面，相對于胰島淀粉樣多肽類似物例如普蘭林肽而言，本發(fā)明的雜合肽衍生物因此 具有改進的酶穩(wěn)定性。本發(fā)明的雜合肽衍生物因此尤其可用于口服、含服、肺部或鼻腔給藥 途徑。一方面，相對于胰島淀粉樣多肽類似物例如普蘭林肽而言，本發(fā)明的雜合肽衍生 物對胰蛋白酶的酶促降解具有改進的穩(wěn)定性?！矫嫣峁┚哂懈咝ЯΦ碾s合肽衍生物。又一方面，相對于人胰島淀粉樣多肽而 言，提供具有改進的效力的雜合肽衍生物。再一方面提供效力與普蘭林肽相當?shù)碾s合肽衍 生物。再一方面，相對于普蘭林肽而言，提供具有改進的效力的雜合肽衍生物。一方面提供物理穩(wěn)定的雜合肽衍生物。另一方面，相對于普蘭林肽，提供具有保持 的物理穩(wěn)定性的雜合肽衍生物。又一方面，相對于人胰島淀粉樣多肽，提供具有增加的物理 穩(wěn)定性的雜合肽衍生物。雜合類似物一方面優(yōu)選具有20-45個天然存在的或非天然存在的氨基酸，優(yōu)選 30-35個天然存在的或非天然存在的氨基酸。在本發(fā)明的一方面，雜合肽衍生物的氨基酸序列選自胰島淀粉樣多肽(1-7)-[Argil，Argl8]sCT(8-27)-胰島淀粉樣多肽(33-37)(seq ID No 5)胰島淀粉樣多肽0-7)-[Argil，Argl8]sCT(8-27)-胰島淀粉樣多肽(33-37) (seq ID No 6)胰島淀粉樣多肽(1-8)-[Argil，Argl8]sCT(9-27)-胰島淀粉樣多肽(33-37)(seq ID No 7)胰島淀粉樣多肽0-8)-[Argil，Argl8]sCT(9-27)-胰島淀粉樣多肽(33-37) (seq ID No 8)[Hisl]胰島淀粉樣多肽(1-8)-[Hisll，Hisl8, HisM] sCT (9-27)-胰島淀粉樣多 月太(33-37)(seq ID No 9)
其中至少一個氨基酸殘基與白蛋白結(jié)合殘基連接，任選通過接頭連接，其中，當兩 個半胱氨酸存在于雜合肽的N-端時，二硫橋橋接所述兩個半胱氨酸，并且其中C-端是呈酰 胺形式，除非另有說明。當生理表達時，本發(fā)明的肽通常在C-端酰胺化，但為了本發(fā)明的目的并不需要， 因此可具有游離OH或-NH2基團或其它翻譯后修飾。一方面，氨基酸殘基的取代或添加包括谷氨酸殘基、賴氨酸殘基、精氨酸殘基、組 氨酸殘基和/或天冬氨酸殘基的取代和/或添加，以得到與母體雜合肽相比具有0-8個額 外電荷的雜合類似物。又一方面，氨基酸殘基的取代或添加包括組胺殘基和/或精氨酸殘 基的取代和/或添加，以得到與母體雜合肽相比具有0-8個額外電荷的雜合類似物。再一 方面，氨基酸殘基的取代或添加包括組氨酸殘基的取代和/或添加，以得到與母體雜合肽 相比具有0-8個額外電荷的雜合類似物。雜合肽中的任何氨基酸位置都可以被衍生。在本發(fā)明的一方面，衍生的氨基酸殘 基包含氨基。包含氨基的氨基酸殘基的實例是賴氨酸、鳥氨酸、ε-N-烷基化賴氨酸例如 ε -N-甲基賴氨酸、0-氨基乙基絲氨酸、0-氨基丙基絲氨酸或更長的0-烷基化絲氨酸，其 在側(cè)鏈中含有伯氨基或仲氨基。在本發(fā)明的又一方面，衍生的氨基酸殘基包含在側(cè)鏈中的 伯氨基。包含伯氨基的氨基酸殘基實例是賴氨酸、鳥氨酸、0-氨基乙基絲氨酸、0-氨基丙基 絲氨酸或更長的0-烷基化絲氨酸，其在側(cè)鏈中含有伯氨基。在本發(fā)明的還一方面，衍生的 氨基酸殘基是賴氨酸。在本發(fā)明的還一方面，本發(fā)明的衍生物僅在一個位置被衍生，例如僅 一個氨基酸殘基被衍生。在本發(fā)明的一方面，接頭包含一個或多個烷撐二醇單元，例如1-5個烷撐二醇單 元。烷撐二醇單元在又一方面是乙二醇、丙二醇或丁二醇，但也可以是更高級的烷撐二醇。在本發(fā)明的另一方面，接頭是選自以下的親水接頭- (CH2) XD [ (CH2) nE] m (CH2) p-Qq-,其中l(wèi)、m 和 η 獨立地為 1-20，ρ 為 0-10，Q 為-Z- (CH2) XD [ (CH2) nG] m (CH2) p-，q為0-5的整數(shù)，每個D、每個 E 和每個 G 獨立選自-0-、-NR3-、-N (COR4) -,-PR5 (0)-和-P (OR6) (0)-， 其中R3、R4、R5和R6獨立代表氫或Cp6-烷基，Z 選自-C (0) NH-、-C (0) NHCH2-, -OC (0) NH_、-C (0) NHCH2CH2-, -C (0) CH2-, -C (0) CH =CH-、- (CH2) s-、-C (0) -、-C (0) 0-或-NHC (0)-，其中 s 為 0 或 1。在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中1為1或2，n和m獨立地 為 1-10，ρ 為 0-10。在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中D為-0-。在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中E為-0-。
在本發(fā)明的還一方面，親水接頭是-CH2O[ (CH2)2O]m(CH2)1A1-，其中 m 為 1-10，ρ 為 1-3，Q 為-Z-CH2O[(CH2) 20]m (CH2)p-, 其中Z如上定義。在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中q為1。在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中G為-0-。
在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中Z選自-C(0)NH-、-C(O) NHCH2-和-OC (0) NH-。在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中q為0。在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中1為2。在本發(fā)明的另一方面，接頭是如上定義的親水接頭，其中η為2。在本發(fā)明的一方面，使用了以化學部分使肽與白蛋白結(jié)合殘基間隔開的“親水接 頭”。在本發(fā)明的一方面，親水接頭是 -C (0) - (CH2)「0- [ (CH2CH2-O] m_ (CH2) p- [NHC (0) - (CH2) fO- [ (CH2) n_0] m- (CH2) p] 「NH-，其中l(wèi)、m、n和ρ獨立地為1-5，q為0-5。在本發(fā)明的還一方面，親水接頭是-C (0) -CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2 [NHC (0) -CH2-O-CH2CH2O-CH2CH2] ΓΝΗ_，其中 q 為 0-5。在本發(fā)明的還一方面，親水接頭是-C (0) -CH2-0-CH2CH2-0-CH2CH2-NHC (0) -CH2-0-CH2CH20-CH2CH2-NH- 在本發(fā)明的還一方面，親水接頭是-[CH2CH2O] m+1 (CH2)pQq-,其中m和ρ獨立地為0-10，和Q 為如上定義的-Z-(CH2) P [ (CH2)nG]m (CH2)p_。在本發(fā)明的還一方面，親水接頭是- (CH2) fO- [ (CH2) n-0] m- (CH2) p- [C (0) NH- (CH2) r0- [ (CH2) n_0] m- (CH2) p] q-,其中l(wèi)、m、n和ρ獨立地為1-5，q為0-5。在本發(fā)明的又一方面，接頭包含除Cys之外的氨基酸殘基，或二肽例如Gly-Lys。 本文所用的術語“二肽例如Gly-Lys”是指這樣的二肽其中C-端氨基酸殘基是Lys、His 或Trp，優(yōu)選Lys,并且N-端氨基酸殘基選自下列基團:Ala, Arg、Asp、Asn、G1V、Glu、Gin、 lie、Leu、Val、Phe 禾口 Pro。一方面，本發(fā)明的雜合肽用任何白蛋白結(jié)合物來酰化。又一方面，在雜合肽衍生物中僅一個賴氨酸殘基與白蛋白結(jié)合殘基連接，任選通 過接頭連接。一方面，本發(fā)明的雜合肽包含介于雜合肽與一個或多個白蛋白結(jié)合殘基之間的親 水間隔基。一方面，親水間隔基是在兩端具有合適官能團的無支鏈的低聚乙二醇部分，所述 官能團可形成雜合肽的氨基與白蛋白結(jié)合殘基的官能團之間的橋。已知一系列白蛋白結(jié)合殘基是含有4-40個碳原子并具有遠端酸性基團的直鏈和 支鏈的親脂部分。在本發(fā)明的一方面，白蛋白結(jié)合殘基是親脂殘基。又一方面，親脂殘基通過綴合化 學(conjugation chemistry)(例如通過烷基化、酰基化、酯形成或酰胺形成)，任選通過接 頭與賴氨酸殘基連接，或通過馬來酰亞胺偶聯(lián)與半胱氨酸殘基連接。在本發(fā)明的又一方面，白蛋白結(jié)合殘基在生理PH時帶負電荷。在本發(fā)明的另一方面，白蛋白結(jié)合殘基包含可帶負電荷的基團。一個優(yōu)選的可帶負電荷的基團是羧酸基團。在本發(fā)明的還一方面，白蛋白結(jié)合殘基選自直鏈烷基、支鏈烷基、具有ω-羧酸基 團的基團和部分或完全氫化環(huán)戊并菲(cyclopentanophenanthrene)骨架。在本發(fā)明的又一方面，白蛋白結(jié)合殘基是汽巴克隆基(cibacronyl)殘基。在本發(fā)明的又一方面，白蛋白結(jié)合殘基具有6-40個碳原子、8-26個碳原子或8_20 個碳原子。在本發(fā)明的又一方面，白蛋白結(jié)合殘基是選自CH3(CH2)XO-的酰基，其中r為 4-38 的整數(shù)，優(yōu)選為 4- 的整數(shù)，更優(yōu)選選自 CH3 (CH2) 6C0-、CH3(CH2)8CO-, CH3(CH2)10CO-, CH3 (CH2) 12C0-、CH3 (CH2) 14C0-, CH3 (CH2) 16C0-, CH3 (CH2) 18C0_、CH3 (CH2) 20CO_ 和 CH3 (CH2) ^CO-。在本發(fā)明的另一方面，白蛋白結(jié)合殘基是直鏈或支鏈烷烴α，ω-二羧酸的?；Ｔ诒景l(fā)明的一方面，至少一個氨基酸殘基是用A-B-C-D-衍生的，其中A-選自
權(quán)利要求
1.一種雜合肽衍生物，其中所述雜合肽包含人胰島淀粉樣多肽序列的C-末端、鮭魚降 鈣素肽序列的中間部分和人胰島淀粉樣多肽序列的N-末端，并且其中白蛋白結(jié)合部分與 所述雜合肽連接，任選通過接頭連接。
2.權(quán)利要求1的衍生物，所述衍生物是母體雜合肽(SEQID No 5)或類似雜合肽，其 中白蛋白結(jié)合部分與所述雜合肽連接，任選通過接頭連接。
3.權(quán)利要求2的衍生物，其中與所述母體雜合肽相比，所述類似雜合肽具有1-12個氨 基酸取代或者其中所述類似雜合肽選自胰島淀粉樣多肽(2-7)-[Argl 1，Argl8] sCT (8-27)-胰島淀粉樣多肽(33-37) (seq ID No 6)胰島淀粉樣多肽(1-8)-[Argl 1，Argl8] sCT (9-27)-胰島淀粉樣多肽(33-37) (seq ID No 7)胰島淀粉樣多肽(2-8)-[Argil, Argl8]sCT(9-27)-胰島淀粉樣多肽(33-37) (seq ID No 8)[Hisl]胰島淀粉樣多肽(l-8)-[Hisll, Hisl8, HisM] sCT(9-27)-胰島淀粉樣多肽 (33-37)(seq ID No 9)。
4.前述權(quán)利要求中任一項的衍生物，其中所述白蛋白結(jié)合部分與所述雜合肽的N-端 氨基酸和/或C-端氨基酸和/或與所述雜合肽內(nèi)部的一個或多個氨基酸連接。
5.前述權(quán)利要求中任一項的衍生物，其中所述衍生物包含連接在所述雜合肽N-端的 由1-12個額外氨基酸組成的N-端延伸，其中所述白蛋白結(jié)合部分與所述額外氨基酸的 N-端氨基酸連接，任選通過接頭連接。
6.前述權(quán)利要求中任一項的衍生物，其中與所述母體雜合肽相比，已添加0-8個額外 電荷。
7.前述權(quán)利要求中任一項的衍生物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基是親脂殘基。
8.前述權(quán)利要求中任一項的衍生物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基選自直鏈烷基、支鏈烷 基、具有ω-羧酸基團的基團和部分或完全氫化環(huán)戊并菲骨架。
9.前述權(quán)利要求中任一項的衍生物，其中所述白蛋白結(jié)合殘基任選通過接頭連接是通 過賴氨酸殘基的ε-氨基而連接。
10.包含權(quán)利要求1-9中任一項的衍生物和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。
11.用作藥物的權(quán)利要求1-9中任一項的衍生物。
12.用作藥物的權(quán)利要求1-9中任一項的衍生物，所述藥物用于治療或預防高血糖癥、 2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、肥胖癥、高血壓、X綜合征、血脂異常、認知障礙、 動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中風、炎癥性腸綜合征、消化不良和胃 潰瘍。
13.用作藥物的權(quán)利要求1-9中任一項的衍生物，所述藥物用于減少食物攝取、減少β 細胞凋亡、增加β細胞功能和β細胞量、和/或用于恢復β細胞的葡萄糖敏感性。
14.用于治療或預防以下疾病的方法，所述方法包括給予受治療者活性量的權(quán)利要求 1-9中任一項的衍生物高血糖癥、2型糖尿病、葡萄糖耐量減低、1型糖尿病、肥胖癥、高血 壓、X綜合征、血脂異常、認知障礙、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠心病和其它心血管疾病、中 風、炎癥性腸綜合征、消化不良和胃潰瘍。
15.用于減少食物攝取、減少β細胞凋亡、增加β細胞功能和β細胞量、和/或用于 恢復β細胞的葡萄糖敏感性的方法，所述方法包括給予受治療者活性量的權(quán)利要求1-9中 任一項的衍生物。
全文摘要
本發(fā)明描述了雜合肽衍生物和包含它們的藥物組合物，其中所述雜合肽包含人胰島淀粉樣多肽序列的C-末端、鮭魚降鈣素肽序列的中間部分和人胰島淀粉樣多肽序列的N-末端，并且其中白蛋白結(jié)合部分與所述雜合肽連接，任選通過接頭連接。
文檔編號C07K14/475GK102076353SQ200980125627
公開日2011年5月25日 申請日期2009年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月25日
發(fā)明者L·舍費爾, T·克魯澤 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司